Cilj je molekula s veznim mjestom za lijek. Ova molekula može sadržavati membranske proteine ​​koji prepoznaju hormone ili neurotransmitere (receptore), kao i ionske kanale, nukleinske kiseline, molekule nosači ili enzimi. Ali ne djeluju svi lijekovi na receptore.

Većina lijekova mora se vezati na molekularnu metu da bi proizvela učinak, ali postoje iznimke. Već u prvim istraživanjima djelovanja lijekova na životinjska tkiva krajem 19.st. postalo je jasno da se većina lijekova prodaje konkretno djelovanje u određenim tkivima, tj.

Lijek koji djeluje na jednu vrstu tkiva ne mora djelovati na drugu;
lijek može imati vrlo različite učinke na različita tkiva.

Na primjer, alkaloid pilokarpin, poput neurotransmitera acetilkolina, uzrokuje kontrakciju glatkih mišića crijeva i inhibira otkucaje srca. S obzirom na te fenomene, Samuel Langley (1852.-1925.) 1878. godine, na temelju proučavanja učinaka alkaloida pilokarpina i atropina na salivaciju, predložio je da "postoje određene receptorske tvari... s kojima oboje mogu tvoriti spojeve."

Kasnije, u 1905. godine., dok je proučavao učinke nikotina i kurarea na skeletne mišiće, otkrio je da nikotin uzrokuje kontrakcije kada se primijeni na određena mala područja mišića. Langley je zaključio da se "receptorska tvar" za nikotin nalazi na tim mjestima i da kurare djeluje tako da blokira interakciju nikotina s receptorom.

Vjeruje se da Paul Ehrlich(1854.-1915.) neovisno je razvio receptorsku teoriju promatrajući koliko organskih boja selektivno boji specifične stanične komponente. Godine 1885. predložio je da stanice imaju "bočne lance" ili "receptore" na koje se lijekovi ili toksini mogu vezati i proizvesti svoje učinke. Do danas, Ehrlich je poznat po svojoj ideji "čarobnog metka" - kemijski spoj, formiran za otkrivanje selektivne toksičnosti, na primjer, infektivnog agensa.

Osim, Ehrlicha sintetizirani organski derivati ​​arsena, koji su se prethodno koristili u liječenju. Razvijajući teoriju receptora, Ehrlich je prvi pokazao da brza reverzibilnost djelovanja alkaloida ukazuje na slabe (nekovalentne) kemijske veze između lijeka i receptora.

Najnoviji napredak u molekularnoj biologiji otkrivaju prirodu odnosa lijek-receptor na molekularnoj razini. Danas se pod receptorom podrazumijeva specifična molekularna struktura koja djeluje kao molekularna meta za skupinu odgovarajućih lijekova (prije se mjesto vezivanja nije definiralo odvojeno od molekularne mete, te se cijeli kompleks smatrao receptorom).

Za lijekovi djelujući na enzime, molekularna meta je enzim. Receptor je dio enzima koji se veže na lijek. Za većinu lijekova molekularne mete su proteini, ugljikohidrati, lipidi i druge makromolekule na koje lijekovi djeluju. Iz ove perspektive, molekularni ciljevi su preciznije definirani od ostalih receptora.

Danas receptori identificirati i karakterizirati metodama molekularne biologije. Učinke nekih vrsta lijekova lako je objasniti bez uključivanja ljudskih molekularnih ciljeva. Ove vrste lijekova uključuju antacide (pufere), koji smanjuju želučanu kiselinu, formativne laksative i kelirajuća sredstva. Postoje tvari čiji mehanizam djelovanja karakterizira nedostatak jasne kemijske specifičnosti. Glavni primjer su plinoviti i hlapljivi opći anestetici, uključujući inertni plin ksenon.

Za ove droge praktički je nemoguće identificirati vezno mjesto ili jednu molekularnu metu. Međutim, vjerojatno jesu farmakološki učinci nastaju zbog učinka na komponentu membrane (na primjer, naponski ili ligandski upravljani ionski kanali). Ova komponenta je molekularna meta za anestetike.

Za učinkovito funkcioniranje višestaničnog organizma nužna je precizno usklađena interakcija između različitih bioloških molekula, supramolekulskih i substaničnih struktura, stanica i organa koji predstavljaju funkcionalno jedinstveni cjeloviti sustav. Fiziološke funkcije organa, organskog sustava i tijela u cjelini ne mogu obavljati izolirane specijalizirane stanice, a još više subcelularne tvorevine. Jedna od ključnih faza u evoluciji živih bića bilo je stjecanje sposobnosti makromolekula za reverzibilne, specifične međumolekulske interakcije, što je dovelo do promjene njihove funkcionalne aktivnosti, što je u konačnici predodredilo regulaciju fizioloških procesa na razne razine organizacija biološkog sustava - molekularnog, supramolekularnog, subcelularnog, staničnog, organa i, konačno, u tijelu kao cjelini. Biokemijski procesi u stanicama višestaničnog organizma usklađeni su i ujedno primjereni mogućnostima pojedine stanice, njezinoj sposobnosti da sudjeluje u radu cijelog organizma. Ova priroda staničnog ponašanja u višestaničnom organizmu posljedica je sposobnosti stanica da uđu u međustanične, matriksno-stanične i humoralno-stanične interakcije regulirane i iz stanice i iz tijela preko specijaliziranih struktura peptidne prirode - receptora. Međustaničnim, matriksno-staničnim i humoralno-staničnim međudjelovanjem od stanica različitih fizioloških specijalizacija nastaje funkcionalno jedinstvena struktura tkiva, organa i organizma u cjelini, u kojima se provodi koordinirana regulacija metaboličke aktivnosti, omogućujući im da obavljaju fiziološke funkcije svojstvene organu/organskom sustavu.

Strukture citoplazmatske membrane višestaničnog organizma tijekom evolucije nastale su na temelju već postojećih unutarstaničnih struktura peptidne prirode 1 . Modifikacija odgovarajućih gena i evolucijska selekcija osigurali su i očuvanje određenih domena proteinske molekule, nazvanih evolucijski konzervativnim, i pridonijeli nastanku novih dizajniranih za obavljanje specijaliziranih funkcija. Prisutnost evolucijski očuvanih domena u molekule peptidne prirode za različite funkcionalne svrhe značajan je, između ostalog, za regulaciju njihove funkcionalne aktivnosti prema zajedničkim načelima, zajedničkim utjecajima.

Domene molekule peptidne prirode, obogaćeni sumpornim ostacima u sastavu cisteina, pripadaju evolucijski konzervativnim komponentama molekularne strukture. Cisteinom obogaćene evolucijski očuvane domene nalaze se u sastavu izvanstaničnog i unutarstaničnog transporta, regulatornog, senzornog, egzekutivnog, strukturnog i drugih, prema njihovoj funkcionalnoj namjeni, molekule peptidne prirode

Receptorske tirozin kinaze imaju evolucijski očuvanu izvanstaničnu domenu obogaćenu cisteinskim ostacima. Sulfhidrilne skupine cisteinski ostaci u staničnoj površinskoj domeni receptora osjetljivi su na djelovanje oksidacijskih reagensa, što dovodi do stvaranja intramolekularnih i intermolekularnih disulfidne poprečne veze (veze), mijenjanje funkcionalnog statusa stanične površinske domene (na primjer, povećanje tropizma i/ili specifičnosti za agonist ili agoniste) i/ili pokretanje aktivnosti receptorske tirozin kinaze 2.

Ostaci sumpora u sastavu cisteinskih evolucijski očuvanih domena molekule peptidne prirode jedna su od najvažnijih točaka primjene čimbenika koji utječu na konformaciju molekule peptidne prirode 3 4 .

Mogućnost reverzibilnih, reguliranih promjena u konformaciji izvanstaničnih i unutarstaničnih molekule peptidne prirode(uključujući receptore, membranske transportere, ionske kanale, enzime i druge specijalizirane molekule peptidne prirode), povezana s njihovom sposobnošću izvođenja fiziološke funkcije, učinio je konformacijske preraspodjele na razini tercijarnih i kvartarnih struktura jednim od učinkovitih univerzalnih mehanizama utjecaja na aktivnost razne bjelančevine, uključujući molekule odgovorne za međustanične, matriks-stanične, humoralno-stanične interakcije, izmjenu iona i supstrata, organizaciju stanične strukture i njezinu metaboličku aktivnost 5 6 7

Regulacijski učinci na ostatke sumpora u cisteinu evolucijski očuvanih strukturnih i funkcionalnih domena molekule peptidne prirode izvanstanični i unutarstanični prostor određeni su, između ostalog, redoks okolišem. Redoks okolina odražava razinu omjera interkonvertibilnih oksidiranih i reduciranih specifičnih redoks parova. Redoks okolina koju tvore međusobno povezani redoks parovi u biološkim tekućinama izvanstaničnog prostora, citosola i staničnih organela određena je zbrajanjem redukcijskog potencijala u njima i redukcijskog kapaciteta tih redoks parova.

Redukcijski ekvivalenti prevladavaju iu unutarstaničnom prostoru i izvan stanice, ali je vrijednost njihovog omjera prema oksidirajućim oblicima izvan stanice i u nizu organela nešto niža od unutarstanične vrijednosti u citosolu. Kao rezultat toga, okolina koja okružuje stanice i okolina brojnih unutarstaničnih organela karakterizirana je većim oksidacijskim kapacitetom u usporedbi s citosolom 8 9 10

Funkcionalno aktivne konformacije molekula u unutarstaničnom i izvanstaničnom prostoru prilagođene su evolucijski utvrđenim značajkama redoks uvjeta. Kao što je gore navedeno, ostaci sumpora u sastavu cisteina imaju strukturne i regulatorne molekule peptidne prirode jedna su od najvažnijih točaka primjene efektorskih molekula koje provode redoks modulaciju. Cistein je koncentriran u evolucijski očuvanim domenama strukturnih i funkcionalnih molekula peptidne prirode. Cisteinski ostaci evolucijski očuvanih regulatornih, strukturnih, katalitičkih domena molekule peptidne prirode, čija redoks modulacija sumporne veze dovodi do promjene u konformaciji i/ili funkcionalnoj aktivnosti, nazivaju se "vrući cisteini". Sulfhidrilne skupine cisteina sudjeluju u većini reakcija u obliku merkaptidnog iona RS?. Merkaptidni ioni proteina su reaktivniji i lakše podložni oksidaciji nego nedisocirane sulfhidrilne skupine. Vrijednost pKa (konstanta ionizacije) SH skupina proteina uvelike varira i uvelike je određena njihovom interakcijom sa susjednim funkcionalnim skupinama u molekuli. Prisutnost pozitivno nabijene skupine u neposrednoj blizini SH skupine smanjuje njezinu konstantu ionizacije. Vrijednost pKa većine SH skupina u aktivnim mjestima enzima je približno 8,5 11 12. Stoga, pri fiziološkom pH u staničnom mikrookruženju i stanici (~7,4), postojeće sulfhidrilne skupine većine molekule peptidne prirode ostaju neionizirani zbog visoka vrijednost pK a, pa su otporni na oksidaciju. “Vrući cisteini” evolucijski očuvanih domena okruženi su obližnjim pozitivno nabijenim skupinama, zbog čega se njihov pK a kreće od 4,7 do 5,4. Stoga je sulfhidrilna skupina u njihovom sastavu ionizirana čak i pri fiziološkom pH i lako je podložna oksidativnoj modifikaciji. Funkcionalno aktivna konformacija većine intracelularnog molekule peptidne prirode nastaje pri redukciji sumpornih ostataka u sastavu “vrućih cisteina” na sulfhidrilne skupine 13 14 15 16. Naprotiv, funkcionalno aktivna konformacija većine izvanstaničnih molekule peptidne prirode nastaje tijekom stvaranja disulfidne veze između sumpornih ostataka “vrućih cisteina” 17 18 19 20.

Reducirani (GSH) i oksidirani glutation (GSSG) predstavljaju jedan od glavnih biokemijskih parova bioloških prostora čija vrijednost omjera (GSH/GSSG) određuje vrijednost redoks potencijala odgovarajućeg fiziološkog prostora 21 22 . Fiziološki potrebnu vrijednost omjera GSH/GSSG reguliraju i formiraju odgovarajući biokemijski sustavi, prate molekularni redoks senzori u strukturi staničnih površinskih receptora, ionskih kanala, bioregulatora, enzima, citoplazmatskih membranskih transportera i dr. molekule peptidne prirode unutarstanični i izvanstanični prostor 23 24. Posljedica reakcije molekularnog redoks senzora na promjenu vrijednosti redoks potencijala je stvaranje regulacijskog signala koji utječe na biokemijske procese ili proces, staničnu reakciju ili reakcije 25 26, određujući, s jedne strane, stanični odgovor, a s druge strane, uspostavljanje fiziološki odgovarajuće vrijednosti redoks potencijala. U tom smislu, čimbenici koji utječu na omjer između reduciranog i oksidiranog glutationa (reaktivne vrste kisika 27, reaktivne vrste dušika 28 29 30, ugljikov monoksid 31, organski peroksidi 32) mogu modulirati biokemijske procese i stanične reakcije mijenjajući vrijednost redoks potencijal i omjer reduciranog/oksidiranog glutationa u sustavu.

Slike 2 i 3 na primjeru bioregulatora i njihovih receptora ilustriraju princip molekularnog mehanizma sudjelovanja sulfhidrilnih skupina evolucijski očuvanih domena koje sadrže cistein, reduciranog (GSH) i oksidiranog (GSSG) glutationa u kontroli funkcionalne aktivnosti molekule peptidne prirode izvanstanični prostor.

sl.2. Utjecaj uz sudjelovanje reduciranog glutationa (GSH) na disulfidne poprečne veze (veze) u strukturi funkcionalno aktivnih izvanstaničnih i/ili njihovih staničnih površinskih receptora dovodi do stvaranja skupa molekula čija konformacija ograničava njihove fiziološki primjerene interakcije.

sl.3. Utjecaj na sulfhidrilne (SH) skupine u strukturi funkcionalno neaktivnih izvanstaničnih stanica bioregulatori peptidne prirode i/ili njihovih staničnih površinskih receptora, uzrokovano smanjenjem redoks potencijala zbog povećanja količine oksidiranog glutationa (GSSG), dovodi do stvaranja skupa molekula čija je konformacija primjerena prirodi situacijski određenih fizioloških interakcije.

Treba napomenuti da su reaktivne vrste kisika, reaktivne vrste dušika i organski peroksidi sposobni izravno provesti oksidativnu modifikaciju sulfhidrilnih skupina u sulfenate. Međutim, fiziološka priroda takvog učinka bit će ostvarena ako se nakon stvaranja sulfenata uz sudjelovanje GSH formira miješani disulfid s glutationom (reakcija glutationilacije), a zatim se provede uređeni enzimski proces kako bi se formirao točan disulfid umrežiti ili smanjiti ostatke sumpora u sastavu cisteina 33. U protivnom može doći do nepovratne oksidacije ostatka sumpora u cisteinu u cistin sulfonsku kiselinu (Cys-SO 3 H) i, kao rezultat toga, gubitka sposobnosti regulacije funkcije proteina.

yatii:

1. 
   Nositelji genetske informacije u mikroorganizmima.
2. 
   Oblici manifestacije varijabilnosti mikroorganizama. Izmjene. Mutacije, njihova klasifikacija. R-S disocijacija. Praktični značaj varijabilnosti mikroorganizama.
3. 
   Mutageni, podjela, mehanizam djelovanja mutagena na genom mikroorganizama.
4. 
   Uloga citoplazmatskih genetskih struktura u varijabilnosti mikroorganizama.
5. 
   Genetske rekombinacije.
6. 
   Transformacija, faze procesa transformacije.
7. 
   Transdukcija, specifična i nespecifična transdukcija.
8. 
   Konjugacija, faze procesa konjugacije.

1. U testnim zadatcima naznačite točne odgovore.

1. Pregled i skiciranje demonstracijskih priprema:

A) R-S disocijacija bakterije.

Kontrolna pitanja:

1. 
   Što je materijalna osnova nasljeđivanja mikroorganizama?
2. 
   Koji oblici manifestacije varijabilnosti mikroorganizama postoje?

1. 
   Koji je praktični značaj mikrobne varijabilnosti?
2. 
   Što su izmjene?
3. 
   Što su mutacije?
4. 
   Koja je klasifikacija mutacija?
5. 
   Što su mutageni?
6. 
   Kakav je mehanizam djelovanja mutagena na genom mikroorganizama?

1. 
   Koja je uloga citoplazmatskih genetskih struktura u varijabilnosti mikroorganizama?
2. 
   Što su genetske rekombinacije?
3. 
   Što je transformacija? Koje su faze u ovom procesu?
4. 
   Što je transdukcija?
5. 
   Što je konjugacija? Koje su faze u ovom procesu?

TEST ZADANIJA

Navedite točne odgovore ety:

1. Što su izvankromosomske genetske strukture?

A) ribosomi

B) polisomi

B) plazmidi

D) mezosomi

D) transpozoni

2. Što su mutageni?

A) geni koji osiguravaju mutaciju

B) čimbenici koji uzrokuju mutaciju

B) čimbenici koji prenose genetske informacije

D) Čimbenici popravka DNA

3. Što je egzon?

A) virulentni bakteriofag

B) profage

B) dio gena koji nosi određenu genetsku informaciju

D) umjereni bakteriofag

4. Što je inverzija?

A) metoda genetske rekombinacije

B) korekcija oštećenih dijelova DNA

B) kromosomska mutacija

D) točkasta mutacija

5. Što je modifikacija?

B) fenotipske promjene koje ne zahvaćaju genom stanice

B) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

D) nasljedna nagla promjena svojstva

6. Konjugaciju karakteriziraju:

A) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

B) potreban je kontakt između stanica donora i primatelja

B) prijenos genetskog materijala pomoću RNA

D) prijenos genetskog materijala spolnim putem

7. Što je reparacija?

A) lizogenija

B) popravak oštećene DNA

C) način prijenosa genetske informacije

D) viropeksija

8. Što karakterizira "minus" lanac RNK?

A) ima infektivnu aktivnost

B) ima nasljednu funkciju

B) može se integrirati u kromosom stanice

D) nema funkciju glasničke RNK

9. Kod kojih je mikroorganizama RNK materijalna osnova nasljeđa?

A) kod bakterija

B) kod spiroheta

D) u mikoplazmi

10. Što su mutacije?

A) ispravak oštećenih dijelova DNA

B) prijenos genetskog materijala pomoću bakteriofaga

B) nasljedna nagla promjena svojstva

D) proces stvaranja bakterijskog potomstva koje sadrži karakteristike davatelja i primatelja

11. Što je transformacija?

A) popravak oštećene DNK

B) prijenos genetske informacije nakon kontakta bakterijskih stanica različite "seksualne" orijentacije

C) prijenos genetske informacije pomoću fragmenta DNA

D) prijenos genetske informacije od stanice donora do stanice primatelja pomoću bakteriofaga

INFORMACIJA MATERIAL NA TEMU NASTAVE

Uprizorenje iskustva transformacije

Primatelj - procijediti Bacil subtilis Str (bacillus subtilis, osjetljiv na streptomicin); donor - DNA izolirana iz soja U.Subtilis Str (otporan na streptomicin). Selektivni medij za odabir rekombinanata (transformanata) hranjivi agar koji sadrži 100 U/ml streptomicina.

Na 1 ml bujonske kulture U.Subtilis dodajte 1 µg/ml otopine DNaze u 0,5 ml otopine magnezijevog klorida kako biste uništili DNK koja nije prodrla u bakterijske stanice soja primatelja i inkubirajte 5 minuta. Za određivanje broja nastalih rekombinanata (transformanata) rezistentnih na streptomicin, 0,1 ml nerazrijeđene smjese se posije na selektivnu podlogu u Petrijevu zdjelicu. Za određivanje broja stanica primateljske kulture u izotoničnoj otopini natrijevog klorida, pripremite 10-struka razrjeđenja do 10 -5 -10 -6 (kako biste dobili izbrojiv broj kolonija), inokulirajte 0,1 ml na hranjivi agar bez streptomicina, a za kontrolu – na agaru sa streptomicinom. Kultura primatelja ne bi trebala rasti na potonjem mediju jer je osjetljiva na streptomicin. Inokulacija se inkubira na 37 0 C. Sljedeći dan se uzimaju u obzir rezultati pokusa i određuje učestalost transformacije omjerom broja uzgojenih rekombinantnih stanica i broja stanica soja primatelja.

Pretpostavimo da kada se posije 0,1 ml kulture primajućeg soja u razrjeđenju od 10 -5, izraste 170 kolonija, a kada se posije 0,1 ml nerazrijeđene smjese, izraste 68 kolonija rekombinantnog soja. Budući da je svaka kolonija nastala kao rezultat razmnožavanja samo jedne bakterijske stanice, 0,1 ml inokulirane primateljske kulture sadrži 170 x 10 5 živih stanica, a 1 ml - 170 x 10 6, odnosno 1,7 x 10 8. U isto vrijeme, 0,1 ml smjese sadrži 68 rekombinantnih stanica, a 1 ml - 680, ili 6,8 x 10 2.

Stoga će učestalost transformacije u ovom eksperimentu biti jednaka:

Postavljanje specifičnog eksperimenta transdukcije

Primatelj je soj E. coli lac-, kojemu nedostaje operon 3-galaktozidaze koji kontrolira fermentaciju laktoze. Transducirajući fag je fag X dgal u čijem su genomu neki od gena zamijenjeni (operonom 3-galaktozidaze E. coli. Defektan je, tj. nije sposoban izazvati produktivnu infekciju koja završava u lizu Escherichie coli, a označava se slovom d (fag dgal ) uz naziv gal operona sadržanog u genomu Selektivna podloga - Endo podloga, na kojoj laktoza-negativne bakterije soja primatelja stvaraju bezbojne kolonije, a laktoza -pozitivne kolonije rekombinantnog soja poprimaju crvenu boju s metalnom nijansom.U 1 ml 3-satne bujonske kulture soja primatelja dodajte 1 ml transducirajućeg faga dgal u koncentraciji od 10 6 - 10 7 čestica po 1 ml Smjesa se inkubira 60 minuta na 37 0 C, nakon čega se priprema serija 10-strukih razrjeđenja (ovisno o očekivanoj koncentraciji bakterija) kako bi se dobio izbrojiv broj kolonija. epruvete s razrjeđenjem od 10 -6 , inokulirajte 0,1 ml kulture u 3 Petrijeve zdjelice s Endo medijem i ravnomjerno rasporedite tekućinu lopaticom po površini medija.

Usjevi se inkubiraju 1 dan, nakon čega se bilježe rezultati pokusa i izračunava se učestalost transdukcije omjerom broja rekombinantnih stanica (transduktanata) pronađenih na svim posudama prema broju stanica soja primatelja.

Na primjer, nakon sijanja 0,1 ml miješane kulture u razrjeđenju od 10 -6 na 3 čaše s Endo medijem, izraslo je 138, 170 i 160 bezbojnih kolonija soja primatelja, redom, na prvoj i posljednjoj čašici - 5 i 1 kolonija crvenih transduktanata. Stoga će frekvencija transdukcije u ovom slučaju biti jednaka:

Postavljanje pokusa konjugacije u svrhu prijenosa fragmenta kromosoma, katkoji sadrži genleu, koji kontrolira sintezu leucina.

Donator - soj E.coli K12 Hfr leu str S ; primatelj – soj E.Coli K12 F - leu+ Str R . Hfr je oznaka za stanje koje karakterizira visoka frekvencija rekombinacije. Selektivna podloga za izolaciju rekombinanata - minimalna glukozno-solna podloga: KH 2 PO 4 - 6,5 g, MgSO 4 - 0,1 g, (NH 4)2SO 4 - 1 g, Ca(NO 3)2 - 0,001 g, FeSO 4 - 0,0005 g, glukoza - 2 g, streptomicin - 200 U/ml, destilirana voda - 1 l.

Dodajte 1 ml bujonske kulture donora u 2 ml 3-satne kulture primatelja. Usjevi su inkubirani na 37°C 30 minuta. Zatim se smjesa razrijedi na 10 -2 -10 3 i 0,1 ml se nasadi na selektivnu agarnu podlogu u Petrijevim zdjelicama, na kojoj će rasti samo rekombinantne kolonije. Kao kontrola, sojevi donora i primatelja posijani su na istu podlogu, na njoj neće rasti, jer je prvi soj osjetljiv na streptomicin, a drugi je auksotrofan na leucin. Uz to se kultura soja donora sije na selektivnu podlogu bez streptomicina, a kultura soja primatelja sije se na potpunu podlogu (hranjivi agar) s antibioticima radi određivanja broja živih stanica. Usjevi su inkubirani na 37 0 C do sljedećeg dana. Nakon brojanja izraslih kolonija, učestalost rekombinacija određuje se omjerom broja rekombinantnih stanica i stanica primatelja.

Na primjer, nakon sjetve 0,1 ml mješavine kultura davatelja i primatelja u razrjeđenju od 10 -2, izraslo je 150 kolonija rekombinanata, a nakon sjetve 0,1 ml kulture primatelja iz razrjeđenja od 10 -6, naraslo je 75 kolonija. Stoga će frekvencija rekombinacije biti jednaka:

EDUKATIVNO ISTRAŽIVAČKI RAD br.7

Tema: Bakteriološka metoda dijagnosticiranjaagnostici

zarazne bolesti. Ishrana bakterija. Principi uzgoja mikroorganizama. Hranjivi mediji. Metode sterilizacije

Cilj učenja: Ovladati bakteriološkom metodom dijagnostike zaraznih bolesti. Proučiti vrste bakterijske ishrane, principe uzgoja mikroorganizama, klasifikaciju podloga za kulture i metode sterilizacije.

Potrebna početna razina znanja: Fiziologija mikroorganizama.

Praktična znanja i vještine koje student treba steći u nastavi:

Znati	Biti u mogućnosti
1. Bakteriološka metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, njezina svrha i stadiji	1. Pripremite medije kulture
2. Vrste bakterijske ishrane	2. Procijeniti učinkovitost sterilizacije i dezinfekcije
3. Principi uzgoja mikroorganizama
4. Hranjive podloge, zahtjevi za hranjive podloge
5. Klasifikacija podloga za kulturu, sastav i priprema
6. Metode sterilizacije
7. Mehanizam djelovanja sterilizirajućih čimbenika na molekularnu strukturu mikroorganizama
8. Razlike između pojmova kontaminacije i dekontaminacije, dezinfekcije i sterilizacije, asepse i antiseptike
9. Klasifikacija alata, uređaja, metoda obrade i vrsta utjecaja
10. Suvremene tehnologije i oprema za sterilizaciju
11. Metode praćenja učinkovitosti sterilizacije i dezinfekcije

Pitanja koja se razmatraju tijekom ispitayatii:

1. 
   Bakteriološka metoda za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, njezina svrha i stadiji.
2. 
   Vrste bakterijske ishrane.
3. 
   Principi uzgoja mikroorganizama.

1. 
   Hranjive podloge; zahtjevi za hranjive medije.
2. 
   Podjela hranjivih podloga, njihov sastav i priprema.
3. 
   Metode sterilizacije: fizikalne, kemijske, biološke i mehaničke.
4. 
   Mikrob kao predmet sterilizacije i dezinfekcije. Povezanost sa strukturom mikrobne stanice. Glavne mete molekularne strukture mikroorganizama pod utjecajem sterilizacije i dezinfekcije.
5. 
   Razlike između pojmova kontaminacije i dekontaminacije, dezinfekcije i sterilizacije, asepse i antiseptike.
6. 
   Klasifikacija instrumenata, uređaja, metoda obrade i vrsta izloženosti za sterilizaciju i dezinfekciju.

1. 
   Suvremene tehnologije i oprema za sterilizaciju.
2. 
   Metode praćenja učinkovitosti sterilizacije i dezinfekcije.

Samostalni rad studenata:

1. Pokus za određivanje učinka visoke temperature (80°C) na stvaranje spora (antracoid) i asporogeni ( coli i staphylococcus) mikroorganizama.

Učitelj objašnjava iskustvo:

A) na svakoj tablici daje se suspenzija stafilokoka, E. coli i spore bacila (antracoid);

B) svaka se suspenzija inokulira na kosi agar prije zagrijavanja;

C) suspenzije koje se proučavaju postavljene su na vodena kupka na temperaturi od 80 0 C 20 minuta;

D) svaka se suspenzija inokulira na kosi agar nakon zagrijavanja;

D) popunjava se protokol na sljedećem obrascu:

Vegetativni oblici patogeni mikroorganizmi ugibaju na 50-60 0 C 30 minuta, a na temperaturi od 70 0 C 5-10 minuta. Bakterijske spore su otpornije na visoke temperature, što se objašnjava njihovim sadržajem vode u vezano stanje, visok sadržaj kalcijeve soli, lipidi i gustoća, višeslojna ljuska. Posljedično, stafilokok i E. coli umiru nakon zagrijavanja, ali antrakoidne spore preživljavaju. To se mora uzeti u obzir pri ocjeni rezultata sjetve.

2. Sami popunite tablicu:

№	Metoda sterilizacije	Aparat	Pouzdanost	Materijal za sterilizaciju
1.	Sterilizacija u vatri
2.	Plazma Sterilizacija
3.	Suha toplina
4.	Para pod pritiskom
5.	Tekuća para
6.	Tindalizacija
7.	Filtriranje
8.	Fizički faktori (UVL, gama zrake, ultrazvuk)
9.	Sterilizacija plinom
10.	Pasterizacija

3. U testnim zadatcima naznačite točne odgovore.

Praktičan rad studenata:

1. Pregled demonstracijskih pripravaka i uređaja:

A) hranjivi mediji (MPB, MPA, krvni agar, serumski agar, Hissov medij, Endo medij, Ploskirev medij);

B) Pasterova pećnica, autoklav.

Testovi uankete:

1. 
   Koji su ciljevi i faze bakteriološke metode dijagnostike zaraznih bolesti?
2. 
   Što je bakterijska ishrana?
3. 
   Koje vrste bakterijske ishrane postoje?
4. 
   Koji su principi uzgoja mikroorganizama?
5. 
   Što su kulturni mediji?
6. 
   Koji su zahtjevi za hranjive podloge?
7. 
   Koja je klasifikacija hranjivih podloga?
8. 
   Kako se pripremaju kulturni mediji?
9. 
   Što je sterilizacija?
10. 
    Koje metode sterilizacije postoje?
11. 
    Koja je razlika između pojmova kontaminacije i dekontaminacije, dezinfekcije i sterilizacije, asepse i antiseptike?
12. 
    Na koje stanične strukture mikroorganizama utječu čimbenici sterilizacije i dezinfekcije?
13. 
    Koja je klasifikacija instrumenata, uređaja, metoda obrade i vrsta izloženosti za sterilizaciju i dezinfekciju?
14. 
    Koje su poznate? moderne tehnologije sterilizacija i oprema?
15. 
    Koje metode se koriste za praćenje učinkovitosti sterilizacije i dezinfekcije?

TESTNI ZADACI

Molimo navedite točne odgovore:

1. Koje su hranjive podloge jednostavne?

A) Endo srednje

B) krvni agar

D) peptonska voda

2. Što je sterilizacija?

A) Potpuna sterilizacija predmeta od svih vrsta mikroba i njihovih spora

B) uništavanje patogenih mikroorganizama

C) uništavanje vegetativnih oblika mikroorganizama

D) sprječavanje ulaska mikroorganizama u ranu

D) uništavanje specifičnih vrsta mikroba na mjestima

3. Koji se faktori koriste u autoklaviranju?

Temperatura

B) filtri

D) pritisak

4. Koji se faktori koriste u Pasteur peći?

A) pritisak

B) suha toplina

D) antibiotici

5. Hranjive podloge prema namjeni dijele se na:

Jednostavan

B) izborni

B) tekućina

D) diferencijalna dijagnostika

D) prijevoz

6. S obzirom na čimbenike rasta mikroorganizme dijelimo na:

A) autotrofi

B) heterotrofi

B) auksotrofi

D) litotrofi

D) prototrofi

E) organotrofi

7. Optimalna temperatura za uzgoj većine patogenih mikroorganizama je:

8. K fizikalne metode Sterilizacije uključuju:

A) ultrazvuk

B) ultraljubičaste zrake

B) antibiotici

D) filtriranje

D) sterilizacija parom

E) sterilizacija suhom toplinom

9. Na rast bakterija utječu sljedeći uvjeti uzgoja:

B) pH okoline

B) temperatura

D) vlažnost okoline

D) faktori rasta

E) svi odgovori su netočni

10. Gustoća hranjivih podloga ovisi o sadržaju u njima:

A) natrijev klorid

B) pepton

B) agar-agar

D) saharoza

D) krvni serum

11. Mikrobi koji koriste izvore anorganskog ugljika i redoks reakcije za proizvodnju energije nazivaju se:

A) kemoorganotrofi

B) fotoorganotrofi

B) kemolitotrofi

D) kemoautotrofi

D) kemoauksotrofi

12. Navedite metode sterilizacije kojima se predmet oslobađa od spornih oblika mikroba:

A) ultraljubičasto zračenje

B) autoklaviranje

B) pasterizacija

D) suha toplina

D) gama zračenje

13. Stavite u ispravan slijed Postupci za obradu laboratorijskih instrumenata:

A) predsterilizacijsko čišćenjesterilizacija

B) predsterilizacijsko čišćenje, sterilizacijadezinfekcija

C) predsterilizacijsko čišćenjedezinfekcija-sterilizacija

D) dezinfekcijapredsterilizacijsko čišćenjesterilizacija

14. Skup mjera usmjerenih na uništavanje patogenih mikroorganizama naziva se:

A) asepsa

B) antiseptik

B) dezinfekcija

D) sterilizacija

D) tindalizacija

INFORMATIVNI MATERIJAL O TEMI LEKCIJE

Mikrobiološki pregled provodi se s ciljem izolacije čistih kultura mikroorganizama, njihovog uzgoja i proučavanja njihovih svojstava. Neophodno je u dijagnostici zaraznih bolesti, odrediti vrstu mikroba, u istraživački rad, za dobivanje otpadnih produkata mikroba (toksina, antibiotika, cjepiva itd.). Za uzgoj mikroorganizama u umjetnim uvjetima potrebni su posebni supstrati - hranjivi mediji. Oni su osnova mikrobiološkog rada i određuju rezultate cjelokupne studije. Okruženja moraju stvarati optimalni uvjeti za život mikroba.

ZAHTJEVI, PRIJEIZLAZI SRIJEDOM:

1. 
   Mora biti hranjiv, tj. sadržavati u lako probavljivom obliku sve tvari potrebne za zadovoljenje prehrambenih i energetskih potreba mikroorganizama.
2. 
   Imaju optimalnu koncentraciju vodikovih iona.
3. 
   Budite izotonični za mikrobnu stanicu.
4. 
   Budite sterilni.
5. 
   Budi mokar.
6. 
   Imaju određeni redoks potencijal.
7. 
   Budite što je moguće jedinstveniji.

Trebam unutra hranjivim tvarima i svojstva okoline različiti tipovi mikroorganizmi nisu isti. Time se eliminira mogućnost stvaranja univerzalnog okruženja. Osim toga, na odabir određenog okruženja utječu i ciljevi studija.

Skupina klasifikacije	Klasa	Primjeri
Po sastavu	Jednostavan	Tekućina - MPB, peptonska voda Plotny - MPA
	Kompleks	Tekućina - šećerni bikyon Dense - šećerni agar, krvni agar
Po porijeklu nuyu	Prirodno	Mlijeko, usireno mlijekoorotka, komad sirovog krumpira
	Umjetna	Mliječna sol agar Cserum agar Ascites agar Krvni agar
	sintetička	Wednesday Needle, Wednesday 199
Po dogovoru nuyu	Izborno (izborno) -za stafilokoke: -za gram(-) koke i difteroidi: - za enterobakterije: -za vibrio cholerae: -za laktobacile i gljivice	Mliječno-slani agar, žuto-slani agar Serumske podloge Podloge sa solima telura Podloge sa žučnim solima Peptonska juha i višelokalni agar Agar od rajčice, rižin agar, Sabouraud agar
Po dosljednosti nacije	Diferencijalna dijagnostika Univerzalni Mediji za obogaćivanje konzerviram cije Tekućina Polutekuće Gusta	Endo, Ploskirev, Levin, Ressel, Gissa MPB, MPA, krvni agar Muellerova okolina Medij s glicerolom MPB, peptonska voda, šećer MPB Želatina, želatinanovi MPA, krvni agar

Glavni zadatak farmakodinamike je otkriti gdje i kako lijekovi djeluju, uzrokujući određene učinke. Zahvaljujući usavršavanju metodoloških tehnika, ova se pitanja rješavaju ne samo na sistemskoj i organskoj razini, već i na staničnoj, substaničnoj, molekularnoj i submolekularnoj razini. Da, za neurotropni lijekovi uspostaviti te strukture živčani sustav, čijih sinaptičkih tvorevina ima najviše visoka osjetljivost na ove veze. Za tvari koje utječu na metabolizam određuje se lokalizacija enzima u različitim tkivima, stanicama i subcelularnim tvorbama, čija se aktivnost posebno značajno mijenja. U svim slučajevima, govorimo o onim biološkim "ciljanim" supstratima s kojima lijek stupa u interakciju.

"Mete" za drogu

Kao "mete" za lijekovi služe kao receptori, ionski kanali, enzimi, transportni sustavi i geni.

Receptori su aktivne skupine makromolekula supstrata s kojima tvar stupa u interakciju. Pozivaju se receptori koji osiguravaju manifestaciju djelovanja tvari specifično.

Razlikuju se sljedeća 4 tipa receptora (sl.

I. Receptori koji izravno kontroliraju funkciju ionskih kanala. Ova vrsta receptora izravno povezanih s ionskim kanalima uključuje n-kolinergičke receptore, GABAA receptore i glutamatne receptore.

II. Receptori povezani s efektorom kroz sustav "G-proteini-sekundarni prijenosnici" ili "G-proteini-ionski kanali". Takvi receptori su dostupni za mnoge hormone i medijatore (m-kolinergički receptori, adrenergički receptori).

III. Receptori koji izravno kontroliraju funkciju efektorskog enzima. Oni su izravno povezani s tirozin kinazom i reguliraju fosforilaciju proteina. Receptori za inzulin i brojne čimbenike rasta dizajnirani su prema ovom principu.

IV. Receptori koji kontroliraju transkripciju DNA. Za razliku od membranskih receptora tipa I-III, to su intracelularni receptori (topivi citosolni ili nuklearni proteini). Steroidni hormoni i hormoni štitnjače stupaju u interakciju s takvim receptorima.

Kada se razmatra učinak tvari na postsinaptičke receptore, treba napomenuti mogućnost alosteričkog vezanja tvari endogenog (na primjer, glicin) i egzogenog (na primjer, benzodiazepinski anksiolitici) podrijetla. Alosterična interakcija s receptorom ne proizvodi "signal". Međutim, postoji modulacija učinka glavnog posrednika, koja se može pojačati ili oslabiti. Stvaranje tvari ove vrste otvara nove mogućnosti za regulaciju funkcija središnjeg živčanog sustava. Značajka alosteričnih neuromodulatora je da nemaju izravan učinak na prijenos glavnog neurotransmitera, već ga samo modificiraju u željenom smjeru.

Otkriće presinaptičkih receptora odigralo je važnu ulogu u razumijevanju mehanizama regulacije sinaptičkog prijenosa. Proučavani su putovi homotropne autoregulacije (učinak otpuštajućeg medijatora na presinaptičke receptore istog živčani završetak) i heterotropna regulacija (presinaptička regulacija zbog drugog medijatora) otpuštanja medijatora, što je omogućilo preispitivanje značajki djelovanja mnogih tvari. Ovi podaci poslužili su i kao temelj za ciljanu potragu za nizom lijekova (primjerice, prazosin).

Afinitet tvari prema receptoru, koji dovodi do stvaranja kompleksa "tvar-receptor" s njim, označava se izrazom "afinitet". Sposobnost tvari, kada je u interakciji s receptorom, da ga stimulira i izazove jedan ili drugi učinak naziva se unutarnja aktivnost.

Predavanje 3. Osnovna pitanja farmakodinamike

Lokalni i resorptivni učinci lijekova

Djelovanje tvari koje se javlja na mjestu primjene naziva se lokalno. Na primjer, sredstva za omotavanje oblažu sluznicu, sprječavajući iritaciju aferentnih živčanih završetaka. Međutim, istina je lokalno djelovanje opaža se vrlo rijetko, budući da se tvari mogu ili djelomično apsorbirati ili imati refleksni učinak.

Djelovanje tvari koja se razvija nakon njezine apsorpcije i ulaska u opći krvotok, a zatim u tkiva, naziva se resorptivnim. Resorptivni učinak ovisi o načinu primjene lijeka i njegovoj sposobnosti prodiranja bioloških barijera.

Uz lokalno i resorptivno djelovanje, lijekovi imaju izravni ili refleksni učinak. Izravni učinak se ostvaruje na mjestu izravnog kontakta tvari s tkivom. Tijekom refleksnog djelovanja tvari utječu na ekstero- ili interoreceptore, pa se učinak očituje promjenom stanja ili odgovarajućih živčanih centara ili izvršna tijela. Dakle, uporaba senfa za patologije dišnih organa refleksno poboljšava njihov trofizam (preko eksteroceptora kože).

Glavni zadatak farmakodinamika- saznajte gdje i kako djeluju ljekovite tvari, izazivanje određenih učinaka, odnosno uspostavljanje ciljeva s kojima lijekovi stupaju u interakciju.

Ciljevi lijekova uključuju receptore, ionske kanale, enzime, transportne sustave i gene. Receptori su aktivne skupine makromolekula supstrata s kojima tvar stupa u interakciju. Receptori koji osiguravaju manifestaciju djelovanja tvari nazivaju se specifični.

Postoje 4 vrste receptora:

§ receptori koji izravno kontroliraju funkciju ionskih kanala (H-kolinergički receptori, GABAA receptori);

§ receptori povezani s efektorom preko sustava "G-proteini-sekundarni prijenosnici" ili "G-proteini-ionski kanali". Takvi receptori su dostupni za mnoge hormone i medijatore (M-kolinergički receptori, adrenergički receptori);

§ receptori koji izravno kontroliraju funkciju efektorskog enzima. Oni su izravno povezani s tirozin kinazom i reguliraju fosforilaciju proteina (inzulinski receptori);

§ receptori koji vrše transkripciju DNA. To su unutarstanični receptori. Steroidni hormoni i hormoni štitnjače djeluju s njima.

Afinitet tvari prema receptoru, koji dovodi do stvaranja kompleksa tvar-receptor s njim, označava se izrazom "afinitet". Sposobnost tvari, kada je u interakciji s određenim receptorom, da ga stimulira i izazove jedan ili drugi učinak naziva se intrinzična aktivnost.