Polimer láncreakció. Nézze meg, mi a „PCR” más szótárakban

GOU VPO "Krasznojarszk Állami Orvosi Akadémia"

Yaszenetsky Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökségről nevezték el »

Orvosi Genetikai és Klinikai Neurofiziológiai Osztály IPO

A MÓDSZER ALAPELVEI

POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ

Módszertani kézikönyv 3-4 éves hallgatóknak

általános orvosi szakokon (060101) ill

Krasznojarszk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. A polimeráz láncreakciós módszer alapelvei. Módszertani kézikönyv 3-4 éves hallgatók tanórán kívüli munkájához általános orvos (060101) és gyermekgyógyászat (060103) szakokon. – Krasznojarszk: Az Állami Szakmai Felsőoktatási Intézmény kiadója KrasSMA, 2007. – 42 p.

Az oktatási kézikönyv teljes mértékben megfelel az állami szabvány (2000) követelményeinek, és tükrözi az örökletes emberi betegségek diagnosztizálásának modern módszerének fő szempontjait - a polimeráz láncreakciós módszert, az oktatási anyagokat az oktatási technológiákhoz igazítják, figyelembe véve a sajátosságokat. képzés 3-4 éves orvosi és gyermekorvosi karon.

Ellenőrzők:Állami Szakmai Felsőoktatási Intézmény Orvosi Genetikai Tanszékének vezetője

"Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökség Novoszibirszk Állami Orvostudományi Egyeteme", az orvostudományok doktora, professzor;

DNS replikáció

A vizsgálat tárgya ez a módszer dezoxiribonukleinsav (DNS). A DNS a genetikai információ univerzális hordozója a Földön létező összes élőlényben (az RNS-tartalmú mikroorganizmusok kivételével). A DNS egy spirálba csavart kettős szál. Mindegyik szál szekvenciában összekapcsolt nukleotidokból áll. A DNS-szálak ellentétes irányúak: az egyik szál 5"-os vége megfelel a második szál 3"-os végének. A DNS egyedülálló tulajdonsága, hogy képes megkétszerezni. Ez a folyamat hívott replikáció. A DNS-molekula replikációja az interfázis szintetikus periódusában megy végbe. Az „anya” molekula mind a két lánca sablonként szolgál a „lánya” számára. A replikáció után az újonnan szintetizált DNS-molekula egy „anya” szálat tartalmaz, a második pedig egy újonnan szintetizált „leány” szálat (félkonzervatív módszer). Egy új DNS-molekula templátszintéziséhez szükséges, hogy a régi molekulát despirálják és megnyújtsák. A replikáció a DNS-molekulában több helyen megindul. A DNS-molekulának az egyik replikáció kezdőpontjától egy másik replikáció kezdőpontjáig terjedő szakaszát nevezzük replikon.

A replikáció indítása aktiválva van alapozók(primerek), amelyek 100-200 nukleotidpárból állnak. A DNS-helikáz enzim feltekercselődik és két szálra osztja az anya-DNS-hélixet, amelyeken a komplementaritás elve szerint a DNS-polimeráz enzim közreműködésével „leány” DNS-szálak állnak össze. Ahhoz, hogy az enzim elkezdhesse munkáját, kiindulási blokk jelenléte szükséges - egy kis kezdeti kétszálú fragmentum. A kiindulási blokk a primer és a kiindulási DNS megfelelő szálának komplementer régiójának kölcsönhatása révén jön létre. Minden replikonban a DNS-polimeráz csak egy irányba tud mozogni az „anya” szál mentén (5`=>3`).

A vezető szálon, ahogy a replikon letekerődik, fokozatosan folyamatosan nő egy „leány” szál. A lemaradó szálon a leányszál is szintetizál (5`=>3`), de külön töredékekben, ahogy a replikon letekerődik.

Így a „leány” szálak komplementer nukleotidjainak hozzáadása ellentétes irányban (antiparallel) történik. A replikáció az összes replikonban egyidejűleg történik. A különböző replikonokban szintetizált „leány” szálak töredékeit és részeit a ligáz enzim varrja egyetlen szálba. A replikációt a félig konzervatívság, az antiparallelizmus és a megszakadás jellemzi. Egy sejt teljes genomja egyszer replikálódik egy mitotikus ciklusnak megfelelő időtartam alatt. A replikációs folyamat eredményeként egy DNS-molekulából két DNS-molekula képződik, amelyekben az egyik szál az anya-DNS-molekulából, a második, a lánya pedig újonnan szintetizálódik (1. ábra).

Rizs. 1. A DNS-molekula replikációjának sémája.

Így a DNS-replikációs ciklus magában foglalja három fő szakasz:

1. a DNS hélix feltekercselése és a szálak divergenciája (denaturáció);

2. alapozók rögzítése;

3. a gyermekszál láncának befejezése.

A PCR módszer elve

A DNS replikációja képezi a PCR alapját. A PCR során a fenti folyamatokat kémcsőben, ciklikus üzemmódban hajtják végre. Az egyik reakciófokozatból a másikba való átmenetet az inkubációs keverék hőmérsékletének változtatásával érjük el. Amikor az oldatot 93-95 °C-ra melegítjük, a DNS denaturálódik. A következő lépéshez - a primerek hozzáadásához vagy „illesztéséhez” - az inkubációs keveréket 50-65 °C-ra hűtjük. Ezután a keveréket 70-72 °C-ra melegítjük - ez az optimális a taq-DNS polimeráz számára -, ebben a szakaszban egy új DNS-szál felépítése következik be. Ezután a ciklus újra megismétlődik. Más szavakkal a PCR módszer a kópiaszám többszörös növelése (erősítés) a DNS egy specifikus szakasza, amelyet a DNS-polimeráz enzim katalizál.

A leány-DNS-szálak növekedésének egyszerre kell történnie az anyai DNS mindkét szálán, így a második szál replikációjához is saját primerre van szükség. Így két primert adunk a reakcióelegyhez: az egyiket a „+” lánchoz, a másodikat a „-” lánchoz. Miután a DNS-molekula ellentétes szálaihoz kapcsolódnak, a primerek a DNS-molekula azon részére korlátozódnak, amely később sokszorosodik vagy amplifikálódik. Egy ilyen fragmens, úgynevezett amplikon hossza általában több száz nukleotid.

PCR szakaszok

Minden egyes amplifikációs ciklus 3 szakaszból áll, amelyek különböző hőmérsékleti feltételek mellett fordulnak elő (2. ábra).

· 1. szakasz: DNS denaturáció . 93-95°-on 30-40 másodpercig fordul elő.

· 2. szakasz: primer lágyítás . A primerek kapcsolódása a megfelelő szekvenciákkal komplementeren megy végbe az ellentétes DNS-szálakon egy adott régió határain. Minden alapozópárnak megvan a maga lágyítási hőmérséklete, melynek értéke 50-65°C között van. Izzítási idő 20-60 mp.

· 3. szakasz: A DNS-láncok komplementer kiteljesedése a lánc 5" végétől a 3" végéig ellentétes irányban, a primer kapcsolódási helyektől indulva történik. Az új DNS-láncok szintézisének anyaga az oldathoz adott dezoxiribonukleozid-trifoszfátok. A szintézis folyamatát a taq polimeráz enzim katalizálja, és 70-72°C hőmérsékleten megy végbe. A szintézis ideje 20-40 másodperc.

Az első amplifikációs ciklusban kialakult új DNS-láncok templátként szolgálnak a második amplifikációs ciklushoz, amelyben egy specifikus DNS-amplikon fragmentum képződik (3. ábra). A következő amplifikációs ciklusokban az amplikonok sablonként szolgálnak az új láncok szintéziséhez.

Így az amplikonok felhalmozódása az oldatban a 2" képlet szerint történik, ahol n az amplifikációs ciklusok száma. Ezért még ha a kiindulási oldat kezdetben csak egy kétszálú DNS-molekulát tartalmazott is, akkor 30-40 ciklus alatt kb. Az oldatban 108 amplikon molekula halmozódik fel, ez a mennyiség elegendő a fragmentum megbízható vizuális detektálásához agaróz gél elektroforézissel.

Az erősítési folyamat egy speciális programozható termosztátban történik ( hőciklus), amely adott program szerint automatikusan változtatja a hőmérsékletet az erősítési ciklusok számának megfelelően.

Az erősítés végrehajtásához a következő összetevőkre van szükség:

· DNS-mátrix(DNS vagy annak egy része, amely a kívánt specifikus fragmenst tartalmazza);

· Alapozók(szintetikus oligonukleotidok (20-30 nukleotidpár), komplementerek a DNS-szekvenciákkal a meghatározandó specifikus fragmentum határain). A specifikus fragmens és a primerek kiválasztása kritikus szerepet játszik az amplifikáció specificitásában, ami befolyásolja az analízis minőségét.

· Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) keveréke(négy dNTP keveréke, amelyek új, komplementer DNS-láncok szintézisének anyagai 200-500 µM egyenértékű koncentrációban)

· EnzimTaq-polimeráz(hőstabil DNS-polimeráz, amely a primerláncok megnyúlását katalizálja úgy, hogy a szintetizált DNS növekvő láncához szekvenciálisan nukleotidbázisokat adunk, 2-3 mM).

· Pufferelési megoldás(az enzimaktivitás fenntartásához szükséges Mg2+ ionokat tartalmazó reakcióközeg, pH 6,8-7,8).

Az RNS-vírusok genomjának specifikus régióinak azonosításához először egy DNS-másolatot nyernek egy RNS-templátból a revertáz enzim (reverz transzkriptáz) által katalizált reverz transzkripciós (RT) reakció segítségével.

Rizs. 2. Erősítés (1. ciklus).

Rizs. 3. Erősítés (2. ciklus).

A PCR fő alkalmazásai

· klinikai gyógyszer:

o fertőzések diagnosztizálása,

o mutációk azonosítása, beleértve az örökletes betegségek diagnosztizálását,

o genotipizálás, beleértve a HLA genotipizálást,

o sejtes technológiák

· ökológia (mint a környezeti tárgyak és élelmiszerek állapotának és minőségének nyomon követése)

· transzgenikus szervezetek (GMO-k) meghatározása

Személyazonosítás, apasági megállapítás, kriminalisztika

· általános és specifikus biológia,

Alapelvek

diagnosztikai laboratóriumok szervezése

A PCR-laboratóriumban végzett munka a „tervezési szabályok, a biztonsági óvintézkedések, az ipari higiénia, a járványellenes rendszer és a személyes higiénia szabályai szerint történik az egészségügyi rendszer egészségügyi és járványügyi intézményeinek laboratóriumaiban (osztályaiban, osztályaiban) végzett munka során.

DNS-minták szennyeződése

A PCR diagnosztika elvégzése olyan problémával jár, amelyet a nagy érzékenység módszer, - lehetőség szennyeződés. Nyomnyi mennyiség belép a reakciócsőbe pozitív DNS(specifikus DNS-amplifikációs termékek - amplikonok; pozitív kontrollként használt DNS-standard; klinikai mintából származó pozitív DNS) a PCR során egy specifikus DNS-fragmens amplifikációjához vezet, és ennek eredményeként hamis pozitív eredmények megjelenéséhez.

A munka során találkozhat kétféle szennyeződés:

1. keresztszennyeződés mintáról mintára (a klinikai minták feldolgozása során vagy a reakcióelegy feloldásakor), ami szórványos téves pozitív eredményhez vezet;

2. amplifikációs termékekkel való szennyeződés(amplikonok), aminek a legnagyobb jelentősége van, mivel a PCR folyamat során az amplikonok hatalmas mennyiségben halmozódnak fel és ideális termékei a reamplifikációnak.

Az üvegedények, automata pipetták és laboratóriumi berendezések, a laboratóriumi padok felületének, vagy akár a laboratóriumi dolgozók bőrének nyomokban történő amplikonokkal való szennyeződése szisztematikus téves pozitív eredményhez vezet. A szennyeződés forrásának meghatározása nagyon nehéz lehet, és jelentős idő- és pénzbefektetést igényel. A diagnosztikai PCR módszert alkalmazó laboratóriumokban eddig megszerzett tapasztalatok lehetővé teszik, hogy megfogalmazzuk az ilyen laboratóriumok megszervezésére és magukra az elemzések lefolytatására vonatkozó alapvető követelményeket. Ezen követelmények betartása kiküszöböli a szennyeződés lehetőségét és a hamis pozitív eredményeket.

A PCR elemzés szakaszai

Földrajzilag külön helyiségekbe helyezve vannak elválasztva (4., 5. kép):

· PCR előtti szoba, ahol klinikai mintákat dolgoznak fel, DNS-t izolálnak, reakciókeveréket készítenek a PCR-hez, és elvégzik a PCR-t (a körülmények fennállása esetén az utolsó két szakaszt is javasolt egy további külön helyiségben elvégezni). Ezekben a helyiségekben tilos minden egyéb munkavégzés olyan vizsgálati szerekkel, amelyek PCR diagnosztikáját ebben a laboratóriumban végzik.

· PCR utáni szoba, ahol az amplifikációs termékek kimutatását végzik. Ebben a helyiségben más észlelési módszerek is használhatók. Célszerű az amplifikációs termék detektáló helyiséget a lehető legtávolabb elhelyezni a pre-PCR helyiségektől.

A munkatermek ultraibolya lámpákkal vannak felszerelve, amelyek maximális sugárzása körülbelül 260 nm (DB-60 típus), 2,5 W/1 m3 sebességgel. A lámpák úgy helyezkednek el, hogy a munkaasztalok, berendezések és anyagok felületei, amelyekkel a kezelő a PCR-elemzés során érintkezésbe kerül, közvetlen besugárzásnak vannak kitéve. A besugárzás a munka megkezdése előtt 1 órán belül és a munka befejezése után 1 órán belül történik.

A laboratóriumi orvosok speciális laboratóriumi ruházatban dolgoznak, amelyet egyik helyiségből a másikba költöztetnek, és eldobható kesztyűben. A különböző helyiségekből származó ruhákat külön dolgozzák fel. A különböző alkalmazottak a PCR elemzés különböző szakaszaiban dolgoznak.

A munkához külön adagolókészleteket, műanyag- és üvegárukat, laboratóriumi felszereléseket, köpenyeket és kesztyűket használnak, amelyeket az elemzés különböző szakaszaira szánnak, és nem hordozhatók egyik helyiségből a másikba. A felszerelések, anyagok és kellékek minden helyiségben megfelelően meg vannak jelölve.

A munka minden szakaszában csak eldobható fogyóeszközöket használnak: automata pipetták hegyei, kémcsövek, kesztyűk stb. A mintáról a mintára való váltáskor feltétlenül cserélje ki a hegyeket. Szűrővel ellátott hegyeket kell használni - aeroszol gátat, hogy megakadályozzák az oldat mikrocseppek bejutását a pipettába. A használt csöveket és hegyeket speciális tartályokba vagy tárolóedényekbe kell dobni fertőtlenítő oldat. A klinikai mintákat a reagensektől elkülönítve tárolják.

A munkahely feldolgozásához és tisztításához minden helyiséget pamut-géz törlőkendővel (törlőkendővel), csipeszekkel, fertőtlenítő és inaktiváló oldatokkal látnak el.

A PCR diagnosztikai laboratórium kizárja az ebben a laboratóriumban diagnosztizált kórokozók DNS-szekvenciáját vagy génfragmenseit tartalmazó rekombináns plazmidok előállításával (klónozásával) és izolálásával kapcsolatos munkát.

Klinikai anyagok gyűjteménye

A PCR-hez vizsgálandó anyag lehet hámsejtek, vér, plazma, szérum, pleurális és agy-gerincvelői folyadékok, vizelet, köpet, nyálka és egyéb biológiai váladék, biopszia kaparéka.

Az anyagot a megfelelő profilú kezelőhelyiségben gyűjtik össze. A mintákat a gyűjtés után a lehető leghamarabb a PCR diagnosztikai laboratóriumba kell szállítani.

A mintákat steril, lehetőleg eldobható eszközökkel, csak eldobható steril műanyag csövekben vagy üvegcsövekben kell venni, egy órán át krómkeverékkel előkezelni, desztillált vízzel alaposan kimosni és szárítószekrényben 150°C-on kalcinálni. 1 órán keresztül.

Érzékelési zóna (egy másik emelet vagy másik épület).

Rizs. 4. PCR laboratóriumi készülék elektroforézises kimutatással.

Érzékelési zóna (másik emelet vagy másik épület)

Rizs. 5. PCR laboratóriumi készülék fluoreszcens detektálással (kvantitatív elemzés).

Rizs. 6. DNS-kivonó szoba. Az ábrán egy csíraölő lámpával ellátott asztali doboz látható.

Rizs. 7. Erősítő szoba.

Rizs. 8. Detektáló szoba.

Rizs. 9. Vérminták örökletes betegségek DNS-diagnosztikájához.

Mintatárolás és szállítás

Az örökletes betegségek diagnosztizálásához a vérmintákat speciális papírformákon vagy epindorfokban (műanyag tubusokban) tárolják hosszú ideig fagyasztva (9. ábra).

A fertőző betegségek diagnosztizálásához a mintákat legfeljebb 2 órán át szobahőmérsékleten tartják. Ha hosszabb tárolásra van szükség, a mintákat legfeljebb egy napra hűtőszekrénybe lehet helyezni 2-8°C hőmérsékleten. Hosszabb tárolás (legfeljebb 2 hét) megengedett fagyasztóban, mínusz 20°C hőmérsékleten. A minták ismételt fagyasztása és felengedése nem megengedett.

Ha a PCR diagnosztikai laboratórium és a mintavételi eljárási helyiség földrajzilag el van választva, akkor a minták szállítását termoszokban vagy termikus tartályokban kell elvégezni a minták tárolására és a fertőző anyagok szállítására vonatkozó szabályok betartásával.

DNS-kinyerés a mintákból

Széles körben elterjedt a szilárd fázisú szorpciós módszer, amely guanidin oldatot tartalmazó lizálószer hozzáadásával, a DNS szorbensre történő szorpciójával, ismételt mosással és a DNS pufferoldattal történő reszorpciójából áll. Szérum, plazma vagy teljes vér feldolgozásakor általában a fenolos extrakciós módszert alkalmazzák. A módszer magában foglalja a fehérjementesítést fenol/kloroformmal, majd a DNS (vagy RNS) kicsapását etanollal vagy izopropanollal. A feldolgozást 1,5 ml térfogatú Eppendor P mikrocentrifugacsövekben végezzük. A feldolgozási idő 1,5-2 óra (10. ábra).

Rizs. 10. DNS kivonás.

PCR végrehajtása

A feldolgozott klinikai mintából meghatározott mennyiségű mintát egy speciális, 0,2 vagy 0,5 ml térfogatú Eppendorf típusú mikrocentrifuga csőbe helyezünk, amelyhez vízből, PCR pufferből, dNTP oldatból, primer oldatból és oldatból álló amplifikációs keveréket adunk. ugyanaz a cső. Taq polimeráz (utoljára adjuk a keverékhez) A reakcióelegy térfogata jellemzően 25 µl. Ezután minden csőbe egy csepp ásványolajat csepegtetünk, hogy megakadályozzuk a reakcióelegy elpárolgását az amplifikációs folyamat során. A csövek egy programozható termosztátba (erősítőbe) kerülnek, ahol az erősítés egy adott program szerint automatikusan megtörténik (11. ábra).

Rizs. tizenegy. Erősítő" Thermocycler ».

A reakcióidő a megadott programtól függően 2-3 óra. A kísérleti mintákkal párhuzamosan kontrollminták kerülnek elhelyezésre: a pozitív kontroll a reakció összes komponensét tartalmazza, de a klinikai mintaanyag helyett a vizsgált gén kontroll DNS-preparátumát adják hozzá. A negatív kontroll a reakció összes komponensét tartalmazza, de a klinikai anyag vagy DNS-készítmény helyett megfelelő mennyiségű ionmentesített vizet vagy olyan kivonatot adnak hozzá, amely nem tartalmazza a vizsgált DNS-t. Negatív kontrollra van szükség annak ellenőrzéséhez, hogy a reakciókomponensek nem tartalmaznak-e DNS-t szennyeződés miatt, és kizárják a hamis pozitív eredményeket.

Az eredmények nyilvántartása

Az amplifikált specifikus DNS-fragmenst agarózgél-elektroforézissel detektáljuk etidium-bromid jelenlétében. Az etidium-bromid DNS-fragmensekkel stabil intersticiális vegyületet képez, amely világító sávok formájában jelenik meg, amikor a gélt 290-330 nm hullámhosszú UV-sugárzással sugározzák be. A PCR eredményeként képződött amplikonok méretétől függően 1,5-2,5% agaróz tartalmú gélt használunk. Agaróz gél előállításához agaróz, puffer és víz keverékét mikrohullámú sütőben vagy vízfürdőben megolvasztják, és etidium-bromid oldatot adnak hozzá. Az 50-60°C-ra hűtött keveréket 4-6 mm vastag rétegben a formába öntik, és speciális fésűk segítségével zsebeket készítenek a gélbe a minta felviteléhez. A fésűket úgy kell felszerelni, hogy a lyukak alja és a gél alapja között 0,5-1 mm-es agarózréteg maradjon. A gél megszilárdulása után az erősítőt 5-15 μl mennyiségben felvisszük a zsebekre. Javasoljuk, hogy a DNS-fragmentumhossz-markerek keverékének elektroforézisét a kontroll és a kísérleti mintákkal párhuzamosan végezzük. Egy ilyen keverék jellemzően tíz, 100, 200, 300 stb. bázispár hosszúságú DNS-fragmenst tartalmaz.

Egy ilyen teszt használata lehetővé teszi az amplikonok hosszának ellenőrzését a kontroll és a kísérleti mintákban. A felvitt mintával a gélt egy pufferrel töltött elektroforézis kamrába visszük, a kamrát áramforráshoz csatlakoztatjuk és az amplifikációs termékek elektroforetikus szétválasztását 30-45 percig végezzük 10-15 V elektromos térerősség mellett. cm. Ebben az esetben a reakcióelegyben lévő festék elülső részének legalább 3 cm-t kell megtennie.

Az elektroforézis befejezése után a gélt egy üveg transzilluminátorba visszük át, és ultraibolya fényben nézzük. A dokumentációhoz a gélt Micrat 300 filmre fényképezzük, vagy számítógéphez csatlakoztatott videorendszerrel rögzítjük.

Mindenekelőtt a kontrollmintákat értékelik. A pozitív kontrollnak megfelelő elektroforetikus sávban egy narancssárga izzó sávnak kell jelen lennie. Elektroforetikus mozgékonyságának meg kell felelnie az utasításban megadott amplikonhossznak.

A negatív kontrollnak megfelelő elektroforetikus sávban ilyen sávnak hiányoznia kell. Egy ilyen sáv jelenléte a negatív kontrollban szennyeződést jelez – a használt reagensek szennyeződését a teszt DNS-sel vagy amplikonnal. A vizsgálati mintákat a megfelelő sávban lévő sáv megléte alapján értékelik, amely ugyanazon a szinten helyezkedik el, mint a pozitív kontrollmintában lévő sáv. A sáv intenzitása megfelel a mintában vizsgált DNS mennyiségének, ami lehetővé teszi a PCR félkvantitatív értékelését. A pozitív eredményeket általában négyfokú skálán értékelik. Ha a tesztmintában a sáv fénye nagyon gyenge, akkor az ilyen mintát át kell rendezni (12. ábra).

Rizs. 12. Agaróz gél elektroforézis.

A PCR alkalmazásai apontmutációk és génpolimorfizmusok diagnosztikája

A PCR egyik vezető alkalmazási területe a gyakorlati egészségügyben a pontmutációk és génpolimorfizmusok diagnosztizálása. . A DNS-diagnosztikának vannak közvetlen és közvetett módszerei. Olyan helyzetekben, amikor ismert egy gén, amelynek károsodása örökletes betegség kialakulásához vezet, ez a károsodás molekuláris genetikai módszerekkel kimutatható. Az ilyen módszereket közvetlennek nevezzük. Közvetlen módszerekkel kimutatják a DNS elsődleges nukleotidszekvenciájának szabálytalanságait (mutációkat és típusaikat). A direkt módszereket közel 100%-os pontosság jellemzi.

A gyakorlatban azonban ezek a módszerek bizonyos feltételek mellett alkalmazhatók:

· az örökletes betegség kialakulásáért felelős gén ismert citogenetikai lokalizációjával;

· a betegség génjét klónozni kell, és nukleotidszekvenciáját ismerni kell.

A közvetlen DNS-diagnosztika célja a mutáns allélek azonosítása.

Így azokban a helyzetekben, amikor ismert, hogy milyen DNS-károsodás vezet örökletes betegséghez, közvetlenül a károsodást tartalmazó DNS-fragmenst vizsgálják, azaz a direkt DNS-diagnosztikai módszert alkalmazzák.

A mai napig azonban számos betegség génje nem került feltérképezésre, exon-intron szerveződésük ismeretlen, és számos örökletes betegségre jellemző a kifejezett genetikai heterogenitás, ami nem teszi lehetővé a direkt DNS-diagnosztikai módszerek teljes körű alkalmazását. Ezért azokban az esetekben, amikor a károsodás lokalizációja nem ismert, más megközelítést alkalmaznak, amely a génbetegségért felelős gén környezetének vizsgálatához kapcsolódik, családanalízissel kombinálva, azaz a molekuláris genetikai diagnózis közvetett módszereivel. örökletes betegségeket alkalmaznak.

Különféle módszerek használhatók a pontmutációk és kis deléciók kimutatására, de ezek mindegyike a PCR módszerre támaszkodik. Ez a reakció lehetővé teszi a DNS-nukleotidszekvencia többszöri megsokszorozását, majd mutációk keresését. A mutációkat hordozó DNS-fragmensek keresésének módszerei a mutáns és normál DNS-nukleotidszekvenciák összehasonlító elemzésén alapulnak.

A PCR termékek elemzése

a közvetlen DNS-diagnosztika folyamatában

Magában foglalja az amplifikált génrégió sajátos jellemzőinek tanulmányozását. Így a trinukleotid ismétlődések expanziója által okozott betegségekben az amplifikációs termékek hosszukban (ami a vizsgált génrégióban lévő hármasok eltérő számát tükrözik) és ennek következtében a gélben való mozgási sebességükben különböznek. Ennek köszönhetően a normál és a mutáns allélek egyértelmű elektroforetikus szétválasztása és a kórosan megnyúlt fragmentum pontos meghatározása érhető el, azaz a betegség DNS-diagnosztikája (13. ábra).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rizs. 14. A törlés diagnózisa GAG a génben DYT 1 dopa-független dystóniában szenvedő betegeknél (poliakrilamid gélelektroforézis). 2,3,6 sáv – beteg; pálya 1,4,5 – vezérlés. A vékony nyíl a normál allélt, a vastag nyíl a mutáns rövidebb allélt jelöli (három nukleotid törlése).

Ha a teljes vizsgált DNS-régió egy kiterjesztett deléció része, akkor ebből a deletált allélból származó DNS PCR-amplifikációját nem hajtják végre a primer hibridizációhoz szükséges helyek hiánya miatt. Ebben az esetben a homozigóta deléciót a PCR reakciótermékének teljes hiánya alapján diagnosztizálják (a DNS-szintézis a gén mindkét kópiájából lehetetlen). Heterozigóta delécióval lehetséges a normál (megtartott) allélból szintetizált PCR termék kimutatása, azonban egy ilyen mutáció megbízható diagnosztizálásához több felhasználásra van szükség. összetett módszerek DNS-vizualizáció, amely lehetővé teszi a végső PCR-termék dózisának becslését.

A pontmutációk (leggyakrabban nukleotidszubsztitúciók) azonosítására bizonyos helyeken a PCR-módszert más molekuláris genetikai elemzési módszerekkel kombinálva alkalmazzák. Ha a feltételezett pontmutáció helye és természete pontosan ismert, akkor a restrikciós endonukleázok (restrikciós enzimek) speciális sejtenzimek, amelyeket különféle baktériumtörzsekből izolálnak.

Ezek az enzimek négy-tíz nukleotid hosszúságú specifikus nukleotidszekvenciákat ismernek fel. Ezt követően ezeknek a szekvenciáknak a restrikcióját (lat. (cutting)) hajtják végre egy kettős szálú DNS molekula részeként.Minden restrikciós enzim felismer és rögzített helyen vág egy szigorúan meghatározott, specifikus nukleotid szekvenciát - restrikciós hely (felismerési hely).

Azokban az esetekben, amikor egy pontmutáció megváltoztatja egy adott restrikciós enzim természetes felismerési helyét, ez az enzim nem lesz képes hasítani a mutáns PCR-amplifikált fragmenst. Egyes esetekben a mutáció egy adott restrikciós enzim új felismerési helyének megjelenéséhez vezet, amely normális esetben hiányzik.

Mindkét esetben a kiválasztott restrikciós enzimmel kezelt mutáns és normál PCR-termékek különböző hosszúságú restrikciós fragmentumokat termelnek, amelyek elektroforézissel könnyen kimutathatók (15. ábra).

Így, ha szükség van bármilyen konkrét pontmutáció gyors kimutatására, akkor a feladat a megfelelő restrikciós enzim keresésére redukálódik, amelynek felismerési helye a megszakadt nukleotidszekvencia helyén található. A PCR-termékek ilyen restrikciós enzimmel történő kezelése lehetővé teszi a normál és a mutáns allélek könnyű megkülönböztetését. A restrikciós elemzés nagymértékben leegyszerűsíti az ismert pontmutációk kimutatását, és ma már széles körben használják örökletes betegségek közvetlen DNS-diagnosztikájára.

A végső szakasz mutációk molekuláris genetikai elemzése célja a vizsgált DNS-fragmens nukleotidszekvenciájának meghatározása (szekvenálás), amelyet összehasonlítanak a normával, és felállítják a végső genetikai diagnózist. A molekuláris genetika sikereinek köszönhetően mára több mint 400 örökletes betegség DNS-diagnosztikai módszerét fejlesztették ki.

Rizs. 15. Pontmutáció kimutatása restrikciós elemzéssel: A – restrikciós helyet tartalmazó amplifikált génrégióAGCTrestrikciós endonukleázhozAlu én. MutációG→ Amegváltoztatja ezt a nukleotidszekvenciát, ami restrikciós enzimet eredményezAluIzárolt; B – restrikciós termékek elektroferogramja: 1. pálya – homozigóta a normál allélra; 2. pálya – homozigóta mutáció; 3. pálya – heterozigóta állapot (normál allél + mutáció).

Az örökletes betegségek diagnosztizálása a betegek, családtagjaik vagy feltételezett kóros mutációk heterozigóta hordozóiban a mutáns allélek közvetlen vizsgálatán alapuló pre-tünet- és prenatális diagnosztikára alkalmas, amely a magzati fejlődés legkorábbi szakaszában, a magzati fejlődés előtt alkalmazható. bármilyen betegség klinikai vagy biokémiai tünetének megjelenése.

A mutációdetektáló módszertől függetlenül az egyes mutációk pontos molekuláris jellemzői csak közvetlen szekvenálással nyerhetők. A folyamat automatizálásához utóbbi évek Széles körben használnak speciális eszközöket - szekvenátorokat, amelyek lehetővé teszik a DNS-információk olvasásának jelentős felgyorsítását.

Út a többért széles körű alkalmazás A klinikai diagnosztikai laboratóriumokban végzett molekuláris biológiai kutatások lehetővé teszik az analitikai folyamat felgyorsítását azáltal, hogy az összes eljárást egy kontinuumban, mintaátvitel nélkül hajtják végre, megteremtve a feltételeket a szennyeződés megelőzésére számos analit párhuzamos tesztelése során, valamint az eredmények objektív rögzítésével minden ciklusban.

A PCR módszer főbb módosításai

Ismert génmutációk gyors szkennelésére és keresésére használják.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ez a módszer a vizsgált gén több exonjának egyidejű amplifikációján alapul egy reakcióban. Ez lehetővé teszi a leggyakoribb mutációk költséghatékony gyors szűrését. Például a progresszív Duchenne/Becker izomdisztrófiában szenvedő betegeknél a disztrofin gén delécióinak hordozásának gyors diagnosztizálására e gén leggyakrabban mutált exonjait egyidejűleg amplifikálják. Mivel ezek a betegségek X-hez kötött recesszív módon öröklődnek, és fiúknál az egyetlen X-kromoszóma károsodásával járnak, kiterjesztett deléció esetén a reakciótermékek elektroforézise feltárja egy vagy több DNS-fragmens (exon) hiányát. ), amely a diagnózis molekuláris megerősítéseként szolgálhat. Ezenkívül a PCR-amplifikációhoz specifikus génszakaszok kiválasztásával a deléció és a géntöréspontok teljes hosszának (az exonig) meglehetősen pontos értékelése lehetséges.

Több multiplex reakció együttes alkalmazása lehetővé teszi a progresszív Duchenne/Becker izomdisztrófiában szenvedő betegekben előforduló összes deléció akár 98%-ának diagnosztizálását. Ez a dystrophin gén összes ismert mutációjának körülbelül 60%-át jelenti, és jelzi ennek a szűrési módszernek a nagyon magas hatékonyságát a dystrophinopathiák DNS-diagnosztikájában (16. ábra).

Rizs. 16. Duchenne-izomdystrophia közvetlen DNS-diagnosztikája multiplex PCR-rel (agaróz gélelektroforézis). Mindegyik vizsgált egyedben a disztrofin gén négy exonja egyidejűleg amplifikálódott (17., 19., 44. és 45. exon; a nyilak a megfelelő amplifikációs termékeket jelölik). 1. sáv – kontroll, 2-5. sáv – Duchenne-izomdystrophiában szenvedő betegek a disztrofin gén különböző delécióival (2. és 5. sáv – 45. exon deléciója, 3. sáv – 44. exon deléciója, 4. sáv – 17. és 19. exon deléciója ).

Allél-specifikus amplifikáció

A módszer két független primerpár felhasználásán alapul egy adott génrégióhoz: mindkét párban egy primer gyakori, a második primer pedig mindegyik párban eltérő szerkezettel rendelkezik, és komplementer akár egy normál, akár egy mutáns DNS-szekvenciához. Egy ilyen reakció eredményeként kétféle PCR-termék egyidejűleg szintetizálható oldatban - normál és mutáns. Ezenkívül az alkalmazott primerek kialakítása lehetővé teszi a normál és a mutáns amplifikációs termékek világos megkülönböztetését molekulaméretük alapján. Ez a módszer nagyon vizuális, és lehetővé teszi a mutáns allél homo- és heterozigóta hordozásának ellenőrzését.

Az amplifikált DNS helyspecifikus módosításának módszere

A módszer egy úgynevezett mismatch primer alkalmazásán alapul a PCR-ben (nem teljesen komplementer a templáttal), amely egy nukleotidban különbözik a templát DNS-szekvenciától. A meghatározott primer mutáns PCR-termékbe való beépítése eredményeként abban az egyik restrikciós endonukleáz számára mesterségesen létrehozott restrikciós hely képződik, amely lehetővé teszi egy bizonyos ismert mutáció közvetlen DNS-diagnosztikáját restrikciós elemzés segítségével. Egy ilyen mesterséges restrikciós hely létrehozása akkor szükséges, ha a keresés nem tárt fel olyan ismert és elérhető enzim létezését, amelynek „természetes” restrikciós helyét a vizsgált mutáció DNS-molekulában való megjelenése befolyásolja. .

Reverz transzkriptáz PCR módszer (RT- PCR)

Ezt a módszert olyan esetekben alkalmazzák, amikor kényelmesebb nem genomikus DNS-t használni a vizsgálat tárgyaként, hanem egy kompaktabb és információban gazdagabb cDNS-t, amelyet szövetminták, például biopsziás anyag vagy limfocita sejtvonalak megfelelő feldolgozása után nyernek, fibroblasztok stb. Itt fontos feltétel a kívánt gén expressziója (legalább minimális) a vizsgált szövetben.

Az első szakaszban az mRNS reverz transzkripcióját hajtják végre, és a kapott cDNS-molekulák templátként szolgálnak a PCR-hez. Ezt követően a megfelelő mennyiségben amplifikált cDNS kritikus régióját szekvenálásnak és egyéb mutációs szűrési módszernek, közvetlen elektroforetikus vizsgálatnak (deléciók, inszerciók kimutatása stb.) vagy expressziós rendszerbe történő integrációnak vetik alá fehérjetermék előállítása érdekében. és annak közvetlen elemzése.

Ez a módszer különösen hatékony a „csonka” fehérje szintéziséhez vezető mutációk (nonszensz mutációk, splicing mutációk, nagy deléciók) kimutatására - az úgynevezett PTT analízis (Protein Truncation Test). A PTT analízist általában hosszú, több exonból álló gének, például Duchenne/Becker izomdisztrófia, ataxia-telangiectasia vagy 1-es típusú neurofibromatosis vizsgálatára használják.

Valós idejű PCR(Valós idejű PCR, angol)

A valós idejű PCR minden évben egyre népszerűbb diagnosztikai módszer a gyakorlati egészségügyben. Alapvető jellemzője a polimeráz láncreakció termékeinek felhalmozódásának monitorozása és kvantitatív elemzése, valamint a kapott eredmények automatikus regisztrálása és értelmezése. Ez a módszer nem igényel elektroforézis szakaszt, ami csökkenti a PCR-laboratórium követelményeit. A termelési helytakarékosságnak, a létszámcsökkentésnek és a DNS/RNS mennyiségi meghatározásának igényének köszönhetően ezt a módszert az elmúlt években sikeresen alkalmazták a világ fejlett országainak legnagyobb egészségügyi-járványügyi, diagnosztikai és kutatóközpontjaiban, felváltva a PCR jelenlegi („klasszikus”) formátumában.

A valós idejű PCR fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbákat használ az amplifikált DNS kimutatására. A valós idejű PCR lehetővé teszi a minta teljes elemzését 20-60 percen belül, és elméletileg akár egy DNS- vagy RNS-molekulát is képes kimutatni a mintában.

Rizs. 17. Valós idejű PCR.

A valós idejű PCR egy TaqMan rendszert használ, amely közvetlenül az amplifikáció során szabályozza a PCR kinetikáját rezonancia fluoreszcencia kioltással. A kimutatáshoz olyan szondát használunk, amely az amplifikált fragmens középső részével komplementer fluorofort és kioltót tartalmaz. Amikor a fluorofor és a kioltó az oligonukleotid próbához kötődik, csak csekély fluoreszcens emisszió figyelhető meg. Az amplifikációs folyamat során a Taq polimeráz 5"-os exonukleáz aktivitása miatt a fluoreszcens címke oldatba megy, megszabadul a kioltó közelségétől, és fluoreszcens jelet generál, amely valós időben az erősítő felhalmozódásával arányosan növekszik ( 17. ábra).

A Real-Time PCR fő előnyei a gélelektroforézissel végzett PCR-rel szemben:

· A teljes módszer egy kémcsőben zajlik;

· A módszer 1 órát vesz igénybe;

· 1-2 munkaszoba elegendő;

· Az eredmény kvalitatív értékelése mellett megjelenik a mennyiségi értékelés lehetősége (pl. vírusellenes terápia AIDS vagy vírusos hepatitis esetén ismerni kell a vírusterhelést, azaz az egységenkénti vírus mennyiségét, amelyet valós idejű PCR biztosít);

· A szennyeződés veszélye jelentősen csökken.

Következtetés

A PCR módszer a molekuláris biológiai kutatások egyik legelterjedtebb módszere. Ezt a módszert a klinikusoknak intelligensen kell alkalmazniuk, és annak az orvosnak, aki úgy dönt, hogy munkájában PCR-t alkalmaz, bizonyos ismeretekkel kell rendelkeznie ennek a módszernek a jellemzőiről és képességeiről. Másodszor, szoros visszacsatolásnak kell lennie a klinikus és a PCR laboratórium között, ami szükséges az összetett esetek elemzéséhez és a helyes diagnosztikai stratégia kialakításához. Harmadszor, a PCR-elemzés nem csodaszer a diagnózisban (elsősorban a fertőző betegségekben), és nem helyettesíti meglévő módszereket kutatás, hanem csak kiegészíti azt. És ami a legfontosabb, a PCR nem helyettesítheti azt az intuíciót és analitikus gondolkodást, amivel a sikert váró orvosnak rendelkeznie kell.

P . S . Molekulárisan -biológiai kutatás- a diagnózis és a kezelés irányelveinek megváltoztatása. A molekuláris biológiai módszerek alkalmazása a laboratóriumi diagnosztika radikális hangsúlyváltozásának kilátásba helyezésével jár. Lehet, hogy nem csak az időszerű tájékoztatásról van szó, hanem arról is, hogy azokat előre megkapjuk. Ha jelenleg a laboratóriumi vizsgálatokat a legtöbb esetben már a betegség kialakulása és a kezelés megkezdése után végzik el, akkor a molekuláris biológiai laboratóriumi információk várhatóan lehetővé teszik egy személy bizonyos típusú patológiákra való hajlamának és bizonyos gyógyszerekkel szembeni érzékenységének meghatározását. , amely igazolja a jövő orvostudományának prediktív, megelőző és személyre szabott természetét.

A DIAGNOSZTIKA ÉS A KEZELÉSI IRÁNY VÁLTOZÁSA

ÖRÖKLETES BETEGSÉGEK

Ma A jövőben

Diagnózis Genetikai útlevél

8. Hány dolgozószoba szükséges egy fluoreszcens detektálással (kvantitatív elemzés, Real-Time PCR) működő PCR laboratórium működtetéséhez?

9. Mi az észlelés?

10. Milyen DNS-diagnosztikai módszerek léteznek?

11. Melyik enzim munkája áll a PCR hátterében?

12. Miért kell az érzékelési zónát eltávolítani a többi munkaterületről?

13. Mi az a korlátozási oldal?

14. Mik a különbségek? közvetlen módszer DNS-diagnosztika indirektből?

15. Mi a szekvenálás?

16. Mi az a multiplex PCR?

17. Milyen típusú mutációkat határoznak meg PCR segítségével?

18. Mi a szennyeződés?

19. Mi az allélspecifikus amplifikációs módszer lényege?

20. A PCR-anyag tárolási feltételei?

21. Milyen készülékben történik az erősítés?

22. Mi az a reverz transzkriptáz PCR (RT-PCR) módszer?

23. Mi szolgál anyagul a PCR diagnosztikához?

24. Sorolja fel a szennyeződés típusait?

Önfelkészítő tesztek

1. Endonukleáz restrikciós enzimek:

a) a DNS-t szigorúan meghatározott helyeken „bontó” enzimek;

b) az enzimek, amelyek összevarrják a DNS-molekula töréseit;

c) DNS-javítást végző vegyületeket biztosító enzimek.

2. Gén amplifikáció:

3. Milyen molekuláris genetikai módszert alkalmaznak egy ismert szekvenciájú mutáns gén által okozott betegségek diagnosztizálására?

a) specifikus restrikciós enzim alkalmazása;

b) közvetlen kimutatás specifikus molekuláris próbák segítségével;

c) a normál restrikciós fragmentumhosszúságú polimorfizmusok eloszlásának családanalízise.

4. DNS szekvenálás:

a) a DNS-bázis szekvencia azonosítása;

b) bármely DNS-szakasz többszöri megismétlése;

c) a vizsgált gént tartalmazó DNS-fragmens izolálása.

5. DNS-minták beszerzéséhez használhatja :

b) chorionbolyhok;

c) magzatvíz;

d) magzatvíz sejtjei;

e) bőr-, izom-, májbiopsziás minták,

e) minden helyes, kivéve a „c” pontot,

g) minden helyes, kivéve a „d” pontot,

h) a fentiek mindegyike igaz.

6. A PCR módszerrel használt mutációk diagnosztizálására:

a) genomiális;

b) kromoszómális;

c) gén (pont).

7. Az alapozó a következő:

a) a DNS komplementer szakasza;

b) szintetikus oligonukleotiddal jelölt (radioaktívan vagy fluoreszcensen) szekvencia, amely komplementer mutáns vagy normál génnel;

c) oligonukleotid, amely „primerként” működik, és elindítja egy polinukleotid lánc szintézisét egy DNS- vagy RNS-mátrixon.

8. Ki dolgozta ki a PCR módszer elvét?

b) K. Mullis

9. Használják a PCR módszert a trinukleotid ismétlődések (a mutáció dinamikus típusa) kiterjedésének diagnosztizálására?

10. Milyen területeken alkalmazzák a PCR-t?

a) klinikai orvoslás;

b) transzgenikus szervezetek (GMO-k) meghatározása

c) személyazonosítás, apasági megállapítás, kriminalisztika

d) a fentiek mindegyike,

e) a fentiek egyike sem.

Válaszminta: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – be; 7 – be; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Fő

1.Bochkov genetika. Moszkva. GEOTAR, 2002.

További

1. , Bakharev és a veleszületett és örökletes betegségek kezelése gyermekeknél. – Moszkva, 2004.

2. DNS-diagnosztika és orvosgenetikai tanácsadás. – Moszkva, 2004.

3. Gintergenetika. – Moszkva, 2003.

4. Gorbunov orvosi genetika alapjai. – Szentpétervár: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekuláris klinikai diagnosztika. – Világ, 1999.

6. Mensikov - biológiai kutatások a klinikai laboratóriumi diagnosztikában: a probléma lehetőségei (előadások). Klinikai laboratóriumi diagnosztika, 2006. 3. sz.

7. Kornyienko munkája a PCR laboratóriumban biológiai anyagok in-line elemzése során. Klinikai laboratóriumi diagnosztika, 2006. 10. sz.

8. A PCR laboratóriumi munka megszervezése. Módszertani utasítások. MU 1.3.1794-03. Az Orosz Föderáció egészségügyi főorvosa, 2003.

9. Erlich H. A. PCR technológia. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Valós idejű kvantitatív PCR. Genome Res. – 1996. 6. sz.

A MÓDSZER ALAPELVEI

POLIMERÁZ LÁNCREAKCIÓ

Módszertani kézikönyv 3-4 éves hallgatók tanórán kívüli munkájához általános orvos (060101) és gyermekgyógyászat (060103) szakokon.

Állami Szakmai Felsőoktatási Intézmény "Szövetségi Egészségügyi és Szociális Fejlesztési Ügynökség Krasznojarszk Állami Orvosi Akadémia"

Oroszország, Krasznojarszk,

A PCR diagnosztika alapelvei

ABSZTRAKT

szakaszok, 34 oldal, 5 ábra, 5 hivatkozás

Jelen munka célja a PCR-módszer alapelveinek és technológiai sajátosságainak rövid összefoglalása, tudományos és gyakorlati alkalmazása a fertőző betegségek diagnosztizálásában.

A HAGYOMÁNYOS RÖVIDÍTÉSEK LISTÁJA

HCV - hepatitis C vírus

dATP - dezoxiadenozin-trifoszfát

dGTP - dezoxiguanozin-trifoszfát

dNTP - dezoxinukleotid-trifoszfát

dTTP - dezoxitimidin-trifoszfát

dCTP - dezoxicitozin-trifoszfát

DNS - dezoxiribonukleinsav

PCR - polimeráz láncreakció

RNS - ribonukleinsav - immunglobulin osztály GTime PCR - valós idejű PCR módszer

BEVEZETÉS

A PCR-MÓDSZER ELVE

A PCR-ANALÍZIS SZAKASZAI

VALÓS idejű PCR MÓDSZER

A PCR MÓDSZER ELŐNYEI

A PCR-MÓDSZER KORLÁTAI

A PCR-MÓDSZER ALKALMAZÁSA

KÖVETKEZTETÉS

A HASZNÁLT HIVATKOZÁSOK JEGYZÉKE

BEVEZETÉS

A polimeráz láncreakció (PCR) módszer felfedezése az elmúlt évtizedek egyik legfigyelemreméltóbb fejleményévé vált a molekuláris biológia területén. Ez lehetővé tette az orvosi diagnosztika minőségileg új szintre emelését. A polimeráz láncreakciós módszer elvét Carrie Mullis dolgozta ki 1983-ban. A PCR-analízis fejlesztéséért K. Mullis 1993-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

A PCR felfedezése után nagyon gyorsan bevezették a gyakorlatba. A módszer olyan népszerűvé vált, hogy ma már nehezen képzelhető el a molekuláris biológia területén való munka a használata nélkül. A PCR módszer különösen gyors fejlődésen ment keresztül a nemzetközi Human Genome programnak köszönhetően. Modern lézeres szekvenálási technológiákat (DNS nukleotidszekvenciák dekódolása) hoztak létre. Ha a közelmúltban egy hetet vett igénybe egy 250 nukleotidpárból (bp) álló DNS-szekvencia megfejtése, a modern lézerszekvenátorok akár 5000 bp-t is képesek meghatározni. egy napon belül. Ez pedig hozzájárul a DNS-szekvenciákat tartalmazó információs adatbázisok jelentős növekedéséhez. Jelenleg a PCR különféle módosításait javasolták, bemutatták a mikroorganizmusok kimutatására és a pontmutációk azonosítására szolgáló tesztrendszerek létrehozásának lehetőségét, és a módszer több tucat lehetséges alkalmazását ismertették.

A PCR módszer megjelenése a molekuláris genetika területén elért eredményeknek köszönhető, elsősorban számos mikroorganizmus genomjának nukleotidszekvenciájának dekódolásának. Meg kell jegyezni, hogy ezt a felfedezést bizonyos technológiák fejlesztése kísérte. Különösen olyan eszközök megjelenése, amelyek lehetővé teszik az egyszálú DNS-fragmensek (oligonukleotidok) automatikus szintetizálását. Ugyanebben az időszakban fedezték fel a gejzírekben élő egyedülálló mikroorganizmusokat. Enzimatikus rendszerük, különösen a DNS-polimeráz, ellenáll magas hőmérsékletek meleg források, és megőrzi biológiai aktivitását 95°C-ig, ami szükséges feltétel polimeráz láncreakció végrehajtásához.

A polimeráz láncreakció jelenleg a legfejlettebb diagnosztikai módszer a molekuláris biológiában, molekuláris genetikában és klinikai gyakorlatban. laboratóriumi diagnosztika, amely lehetővé teszi számos fertőző betegség kórokozójának egyetlen sejtjének azonosítását a szövetekben és a test biológiai folyadékaiban.

A PCR-módszer a kórokozó genomiális DNS-ének vagy RNS-ének egy szakaszának komplementer befejezésén alapul, amelyet hőstabil DNS-polimeráz enzim segítségével in vitro hajtanak végre. A módszer specifitását a kimutatott fertőző ágensek genetikai anyagának egyedisége határozza meg, amelyhez az amplifikációs folyamatban résztvevő oligonukleotid primereket kiválasztjuk.

Fertőző betegségek diagnosztizálása, beleértve a nehezen termeszthető kórokozókat is, a mikroorganizmusok genotipizálása, virulenciájának felmérése, a mikroflóra antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának meghatározása, prenatális diagnosztika, vérkészítmények biológiai monitorozása - ez az orvostudomány területeinek hiányos listája PCR segítségével. Ma is a PCR-elemzés a legelterjedtebb és legdinamikusabban fejlődő technológia. Évente több tucat új PCR-elemzési tesztrendszer jelenik meg a piacon, amelyek egyrészt különböző betegségeket okozó mikroorganizmusok nukleotidszekvenciájának azonosítására, másrészt emberi gének tanulmányozására szolgálnak. A PCR analízis költsége folyamatosan csökken, ami hozzájárul a módszer egyre szélesebb körű elterjedéséhez az orvosi és diagnosztikai intézményekben. A PCR-laboratóriumok száma a FÁK-országokban növekszik geometriai progresszióés úgy tűnik, a közeljövőben a PCR-elemzés az egyik leggyakoribb laboratóriumi diagnosztikai módszer lesz.

1. A PCR-MÓDSZER ELVE

A polimeráz láncreakció egy olyan módszer, amely utánozza a természetes DNS-replikációt, és lehetővé teszi egyetlen specifikus DNS-molekula kimutatását több millió más molekula jelenlétében.

A módszer lényege, hogy egy kémcsőben ismételten lemásolják (amplifikálják) a DNS bizonyos szakaszait ismételt hőmérsékleti ciklusok során. Minden egyes amplifikációs ciklusban a korábban szintetizált fragmentumokat a DNS-polimeráz ismét lemásolja. Ennek köszönhetően többszörösen megnövekszik a specifikus DNS-fragmensek száma, ami nagyban leegyszerűsíti a további elemzést.

A PCR-módszer természetes folyamaton alapul - a DNS-mátrix komplementer kiegészítésén, amelyet a DNS-polimeráz enzim segítségével hajtanak végre. Ezt a reakciót DNS-replikációnak nevezik.

A természetes DNS-replikáció több szakaszból áll:

) DNS-denaturáció (a kettős hélix feltekercselése, a DNS-szálak divergenciája);

) Rövid, kétszálú DNS szakaszok kialakítása (a DNS szintézis elindításához szükséges primerek);

) Új DNS-szál szintézise (mindkét szál komplementer befejezése).

Ezzel az eljárással a DNS rövid szakaszainak másolatai készíthetők, amelyek specifikusak bizonyos mikroorganizmusokra, pl. célzott kutatást végezni az ilyen specifikus területeken, ami a géndiagnosztika célja a fertőző betegségek kórokozóinak azonosítása.

A hőstabil DNS polimeráz (Taq polimeráz) felfedezése termofil baktériumokból Thermisaquaticus, melynek optimuma a 70-72°C tartományban van, lehetővé tette a DNS-replikáció folyamatának ciklikussá tételét és in vitro munkára való felhasználását. A programozható termosztátok (erősítők) létrehozása, amelyek adott program szerint ciklikus hőmérséklet-változásokat hajtanak végre, megteremtették az előfeltételeket a PCR-módszer laboratóriumi gyakorlatba való széles körű bevezetéséhez. klinikai diagnosztika. A szintézisciklusok többszöri ismétlésével egy adott DNS-fragmens másolatainak száma exponenciálisan megnövekszik, ami lehetővé teszi azonosításukhoz elegendő számú DNS-másolat előállítását kis mennyiségű elemzett anyagból, amely egyes sejteket tartalmazhat. mikroorganizmusok.

A komplementer lánc befejezése nem a DNS-szekvencia bármely pontján kezdődik, hanem csak bizonyos kiindulási blokkokban - rövid, kétszálú szakaszokban. Az ilyen blokkokat a DNS meghatározott szakaszaihoz kapcsolva csak ezen a szakaszon lehet egy új lánc szintézisének folyamatát irányítani, nem pedig a DNS-lánc teljes hosszában. Adott DNS-szakaszokban kiindulási blokkok létrehozásához két oligonukleotid primert (20 nukleotidpár), úgynevezett primereket használnak. A primerek komplementerek egy adott fragmens bal és jobb oldali határán lévő DNS-szekvenciákkal, és úgy vannak orientálva, hogy egy új DNS-lánc kiteljesedése csak közöttük történik.

Így a PCR egy specifikus DNS-régió kópiaszámának többszörös növekedése (amplifikációja), amelyet a DNS-polimeráz enzim katalizál.

. A PCR-ANALÍZIS SZAKASZAI

A PCR módszerrel végzett elemzési eljárás három szakaszból áll:

1. DNS (RNS) izolálása klinikai mintából;

2. Specifikus DNS-fragmensek amplifikációja;

. Erősítő termékek kimutatása.

. DNS (RNS) izolálás

Az elemzés ezen szakaszában a klinikai mintát speciális feldolgozásnak vetik alá, melynek eredményeként a sejtanyag lizálódik, a fehérje- és poliszacharid-frakciókat eltávolítják, és inhibitoroktól mentes DNS- vagy RNS-oldatot kapnak. további erősítés. A DNS (RNS) extrakciós technika megválasztását elsősorban a feldolgozott klinikai anyag természete határozza meg.

2. Specifikus DNS-fragmensek amplifikációja

Ebben a szakaszban rövid specifikus DNS-fragmensek halmozódnak fel a további kimutatáshoz szükséges mennyiségben.

A polimeráz láncreakció végrehajtásához a reakcióelegyben számos komponensnek jelen kell lennie:

· Alapozók- mesterségesen szintetizált oligonukleotidok, amelyek mérete általában 15-30 bp között van, és azonosak a cél-DNS megfelelő szakaszaival. Kulcsszerepet játszanak az amplifikációs reakciótermékek képződésében. A megfelelően kiválasztott primerek biztosítják a tesztrendszer specificitását és érzékenységét.

· Taq polimeráz- hőstabil enzim, amely biztosítja a 3 - a DNS második szálának vége a komplementaritás elve szerint.

· Dezoxinukleotid-trifoszfátok (dNTP-k) keveréke- dezoxiadenozin-trifoszfát (dATP), dezoxiguanozin-trifoszfát (dGTP), dezoxicitozin-trifoszfát (dCTP) és dezoxitimidin-trifoszfát (dTTP) - a Taq polimeráz által a DNS második szálának szintéziséhez használt „építőanyag”.

· Puffer -kationok és anionok keveréke bizonyos koncentrációban, feltéve optimális feltételeket a reakcióhoz, valamint a stabil pH-érték.

· Elemzett minta- a reakcióelegyhez való hozzáadásra előkészített készítmény, amely tartalmazhatja a kívánt DNS-t, például mikroorganizmusok DNS-ét, amely célpontként szolgál a későbbi ismételt másoláshoz.

1. ábra A reakcióelegy komponensei

Minden amplifikációs ciklus 3 szakaszból áll, amelyek különböző hőmérsékleti körülmények között fordulnak elő:

1. szakasz:A DNS denaturációja (a kettős hélix fonástalanítása). 93-95°C-on 30-40 másodpercig fordul elő.

Az egyik áramkör (+) fő mátrixként szolgál. Öt rúdvégét a DNS-polimeráz enzim rögzíti, amely biztosítja az elsővel komplementer második DNS-szál felépítését az egyes nukleotidokból. Ugyanez történik, csak ellenkező irányban, a második DNS-szálon, azonban mivel a DNS-molekula letekercselése fordított sorrendben történik, az új szál kis fragmentumokból épül fel, amelyeket aztán összefűznek. Ahhoz, hogy a DNS-polimeráz enzim megkezdhesse munkáját, mag vagy primer jelenléte szükséges - egy kis egyszálú DNS-fragmens, amely az egyik szülő DNS-szál komplementer régiójához kapcsolva kiindulási blokkot képez. a leányszál termesztéséért.

2. szakasz:Alapozók rögzítése (analing). A primerek kapcsolódása a megfelelő szekvenciákkal komplementeren megy végbe az ellentétes DNS-szálakon egy adott régió határain. Minden alapozópárnak megvan a maga lágyítási hőmérséklete, melynek értéke 50-65°C között van. A precízen kiszámított és kísérletileg igazolt primer csatolási hőmérséklet az egyik jellemző, amely meghatározza a reakció specifitását, kizárva a primerek nem teljesen komplementer szekvenciákhoz való kötődését.

Mivel a leány DNS-szálak növekedése az anyai DNS mindkét szálán egyidejűleg is megtörténhet, a második szálon lévő DNS-polimeráznak is szüksége van saját primerre. Így két primert adunk a reakcióelegyhez. Valójában a primerek, amelyek a DNS-molekula ellentétes szálaihoz kapcsolódnak, korlátozzák a DNS-molekula azon részét, amely a későbbiekben sokszorosodik vagy amplifikálódik. Az ilyen DNS-fragmenseket amplikonoknak nevezzük. Egy amplikon hossza több száz nukleotid lehet. Egy pár primer cseréjével az egyik kórokozó elemzésétől áttérhetünk egy másik kórokozó elemzésére.

Izzítási idő -20-60 mp.

3. szakasz:DNS-láncok kiteljesedése (elongáció).

A másolási mechanizmus olyan, hogy a szálak komplementer addíciója nem kezdődhet meg a DNS-szekvencia bármely pontján, hanem csak bizonyos kiindulási blokkokban (rövid kétszálú szakaszok). A kiindulási blokkok létrehozásához a DNS adott szakaszaiban primereket használnak, amelyek körülbelül 20 bp hosszúságú oligonukleotidok, más néven primerek. Komplementerek egy adott fragmens bal és jobb oldali határán lévő DNS-szekvenciákkal, és úgy vannak orientálva, hogy a DNS-polimeráz által végrehajtott DNS-szintézis csak közöttük megy végbe.

A DNS-láncok komplementer befejezése a lánc 5'-végétől a 3'-végéig, ellentétes irányban, a primer kapcsolódási helyeitől indul. Az új DNS-láncok szintézisének anyaga a bevezetett dezoxiribonukleotid-foszfát. Ezt a folyamatot a Tag polimeráz enzim katalizálja. A szintézis első ciklusában képződött új DNS a második ciklus kiindulási anyagaként szolgál, amelyben a kívánt specifikus DNS-fragmens (amplikon) keletkezik stb.

2. ábra A DNS-amplifikáció elve

Jelenleg számos módszert alkalmaznak a minta PCR-re való előkészítésére. A minta-előkészítési eljárás magában foglalja a mikrobiális lízist és extrakciót nukleinsav. A mikrobiális sejt elpusztítására egyszerű forralás, lizozim jelenlétében történő fagyasztás-olvasztás, valamint speciális detergenseket és proteinázt tartalmazó lízispufferek használatosak. A módszer megválasztását általában a mikroba természete, pontosabban a mikroba természete határozza meg. sejtfal. A B. R. Marmionetal által leírt, tiszta DNS-készítmény előállítására szolgáló módszer standardnak számít, és már klasszikussá vált. (1993). Ez enzimatikus proteolízist foglal magában, amelyet fehérjementesítés és a DNS alkohollal történő kicsapása követ. Ez a módszer lehetővé teszi a tiszta DNS-készítmény előállítását, de meglehetősen munkaigényes, és olyan agresszív és erős szagú anyagokkal dolgozik, mint a fenol és a kloroform.

Az egyik legnépszerűbb az R. Boometal által javasolt DNS-kivonási módszer. (1990), egy erős lizálószer - guanidin-tiocianát (GuSCN) felhasználásán alapul a sejtlízishez és a DNS későbbi szorpciójához egy hordozón (üveggyöngyök, kovaföld, üveg „tej” stb.). Mosás után a DNS a mintában marad, a hordozón szorbeálódik, ahonnan elúciós puffer segítségével könnyen eltávolítható. A módszer kényelmes, technológiailag fejlett és alkalmas minta amplifikációra való előkészítésére. A DNS-vesztés azonban lehetséges a hordozón történő visszafordíthatatlan szorpció miatt, valamint számos mosás során. Ez különösen fontos, ha egy mintában kis mennyiségű DNS-sel dolgozunk. Ráadásul a GuSCN nyomokban is gátolhatja a PCR-t, így ennek a módszernek a használatakor nagyon fontos a szorbens helyes megválasztása és a technológiai árnyalatok gondos betartása. Megjegyzendő, hogy az oldatok adagolásának és eltávolításának nagy száma miatt a minta kezelésekor óvatosan kell eljárni, mivel lehetséges a minták és a keletkező DNS-aeroszol közötti keresztszennyeződés.

A fenol-kloroform DNS extrakció klasszikus eljárásával jó DNS-tisztulás érhető el, elsősorban Tag polimeráz gátlóktól, de elkerülhetetlen a nagy nukleinsavveszteség, különösen akkor, ha kis mintákkal dolgozunk, alacsony koncentrációjú fertőző ágenssel.

A minta-előkészítési módszerek másik csoportja olyan ioncserélők használatán alapul, mint a Chilex (USA), amelyek az üvegtől eltérően nem DNS-t, hanem a reakciót zavaró szennyeződéseket szorbeálják. Ez a technológia általában két szakaszból áll: a minta felforralását és a szennyeződések szorpcióját egy ioncserélőn. A módszer rendkívül vonzó a kivitelezés egyszerűsége miatt. A legtöbb esetben alkalmas klinikai anyagokkal való munkavégzésre. Sajnos néha előfordulnak olyan szennyeződéseket tartalmazó minták, amelyeket nem lehet ioncserélővel eltávolítani. Ezenkívül egyes mikroorganizmusokat nem lehet elpusztítani egyszerű forralással. Ezekben az esetekben a mintafeldolgozás további szakaszait kell bevezetni.

A tömeges szűrés során, amikor fontos a statisztikai adatok beszerzése, lehetőség van egyszerű módszerek alkalmazására mosószerekkel vagy biológiai anyagok lúgokkal történő kezelésével, majd semlegesítésével. Ugyanakkor az ilyen módszerek alkalmazása a klinikai diagnosztikában hamis negatív eredményekhez vezethet, mivel rossz minőségű DNS-készítményt használnak a reakcióelegyben. Ezért a minta-előkészítési módszer kiválasztását a tervezett elemzés céljának megértése mellett kell figyelembe venni.

A következő eljárás - amplifikáció - során a kórokozó DNS-ét tartalmazó mintát egy kis kémcsőbe vezetjük, amely tartalmazza a polimeráz reakciót biztosító komponenseket, kétféle primert, két enzimet (Tag polimeráz és N-uracil glikoláz) és négyféle nukleotid A, G, Ts, U. A polimeráz reakció végrehajtásához speciális eszközt (termikus ciklust vagy DNS-erősítőt) használnak, amely lehetővé teszi a reakcióelegy hőmérsékletének automatikus megváltoztatását egy bizonyos program szerint. A PCR első körében a mintát 94 °C-ra melegítjük, hogy elválassza a két komplementer DNS-szálat. A hőmérséklet ezután 40-60 °C-ra csökken, ekkor a primerek egyetlen DNS-szálhoz kapcsolódnak, majd a hőmérséklet ismét 72 °C-ra emelkedik, amikor a polimeráz aktivitás a legkifejezettebb. A teljes ciklus hőmérséklet-változásokkal kevesebb, mint 3 percig tart.

A PCR eredmények helyes értékeléséhez fontos megérteni, hogy ez a módszer nem kvantitatív. Elméletileg az egyedi cél-DNS-molekulák amplifikációs termékei 30-35 ciklus után elektroforézissel kimutathatók. A gyakorlatban azonban ez csak olyan esetekben valósul meg, amikor a reakció az ideálishoz közeli körülmények között megy végbe, ami ritka. Az amplifikáció hatékonyságát különösen nagyban befolyásolja a DNS-preparátum tisztasági foka, pl. bizonyos inhibitorok jelenléte a reakcióelegyben, amelyektől bizonyos esetekben rendkívül nehéz megszabadulni. Előfordul, hogy jelenlétük miatt több tízezer cél-DNS-molekula sem amplifikálható. Így gyakran nincs közvetlen kapcsolat a cél DNS kezdeti mennyisége és az amplifikációs termékek végső mennyisége között.

Különféle módszereket alkalmaznak az amplifikációs eredmények megjelenítésére. Ma a legelterjedtebb az elektroforézis, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. Ehhez készítsünk egy lemezt agarózgélből, amelyet elektroforézispufferben 1,5-2,5% koncentrációban egy speciális DNS-festék, például etidium-bromid hozzáadásával agaróz megszilárdít. A megszilárdult agaróz térhálót képez. Fésűvel történő öntéskor speciális lyukak képződnek a gélben, amelyekbe ezt követően amplifikációs termékeket adnak. A géllemezt vízszintes gélelektroforézis készülékbe helyezzük, és a forrást csatlakoztatjuk DC feszültség. A negatív töltésű DNS mínuszból pluszba kezd mozogni a gélben. Ebben az esetben a rövidebb DNS-molekulák gyorsabban mozognak, mint a hosszabbak. A DNS mozgásának sebességét a gélben befolyásolja az agaróz koncentrációja, az elektromos térerősség, a hőmérséklet, az elektroforézis puffer összetétele és kisebb mértékben a DNS összetétele. Minden azonos méretű molekula azonos sebességgel mozog. A festéket sík csoportok építik be (interkalálják) a DNS-molekulákba. A 10 perctől 1 óráig tartó elektroforézis befejezése után a gélt egy transzilluminátor szűrőre helyezzük, amely ultraibolya tartományban (254-310 nm) bocsát ki fényt. A DNS által 260 nm-en elnyelt ultraibolya energia átkerül a festékre, ami a látható spektrum narancsvörös tartományában (590 nm) fluoreszkál.

A kívánt mikroorganizmus DNS standardját „pozitív kontrollként” használjuk. A nem specifikus amplikonok mérete lehet nagyobb vagy kisebb a „pozitív kontrollhoz képest”. A legrosszabb esetben ezek a méretek egybeeshetnek, és az elektroforézis során pozitívnak számítanak.

A „pozitív kontroll” lehetővé teszi, hogy megbizonyosodjon arról, hogy a reakcióelegyben lévő összes komponens biztosítja a reakció normális lefolyását. Ugyanakkor egy biológiai anyagból PCR-re készített DNS-készítmény tartalmazhat inhibitor-szennyeződéseket, amelyek jelentősen csökkentik a reakció hatékonyságát, és esetenként a kívánt kórokozó jelenlétében is specifikus amplikonok hiányához vezetnek. A reakciókeverékkel minden kémcsőben nyomon kell követni az amplifikáció előrehaladását, amelyhez egy további, úgynevezett „belső kontrollt” használnak, amely bármely olyan DNS-standard, amely eltér a kívánt mikroorganizmus DNS-étől.

A fertőző tesztrendszerekhez esetenként például a p-globin gént alkalmazzák, amelynek végére géntechnológiai manipulációkkal a tesztrendszerben szereplő primerekkel homológ DNS-szakaszokat varrnak. Ha „belső kontrollt” adnak a reakcióelegyhez, akkor az ugyanazon célpont lesz a primer-illesztésnél, mint a kívánt fertőző ágens kromoszómális DNS-e. A belső kontroll amplifikációs termék méretét úgy választjuk meg, hogy kétszer vagy többször nagyobb legyen, mint a kívánt mikroorganizmus-DNS amplifikációjából képződött amplikonok. Ennek eredményeként, ha „belső kontroll” DNS-t adunk a reakcióelegyhez a vizsgált mintával együtt, akkor függetlenül attól, hogy mikroorganizmus van a biológiai mintában, a „belső kontroll” specifikus amplikonok képződését okozza, de lényegesen hosszabb (nehezebb), mint a mikroorganizmus amplikonja. A nehéz amplikonok jelenléte a reakcióelegyben az amplifikációs reakció normális lefolyását és az inhibitorok hiányát jelzi. Ha nem képződnek megfelelő méretű és „belső kontroll” amplikonok, arra a következtetésre juthatunk, hogy a vizsgált mintában vannak nemkívánatos szennyeződések, amelyeket el kell távolítani, de nem a kívánt DNS hiányáról.

Ennek a megközelítésnek a vonzereje ellenére van egy jelentős hibája. Így, ha a kívánt DNS jelen van a reakcióelegyben, akkor az amplifikáció hatékonysága meredeken csökken a primerek „belső kontrolljával” való versengés miatt. Ez alapvetően fontos a vizsgálati minta alacsony DNS-koncentrációja esetén, és hamis negatív eredményekhez vezethet. Mindazonáltal, feltéve, hogy a primerekért való versengés problémáját megoldják, az amplifikációs hatékonyság ellenőrzésének ez a módszere minden bizonnyal nagyon hasznos lesz.

3. ábra A DNS-amplifikáció második ciklusa

. Erősítő termékek kimutatása

). Vízszintes elektroforézis módszer

Az amplifikációs eredmények megjelenítésének egyik módszere az elektroforézis módszer, amely a DNS-molekulák méret szerinti szétválasztásán alapul. A legtöbb módszernél ebben a szakaszban a 2. szakaszban kapott amplifikációs termékek keverékét vízszintes elektroforézissel választják el agaróz gélben. Az elektroforetikus elválasztás előtt az amplifikációs keverékhez etidium-bromid oldatot adnak, amely kétszálú DNS-fragmensekkel erős intersticiális vegyületeket képez. Ezek a vegyületek képesek fluoreszkálni UV-sugárzás hatására, amely az amplifikációs keverék agarózgélben történő elektroforetikus elválasztása után világító sávok formájában rögzíthető. Az erősítési terméksávok fényereje változhat. Ezért a PCR laboratóriumokban gyakran szokás az eredményt három-, négy-, ill ötpontos rendszer. Ez azonban nem hozható kapcsolatba a mintában lévő cél DNS kezdeti mennyiségével. Gyakran a sávok fényerejének csökkenése az amplifikációs hatékonyság csökkenésével jár, inhibitorok vagy más tényezők hatására.

4. ábra Az amplifikációs termékek kimutatása horizontális elektroforézissel

). Függőleges elektroforézis módszer

A vertikális elektroforézis módszere alapvetően hasonló a horizontális elektroforézishez. Különbségük az, hogy ebben az esetben agaróz helyett poliakrilamidot használnak. ben hajtják végre speciális kamera függőleges elektroforézishez. A poliakrilamid gélelektroforézis nagyobb felbontású, mint az agaróz elektroforézis, és lehetővé teszi a különböző méretű DNS-molekulák megkülönböztetését egy nukleotid pontossággal. A poliakrilamid gél előállítása valamivel bonyolultabb, mint az agaróz gél. Ezenkívül az akrilamid mérgező anyag. Mivel az amplifikációs termék méretének 1 nukleotid pontosságú meghatározásának igénye ritkán merül fel, ezt a módszert nem alkalmazzák a rutinmunkában.

3). Hibridizációs szonda módszer

Az elektroforetikus kimutatási módszer alternatívájaként, amelynek van néhány hátránya: szubjektivitás az eredmények leolvasásában, korlátok a különböző mikroorganizmusok DNS-ének egy reakcióban történő meghatározásában, hibridizációs kimutatási sémák javasolhatók. Ezekben a sémákban az amplifikáció eredményeként képződött DNS-fragmens hibridizál (kétszálú komplexeket - „hibrideket) képez” egy specifikus oligonukleotid próbával. Az ilyen komplexek regisztrálása történhet kolorimetriásan vagy fluorimetriásan.

3. VALÓS idejű PCR MÓDSZER (valós idejű PCR)

A Real-Time PCR módszer lehetővé teszi az amplifikációs termékek detektálását a reakció során és az amplikon felhalmozódás kinetikájának nyomon követését. A PCR-termék kimutatására fluoreszcens festékeket használnak, amelyek a PCR-termék mennyiségével egyenesen arányos fluoreszcenciát biztosítanak – riporter fluoreszcenciát. A létrehozásának mechanizmusai a valós idejű PCR adott típusától függően változnak.

A „Riporter fluoreszcencia szintje – amplifikációs ciklus” koordinátákban lévő kinetikai görbe S-alakú.

Három szakaszra osztható:

1.Kezdeti szakasz (amikor a PCR-termékeket még nem észleli a fluoreszcens jelölés).

2.Exponenciális szakasz (amelyben a fluoreszcencia mennyisége exponenciálisan függ a PCR ciklustól).

.Plateau (telítettségi szakasz).

5. ábra A fluoreszcencia kinetikai görbéjének grafikonja valós idejű PCR segítségével

A fluoreszcens jel regisztrálása az erősítési folyamat során egy speciális eszközön történik - egy hőcikluson a valós idejű PCR-hez. A fluoreszcens jel intenzitásának növekedése alapján az erősítőhöz mellékelt szoftver segítségével kiszámítjuk a kezdeti DNS-templát koncentrációját.

A valós idejű PCR módszer előnyei

n az amplifikációs termékek felhalmozódásának közvetlen kimutatásának képessége az amplifikáció során;

n alapvető előnye az amplikonok felhalmozódásának a cső kinyitása nélkül történő észlelése, ami minimálisra csökkenti a téves pozitív eredmények kockázatát a minták és a reagensek amplifikációs termékekkel való szennyeződése miatt;

n a vizsgálati mintával végzett manipulációk számának jelentős csökkenése csökkenti az időt, leegyszerűsíti az elemzést és csökkenti a hibák valószínűségét;

n Ez a megközelítés lehetővé teszi az elektroforézis szakaszának kiküszöbölését, ami a vizsgálati minták amplifikációs termékekkel való szennyeződésének valószínűségének éles csökkenéséhez vezet;

n a PCR-laboratóriumok követelményeinek csökkentése;

n a PCR-vizsgálat eredményeinek értelmezésének objektivitásának növelése, mivel a feldolgozás az eszköz szoftverével történik;

n A teljes kutatási idő jelentősen, csaknem felére csökken, ami lehetővé teszi az eredmények megszerzését a klinikai anyag laboratóriumba érkezése után 1,5-2 órán belül;

n Ez a módszer először teszi lehetővé egy mikroorganizmus DNS-tartalmának mennyiségi meghatározását klinikai mintában;

n a hibridizációs próbák alkalmazása primerekkel együtt növeli az analízis specifitását;

n a több hibridizációs DNS-próbából származó fluoreszcens jel független egyidejű regisztrálásának lehetősége lehetővé teszi ugyanazon vagy különböző DNS-célpontok több különböző régiójának azonosítását egy vizsgálat során.

. A PCR MÓDSZER ELŐNYEI

n A fertőző betegségek kórokozóinak közvetlen azonosítása

A PCR-módszer közvetlenül jelzi a kórokozó egy specifikus DNS-fragmensének jelenlétét a betegtől vett anyagban.

n A PCR magas specificitása

A PCR-módszer segítségével a vizsgált anyagból olyan DNS-fragmenst izolálnak, amely egy adott kórokozóra – baktériumra vagy vírusra – egyedi. Ez a DNS-szakasz egyedülálló, és nem jellemző egyetlen földi fertőzésre sem. A specifitást a primerek nukleotidszekvenciája határozza meg, ami kiküszöböli a hamis eredmények megszerzésének lehetőségét, ellentétben az enzimkapcsolt immunszorbens vizsgálati módszerrel, ahol gyakoriak a keresztreagáló antigének miatti hibák.

n Nagy érzékenységű PCR

A PCR módszer lehetővé teszi akár egyetlen baktérium- vagy vírussejt kimutatását is. A PCR diagnosztika olyan esetekben észleli a fertőző betegségek kórokozóinak jelenlétét, amikor ez más módszerrel (immunológiai, bakteriológiai, mikroszkópos) nem végezhető el. A PCR analízis érzékenysége mintánként 10-1000 sejt (az immunológiai és mikroszkópos tesztek érzékenysége 103-105 sejt).

n A PCR sokoldalúsága

Mivel a kórokozó bármilyen biológiai váladékban és szövetben megtalálható, a PCR-kutatásban szinte bármilyen anyag felhasználható, beleértve azokat is, amelyek más módszerekkel történő kutatáshoz hozzáférhetetlenek - nyálka, vizelet, vér, szérum, köpet, ejakulátum, hámsejt-kaparék.

n A PCR-elemzési eredmények nagy sebessége

A PCR-elemzés nem igényli a kórokozó tenyészetének izolálását és termesztését, ami sok időt vesz igénybe. A bioanyag feldolgozásának és a reakciótermékek kimutatásának egységes módszere, valamint az amplifikációs folyamat automatizálása lehetővé teszi a teljes elemzés elvégzését 4-4,5 óra alatt.

n Képes bármilyen típusú fertőzés diagnosztizálására

A PCR-módszer nagy érzékenysége lehetővé teszi a fertőzések diagnosztizálását nemcsak a betegség akut stádiumában, hanem a krónikus fertőzések, sőt akár egyetlen baktérium vagy vírus jelenlétét is.

Jelenleg a PCR-elemzés előnye a mikroorganizmusok kimutatására szolgáló tenyésztési módszerrel szemben a következő:

A mikroba nagyobb észlelési gyakorisága, amely 6-7% -kal meghaladja ugyanazt a mutatót a tenyésztési módszer alkalmazásakor. Ezeket a különbségeket a mikroba esetleges elpusztulása magyarázza a tárolás és szállítás során, míg a PCR képes kimutatni a mikroorganizmus nem életképes formáit.

A tenyésztési módszerrel a kórokozó kimutatásához szükséges idő körülbelül 4 nap, míg a PCR alkalmazása 4-5 óra alatt teszi lehetővé a mikroba kimutatását.

A PCR technológia alkalmazása lehetővé teszi a kórokozók, például a chlamydia kimutatását nem invazív módon vett mintákban, például vizeletben.

A PCR módszer különösen hatékony a mikroorganizmusok nehezen tenyészthető, tenyészthetetlen és perzisztens formáinak diagnosztizálására, amelyek gyakran előfordulnak látens és krónikus fertőzésekben, mivel ezzel a módszerrel elkerülhetők az ilyen mikroorganizmusok laboratóriumi körülmények között történő tenyésztésével járó nehézségek.

n Lehetőség a kivitelezésre a terápia hatékonyságának nyomon követése és értékelése, különösen a vírusos betegségek esetében.

n Felismerési lehetőség vírusok és baktériumok egyes altípusai és törzsei.

n Meghatározási lehetőség többféle kórokozó (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) egy tubusból biológiai anyaggal.

Ez a módszer munkaintenzitásában összevethető a klasszikus módszerekkel (enzim immunoassay, immunofluoreszcencia stb.), de megbízhatóbb diagnosztikai információt nyújt, lehetővé téve a fertőző ágens DNS-ének vagy RNS-ének közvetlen kimutatását a klinikai anyagokban. Ezért a PCR módszert a tenyésztési módszerrel együtt a fertőző betegségek diagnosztizálásának „arany standardjaként” ismerik el.

5. A PCR-MÓDSZER KORLÁTAI

· A reakció során mind az élő, mind az elhalt mikroorganizmusok DNS-e felerősödik

· Keresztreakció lehetősége

A primerek kiválasztása az adott és hasonló mikroorganizmusok genomjára vonatkozó meglévő ismereteken alapul. Elméletileg fennáll annak a lehetősége, hogy ugyanaz a fragmentum más mikroorganizmusokban is jelen van, amelyek genomját jelenleg nem sikerült megfejteni, és amelyeket nem vizsgáltak a keresztreakció lehetőségére. Az ilyen mikroorganizmusok jelenléte a mintában hamis pozitív teszteredményhez vezethet.

· A mikroorganizmusok változékonysága

Bár a tesztrendszer felépítése során az amplifikációhoz használt genomfragmenst egy erősen konzervált régióból választják ki, a mikroorganizmusok variabilitása oda vezethet, hogy a vizsgált kórokozó egyes genotípusai vagy törzsei mutációkat szerezhetnek a genom amplifikált régiójában. , és így megfoghatatlanná válik ennek a tesztrendszernek.

Az utolsó két pont fontos a PCR diagnosztikai készletek fejlesztői számára. Mostanra szabványokat dolgoztak ki a vizsgálatok mennyiségének szabályozására (beleértve a keresztreakciók vizsgálatát, valamint a kimutatott kórokozó ismert törzseinek tesztelését), amelyeken a tesztrendszernek át kell mennie, mielőtt piacra kerülne.

6. A PCR-MÓDSZER ALKALMAZÁSA

polimeráz diagnosztika fertőző betegség

A PCR-t számos területen használják elemzésre és tudományos kísérletekre:

1. kriminalisztika

A PCR-t az úgynevezett „genetikai ujjlenyomatok” összehasonlítására használják. A tetthelyről származó genetikai anyag mintája szükséges – vér, nyál, sperma, haj stb. Ezt összehasonlítják a gyanúsított genetikai anyagával. Nagyon kis mennyiségű DNS elég, elméletileg egy másolat. A DNS-t fragmensekre bontják, majd PCR-rel amplifikálják. A fragmenseket DNS-elektroforézissel választjuk el. A DNS-sávok elrendeződésének eredő mintáját genetikai ujjlenyomatnak nevezzük.

2. az apaság megállapítása

Az apa-gyermek-anya PCR-rel amplifikált DNS-fragmensek elektroforézisének eredményeit elemezve kiderül, hogy a gyermek mindkét szülő genetikai lenyomatának bizonyos jellemzőit örökli, ami egyedi lenyomatot ad. Bár a genetikai ujjlenyomatok egyediek (kivéve az egypetéjű ikrek esetét), több ujjlenyomat vételével mégis családi kapcsolatok létesíthetők. Ugyanez a módszer kismértékben módosítva is alkalmazható az élőlények közötti evolúciós rokonság megállapítására.

3. orvosi diagnosztika

A PCR jelentősen felgyorsítja és megkönnyíti az örökletes és vírusos betegségek. A kérdéses gént PCR-rel amplifikálják megfelelő primerek alkalmazásával, majd szekvenálják a mutációk azonosítására. A vírusfertőzések közvetlenül a fertőzés után, hetekkel vagy hónapokkal a tünetek megjelenése előtt észlelhetők.

4. génklónozás

A génklónozás a gének izolálásának és a géntechnológiai manipulációk eredményeként az adott gén termékének nagy mennyiségének kinyerésének folyamata. A PCR-t egy gén amplifikálására használják, amelyet azután egy vektorba inszertálnak – egy olyan DNS-darabba, amely egy idegen gént visz át ugyanabba a termesztésre alkalmas másik szervezetbe. Például plazmidokat vagy virális DNS-t használnak vektorként. A gének idegen szervezetbe történő beépítését általában az adott gén termékének - RNS-nek vagy leggyakrabban fehérjének - előállítására használják. Ily módon számos fehérjét nyernek ipari mennyiségben, hogy felhasználják a mezőgazdaságban, az orvostudományban stb.

5. DNS szekvenálás

Szekvenálási módszerben fluoreszcensen jelölt ill radioaktív izotóp A dideoxinukleotidok PCR szerves részét képezi, mivel a polimerizáció során a fluoreszcens vagy radioaktív jelzéssel jelölt nukleotidszármazékok beépülnek a DNS-láncba. Ez leállítja a reakciót, lehetővé téve a specifikus nukleotidok helyzetének meghatározását, miután a szintetizált láncok szétválnak a gélben.

6. mutagenezis

Jelenleg a PCR a mutagenezis (a DNS nukleotidszekvenciájának módosítása) végrehajtásának fő módszere. A PCR alkalmazása lehetővé tette a mutagenezis eljárás egyszerűsítését és felgyorsítását, valamint megbízhatóbbá és reprodukálhatóbbá tette.

7. fertőző betegségek diagnosztizálása

A PCR módszer alkalmazása mind bakteriális, mind vírusos természetű fertőző betegségek diagnosztizálására óriási jelentőséggel bír számos mikrobiológiai és epidemiológiai probléma megoldásában. Ennek a módszernek a használata is hozzájárul a fejlesztéshez alapkutatás a krónikus és kevéssé ismert fertőző betegségek tanulmányozása területén.

8. vírusos betegségek diagnosztizálása

A PCR legátfogóbb előnyei a vírusos betegségek diagnosztizálásában a hepatitis C vírus (HCV) által okozott fertőzési folyamat figyelembevételével mutathatók ki. különleges diagnosztikai érték PCR ennek a vírusnak a kimutatására képviseli a következő okok miatt:

) a HCV tenyésztésére szolgáló módszer hiánya; 2) nem léteznek antigéndiagnosztikai készletek; 3) az antitestképződés reakciója a HCV-re olyan lassú, hogy a fertőzés akut fázisában általában nem lehet diagnózist felállítani.

Ezért ma már általánosan elfogadottá válik a PCR technológia alkalmazása a diagnosztikában, a kezelés minőségének ellenőrzésében és a HCV okozta morbiditás epidemiológiai elemzésében.

Ugyanakkor csak a PCR technológia teszi lehetővé a következő problémák megoldását: 1) diagnosztika akut fertőzés a HCV elleni antitestek késői kimutatásával; 2) elvégzi a krónikus hepatitis C etiológiai diagnózisát immunszupprimált betegeknél; 3) értékelje az antivirális terápia hatékonyságát; 4) a virémia kimutatása normál aminotranszferázszintű véradóknál; 5) meghatározza a vérkészítmények lehetséges szennyeződését; 6) értékelje a HCV prevalenciáját.

9. A PCR alkalmazása a pulmonológiában és a ftiziológiában

Az atipikus tüdőgyulladás és a visszatérő krónikus hörghurut gyakori oka a mikoplazmák és a chlamydia. Ezen kórokozók diagnózisa hagyományos módszerek a mikroszkópia és a baktériumtenyésztés hatástalan. A PCR nemcsak a chlamydia és a mycoplasmosis diagnosztizálását teszi lehetővé, hanem a kórokozó fajok azonosítását is (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). A PCR módszer alkalmazása jelentősen javíthatja a tuberkulózis korai diagnózisát. Jelenleg PCR készleteket fejlesztettek ki és jelentek meg a piacon a mikobaktériumok antibiotikumokkal szembeni rezisztenciájának meghatározására.

10. A PCR alkalmazása a vérszolgálati gyakorlatban

A donor vér hepatitis, szifilisz, HIV szerológiai módszerekkel történő vizsgálata nem zárja ki a fertőzött vér felhasználásának veszélyét ezen betegségek bizonyos szeronegatív periódusa miatt, amely a kórokozó megjelenésétől számítva több hétig is eltarthat. vér. A vérvizsgálat leghatékonyabb módszere ezen kórokozók jelenlétére a PCR módszer.

11. PCR alkalmazása a neonatológiában

Terhesség alatt számos mikroorganizmus megfertőzheti a magzatot. Ezek a citomegalovírus, a toxoplazma, a herpeszvírus, a rubeola vírus, a mikoplazma, a chlamydia stb. A szerológiai tesztek alkalmazása ezeknek a fertőzéseknek az újszülötteknél történő meghatározására nem hatékony, mivel a gyermek immunrendszerének kialakulása több hónapon keresztül megy végbe, és egy fertőző ágens nem kísérheti specifikus antitestek termelődését. Másrészt az IgG osztályba tartozó anyai antitestek hosszú ideig jelen lehetnek az újszülött vérében, amelyek képesek áthatolni a placenta gáton. Így a specifikus IgG jelenléte egy gyermekben az élet első hónapjaiban nem jelzi a kórokozó jelenlétét. A PCR analízis alkalmazása jelentősen növeli az újszülöttkori fertőzések diagnosztizálásának lehetőségét, beleértve az intrauterin szakaszt is.

12. PCR alkalmazása az urogynekológiai gyakorlatban

Az urogenitális traktust érintő fertőző ágensek közül az utóbbi időben nagy figyelmet szentelnek a látens és krónikus fertőzések kórokozóinak - a chlamydia és a mycoplasma. Az ezen kórokozók által okozott betegségeket elmosódott klinikai tünetek és krónikus lefolyás jellemzi, ami gyakran a szaporodási funkciók károsodásához - vetéléshez, meddőséghez - vezet. A PCR-módszer Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum kimutatására való alkalmazását vizsgáló számos, különböző országok nagy klinikáin végzett tanulmány kimutatta ennek a módszernek a nagy hatékonyságát. Felismerték, hogy az érzékenység és a hatékonyság tekintetében a PCR felülmúlja az „arany standardként” elfogadott tenyésztési módszert.

KÖVETKEZTETÉS

Így a PCR technológia olyan hatékony eszköz, amely lehetővé teszi a krónikus fertőző folyamatok, valamint a fertőző betegségek kórokozóinak ökológiájának tanulmányozását és diagnosztizálását. A PCR diagnosztikai módszer kiegészíti a már meglévő mikrobiológiai diagnosztikai módszereket, és minőségileg megváltoztatja az orvosi mikrobiológia és epidemiológia alkalmazott problémáinak megoldásának módszertanát.

A fentiek figyelembevételével fogalmazzuk meg a fertőző patológia kutatási területeit, amelyekben a PCR kezd vezető szerepet játszani.

Baktériumok vagy vírusok perzisztenciája által okozott krónikus fertőző állapotok diagnosztizálása. Ez a PCR legkézenfekvőbb alkalmazása diagnosztikai célokra.

A PCR a leghatékonyabb módszer azon kórokozók azonosítására és tanulmányozására, amelyek „tenyésztetlen” állapotban képesek ott fennmaradni, túlélve a kedvezőtlen külső körülményeket.

A PCR lehetővé teszi a lassan növekvő és nehezen tenyészthető baktériumok antibiotikum-rezisztenciájának meghatározását.

A PCR-diagnosztika gyakorlati alkalmazásának ígéretes területei a következők:

· onkológiai betegségek diagnosztizálása;

· leukémia és limfómák diagnosztizálása;

· mellrák diagnózisa;

· egyéb rosszindulatú betegségek diagnosztizálása;

DNS diagnosztika jóindulatú és rosszindulatú daganatok korlátozza az ezekkel a betegségekkel kapcsolatos génekről szóló, kicsi, de egyre növekvő ismeretanyag;

· diagnosztika genetikai betegségek.

A genetikai betegségek diagnózisa csak az emberi genom kiterjedt tudományos kutatása után alakulhat ki. Az orvostársadalom azonban már felismerte a betegségek genetikai alapjainak tanulmányozásának fontosságát, valamint a betegség tüneteinek megjelenése előtti diagnosztizálásának és kezelésének lehetőségét;

· személyazonosítás: igazságügyi orvostan, kriminológia; szerv- és szövetátültetés; az apaság megállapítása. A szakértők a DNS-diagnosztikai piac ezen területét az egyik legnagyobb és leggyorsabban növekvő területként értékelik;

Gyakran használják gyors módszerként a vírusok kimutatására és azonosítására.

Ezt a módszert először K. Mullis (USA) fejlesztette ki 1983-ban. Magas érzékenysége, specifitása és könnyű kivitelezése miatt széles körben alkalmazzák a genetikában, igazságügyi orvostanban, diagnosztikában és más területeken.

A módszer lényege az amplifikáció, azaz egy DNS-molekula szigorúan meghatározott fragmentumainak másolatszámának in vitro növelése. Ez a módszer mátrixmechanizmust és a komplementaritás elvét alkalmazza. Két szimpla polinukleotid lánc (nukleinsav) hidrogénkötéssel egy kettős szálú láncba kapcsolódhat, ha az egyik nukleotidszekvenciája pontosan megegyezik a másik nukleotidszekvenciájával, így nitrogénbázisaik adenin-timint és guanin-citozint képezhetnek. párok.

A PCR a DNS-amplifikáción alapul, hőstabil DNS-polimeráz segítségével, amely egymással komplementer DNS-szálakat szintetizál, két primerrel kiindulva. A primer egy DNS-fragmens, amely 20-30 nukleotidból áll. Ezek a primerek komplementerek az ellentétes DNS-szálakkal. A DNS-szintézis során a primerek beépülnek az újonnan szintetizált DNS-molekulák láncába.

Általában a PCR-t 25-40 ciklusban hajtják végre. Minden ciklus három szakaszból áll: az első a denaturálás 92-95 °C-on. Ebben az esetben a két DNS-szál eltér egymástól; a második a lágyítás vagy primerek hozzáadása 50-65 °C-on; a harmadik az elongáció vagy polimerizáció 68-72 °C-on, míg a DNS-polimeráz a DNS-templát láncok komplementer kiegészítését végzi négyféle nukleotid felhasználásával. Egy ciklus eredményeként a kívánt genetikai anyag megduplázódik. Az első ciklusban kialakult DNS-láncok templátként szolgálnak a második ciklushoz stb. Az első ciklus után csak a két primer közötti fragmentum amplifikálódik. Így az amplifikált régió kópiáinak száma megduplázódik, ami lehetővé teszi több millió (2 n) DNS-fragmens szintetizálását 25-40 ciklus alatt - ez a mennyiség elegendő ezek különböző módszerekkel történő kimutatásához (bizonyost tartalmazó hibridizációs próbák módszere). címke, elektroforézis stb.) Gyakrabban erre a célra agaróz gél elektroforézist alkalmaznak etidium-bromid festéssel.

A kórokozó DNS-szakaszaiból származó PCR során olyan primereket használnak, amelyek egyedi nukleotidszekvenciájúak, amelyek csak egy adott kórokozóra jellemzőek.

A PCR végrehajtásának eljárása a következőkre terjed ki: DNS-mátrixot izolálnak a vizsgált anyagból; kémcsőben az izolált DNS-t egy amplifikációs keverékkel kombinálják, amely tartalmazza a DNS polimerázt, mind a 4 típusú nukleotidot, 2 típusú primert, MgCl-t, puffert, ioncserélt vizet és ásványolajat. Ezután a csöveket ciklusba helyezzük, és a kórokozó típusának megfelelő program szerint automatikusan megtörténik az amplifikáció. Az eredményeket gyakrabban rögzítik elektroforézissel 1-2%-os agaróz gélben etidium-bromid jelenlétében, amely DNS-fragmensekkel egyesül, és fényes sávok formájában derül ki, amikor a gélt ultraibolya sugarakkal sugározzák be egy transzilluminátoron. Minden PCR-eljárás 1-2 munkanapot vesz igénybe.

A PCR specificitásának és érzékenységének növelése érdekében különféle lehetőségeket alkalmaznak: egymásba ágyazott PCR; PCR „melegindítással”, paraffinréteggel vagy a polimeráz aktív központjainak blokkolásával monoklonális antitestekkel. Emellett egyes cégek liofilizált reagenskészleteket is gyártanak DNS-amplifikációhoz, amelyek felgyorsítják a PCR-folyamatot és csökkentik a hamis pozitív eredmények lehetőségét.

Jelenleg egy új technológia, a Real-Time PCR bevezetése van folyamatban. Alapvető jellemzője a polimeráz láncreakció termékeinek felhalmozódásának monitorozása és kvantitatív elemzése, valamint a kapott eredmények automatikus regisztrálása és értelmezése. Ez a módszer nem igényel elektroforézis lépést, ami csökkenti a PCR laboratóriumi követelményeit. A valós idejű PCR fluoreszcensen jelölt oligonukleotid próbákat használ az amplifikált DNS kimutatására. A valós idejű PCR lehetővé teszi a minta teljes elemzését 20-60 percen belül, és elméletileg egy DNS- vagy RNS-molekula kimutatásának módja a mintában.

A valós idejű polimeráz láncreakció (PCR-figyelés) termékészlelő rendszere lehetővé teszi az amplifikált DNS felhalmozódásának ciklusonkénti nyomon követését. A rendszer tartalmaz egy oligonukleotid próbát is, amely képes a cél-DNS belső szegmenséhez kapcsolódni (hibridizálódni). A szondát az 5′ végén fluoreszcens riporter festékkel, a 3′ végén pedig blokkoló festékkel (quencher dye) jelöltük. Ahogy a PCR termék felhalmozódik, a próba hibridizálódik vele, de a riporter és a blokkoló közelsége miatt nem lép fel lumineszcencia. A szekvencia másolásának eredményeként a polimeráz eléri a próba 5′ végét. A polimeráz 5'-3' exonukleáz aktivitása leválasztja a fluoreszcens címkét a próba 3' végéről, ezáltal megszabadítja a fluoreszcens riportert a jelblokkolóval való kapcsolatától, ami a fluoreszcencia növekedéséhez vezet. A fluoreszcencia szintje tehát arányos az adott reakciótermék mennyiségével. Fontos, hogy a PCR-eredményeket a zárt csövekben fluoreszcencia jelenléte rögzítse, és ezzel a módszer másik fő problémája – az amplikonokkal való szennyeződés problémája – megoldódik.

A PCR előnyei: az elemzés gyorsasága; nagy érzékenység és specifitás; minimális mennyiségű vizsgálati anyag; a végrehajtás egyszerűsége és a teljes automatizálás lehetősége.

Annak a ténynek köszönhetően, hogy a PCR érzékenysége elérheti a DNS-templát egy példányának kimutatását, magas fokozat hamis pozitív eredményeket kaphat. Ezért a PCR-vizsgálat elvégzésekor a genetikai diagnosztikai laboratóriumnak szigorúan meg kell felelnie az elrendezésre és a működési módra vonatkozó speciális követelményeknek.

A PCR a virológiai diagnosztikában létező kiegészítő módszerek egyike. Ez a reakció nagyon fontos a vírusfertőzések diagnosztizálásában, amikor a vírusantigének vagy vírusspecifikus antitestek nem mutathatók ki, és amikor a vírus nukleinsav jelenléte lehet a fertőzés egyetlen bizonyítéka, különösen látens és vegyes fertőzések esetén.

Ha hibát talál, jelöljön ki egy szövegrészt, és kattintson rá Ctrl+Enter.

A polimeráz láncreakció 30 éve ismert. Széles körben használják számos területen, a régészettől a genetikáig.

Az apaság megállapítását a PCR módszer segíti, de leggyakrabban az emberi szervezet különböző fertőző betegségeinek azonosítására használják.

Hogyan történik a PCR elemzés, és mi az? Ezekre a kérdésekre igyekszünk részletesen válaszolni.

PCR elemzés - mi ez?

A polimeráz láncreakció (PCR) a molekuláris genetikai diagnosztika nagy pontosságú módszere, amely lehetővé teszi a különböző fertőző és örökletes betegségek, mind akut, mind krónikus stádiumban, és jóval azelőtt, hogy a betegség megnyilvánulhatna.

A PCR módszer abszolút specifikus, és ha helyesen hajtják végre, nem tud adni hamis pozitív eredmény. Vagyis ha nincs fertőzés, akkor az elemzés soha nem fogja kimutatni, hogy létezik. Ezért most nagyon gyakran a diagnózis megerősítése érdekében PCR-tesztet is végeznek a kórokozó és annak természetének meghatározására.

A polimeráz láncreakciót (PCR) Kary Mullis (USA) fejlesztette ki 1983-ban, amiért 1993-ban kémiai Nobel-díjat kapott.

Mi az előnye ennek a módszernek?

Az ezzel a módszerrel végzett diagnosztika lehetővé teszi, hogy a kórokozót közvetlenül a génben találja meg, amelyet a vizsgált anyagok tartalmaznak. Ez a legpontosabb teszt a szexuális úton terjedő fertőzésekre, a rejtett fertőzésekre és a különféle szexuális úton terjedő betegségekre.

A PCR diagnosztika és más laboratóriumi kutatási módszerek közötti különbségek a következő:

• a módszer magának a kórokozónak az azonosítására irányul;
• A PCR módszerrel végzett diagnosztikát sokoldalúsága jellemzi: több kórokozó kimutatására;
• betegségek esetén csak egy biológiai minta elegendő a páciensből;
• a módszer nagyon érzékeny, és nem kíséri más keresztreakció.

Emellett a PCR diagnosztika előnye, hogy a páciens bármely biológiai anyaga alkalmas elemzésre: vér, nemi váladék, vizelet, sperma.

Milyen fertőzések mutathatók ki a PCR-kenet segítségével?

Számos fertőző ágens lehet jelen a szervezetben, beleértve a „rejtetteket”, amelyek hosszú ideig nem jelentkeznek.

PCR kenetelemzés lehetővé teszi az ilyen fertőzések kimutatását:

• a nemi szervek ureplasmosisa;
• candidiasis ();
• herpesz;
• rákos sejtek jelenléte;
• értékelje a hormonális állapotot;

A PCR vizsgálati anyaga általában köpet, nyál, vizelet és vér. Az elemzés elvégzése előtt gondosan fel kell készülnie arra, először konzultáljon orvosával.

A PCR-hez vért általában üres gyomorra adnak. Jó eredményeket mutat az elemzés, amikor a kutatáshoz szükséges anyagot a nyaki csatornából vagy a húgycsőből veszik. Ebben az esetben a legjobb, ha a PCR-diagnosztikát legkésőbb egy nappal a közösülés után végezzük.

A PCR típusai

A PCR-t számos területen használják tesztelésre és tudományos kísérletekre. Különféle elemzési módszerek léteznek:

1. Reverz transzkripciós PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) – ismert szekvencia RNS-könyvtárból történő amplifikálására, izolálására vagy azonosítására szolgál.
2. Fordított PCR(Inverz PCR) - akkor használatos, ha a kívánt szekvencián belül csak egy kis régió ismert. Ez a módszer különösen akkor hasznos, ha a szomszédos szekvenciák meghatározásáról van szó, miután a DNS-t beépítették a genomba.
3. A beágyazott PCR-t a reakció melléktermékeinek számának csökkentésére használják. Két pár primert használunk, és két egymást követő reakciót hajtunk végre.
4. Aszimmetrikus PCR(eng. Aszimmetrikus PCR) - akkor hajtják végre, ha az eredeti DNS túlnyomórészt egyik szálát kell amplifikálni. Egyes szekvenálási és hibridizációs elemzési technikákban használatos.
5. Kvantitatív PCR(Kvantitatív PCR, Q-PCR (angol)) vagy valós idejű PCR – egy adott PCR-termék mennyiségének mérésének közvetlen monitorozására szolgál minden reakcióciklusban.
6. Lépésről lépésre történő PCR (Touchdown PCR) - ezzel a megközelítéssel a nem specifikus primer kötődés hatása csökken.
7. Csoportspecifikus PCR(angol. csoport-specifikus PCR) - PCR rokon szekvenciákhoz ugyanazon vagy különböző fajok között, ezekhez a szekvenciákhoz konzervatív primereket használva.

Ha a templát nukleotidszekvenciája részben ismert vagy egyáltalán nem ismert, akkor degenerált primerek használhatók, amelyek szekvenciája olyan degenerált pozíciókat tartalmaz, amelyekben bármilyen bázis elhelyezhető. Például a primer szekvencia lehet: ...ATH..., ahol H jelentése A, T vagy C.

Milyen biológiai anyagokat vizsgálnak?

Különféle biológiai közegek és humán folyadékok szolgálhatnak anyagként a PCR kutatásokhoz, amelyekben idegen bakteriális DNS vagy vírus DNS vagy RNS kimutatható:

1. Vizelet. Férfiaknál a húgyúti fertőzések, nőknél húgyúti fertőzések esetén alkalmazható (férfiaknál a vizelet anyagként történő felhasználása helyettesíti a hámkaparást).
2. Köpet. A tuberkulózis, ritkábban a chlamydia és a mycoplasmosis légúti formáinak diagnosztizálására használják. A köpetet 15-20 ml mennyiségben egy steril (eldobható) üvegbe gyűjtjük.
3. Biológiai folyadékok. Prosztatalé, mellhártya, gerinc, magzatvíz, ízületi folyadék, bronchoalveolaris mosás, nyál gyűjtése javallatok szerint történik.
4. A nyálkahártyák hámsejtjei. Jellemzően szexuális úton terjedő betegségek (STD-k), például gonorrhoea, chlamydia, mycoplasmosis, ureaplasmosis, trichomoniasis, gardnerellosis, herpesz és egyéb, a nyálkahártyát érintő fertőzések diagnosztizálására használják.
5. Biopsziák. Leggyakrabban a gyomor és a nyombél biopsziáját használják a Helicobacter pylori fertőzés kimutatására.
6. Vér, plazma, szérum. Hepatitis B, C, D, G, herpesz, CMV, HIV vírusok PCR-elemzésére és humán gének kutatására használják.

Hogyan készüljünk fel a tesztre?

A PCR eredmény megbízhatósága közvetlenül függ az anyag vizsgálatra történő helyes benyújtásától. Az anyagot nem szabad szennyezni, különben a vizsgálat eredménye nem lesz objektív. A legtöbbre fontos ajánlásokat A PCR-teszt elvégzése előtt a következő követelmények érvényesek:

1. A vizeletet reggel steril tartályba gyűjtjük.
2. A fertőzések kimutatására szolgáló vérvizsgálatot reggel éhgyomorra kell venni.
3. A vizsgálat előtti napon nem szabad szexuálisan aktívnak lenni.

Az elemzés eredménye a kérdéses eljárás után 1,5-2 nappal készen áll. Vannak helyzetek, amikor az eredményt még aznap el lehet készíteni.

Az OPC elemzés dekódolása

A bemutatott kutatás értelmezési folyamatát az egyszerűség jellemzi. eredmények PCR elemzés az anyag leadása után 1,5-2 nappal átvehető. Egyes esetekben az eredmény már az első napon készen áll, és a következőket jelenthetik:

• Negatív eredmény azt mutatja, hogy a diagnosztikai anyag nem tartalmazza a kívánt fertőző ágenst.
• PCR pozitív azt jelenti, hogy a kórokozó DNS-e vagy RNS-e jelen van az emberi szervezetben.

Egyes esetekben a mikroorganizmusokat számszerűsítik. Ez különösen igaz az opportunista mikroorganizmusok által okozott betegségekre. Mivel ezek a baktériumok mutatják negatív hatás csak túlzott mennyiségben.

A kvantitatív PCR-elemzés fontos a terápiás taktika megválasztásához és a vírusfertőzések, például a HIV és a hepatitis vírusok kezelésének monitorozásához is.

Mennyire pontos a fertőzések PCR-diagnosztikája?

A PCR módszert nagy pontosság, specificitás és érzékenység jellemzi. Ez azt jelenti, hogy ez az elemzés képes:

• pontosan meghatározza a fertőzés jelenlétét vagy hiányát;
• pontosan jelezze, hogy milyen fertőzésről van szó (specifitás);
• a fertőzés kimutatása a biológiai anyag nagyon alacsony mikrobiális DNS-tartalma esetén is,
• amelyet teszteltek (érzékenység).

PCR elemzés: ár és időzítés

Egy adott vizsgálat ára attól függ, hogy milyen fertőzésre fogják vizsgálni. Hozzávetőleges árak és feltételek:

1. STI: 300-500 rubel, feltételek – 1 nap;
2. Epstein-Barr vírus, humán papillomavírus, herpesz, citomegalovírus: 300-500 rubel, kifejezések - 1 nap;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: kvalitatív elemzés 650 rubel, mennyiségi elemzés 2000 rubel. Feltételek – legfeljebb 5 nap;
4. A hepatitis C vírus elleni antitestek, összesen (Anti-HCV) – 420 rubel;
5. A hepatitis C vírus elleni antitestek, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 rubel;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubel, feltételek – 1 nap;
7. HIV (antitestek és antigének) – 380 rubel;
8. HIV RNS, kiváló minőségű – 3500 rubel;
9. HIV RNS, mennyiségileg – 11 000 rubel.

Pénzmegtakarítás érdekében választhat egy rögzített elemzési csomagot. Ezt a szolgáltatást a legtöbb olyan klinika biztosítja, ahol PRC módszerrel is kivizsgálható (invitro, onclinic stb.).

A PCR-elemzés (PCR-diagnosztika) elvégzése a nőgyógyász, urológus vagy dermatovenerológus általi vizsgálathoz szükséges anyaggyűjtéssel kezdődik. Az utólag kapott eredmények minőségét és megbízhatóságát az Euromedprestige egészségügyi központ orvosainak legmagasabb képesítése és hatalmas tapasztalata biztosítja, akik megfelelnek a PCR-elemzés elvégzéséhez szükséges összes szabálynak: teljes sterilitás, csak eldobható anyagok használata.

Az ecsettel összegyűjtött anyagot sóoldattal ellátott tartályba helyezzük. A mintákat a gyűjtés után a lehető leghamarabb a PCR laboratóriumba kell szállítani.

A PCR-elemzést a laboratóriumban három szakaszban végzik:

1. DNS kivonás
2. DNS-fragmensek amplifikációja
3. DNS-amplifikációs termékek kimutatása

A DNS-kinyerés a PCR-diagnosztika kezdeti szakasza, melynek lényege a következő: az orvos kutatásra anyagot vesz át a pácienstől és speciális feldolgozásnak veti alá. A feldolgozás során a DNS kettős hélix egyedi szálakra hasad. A páciens anyagához speciális folyadékot adnak, amely feloldja a reakció „tisztaságát” zavaró szerves anyagokat. Ez eltávolítja a lipideket, aminosavakat, peptideket, szénhidrátokat, fehérjéket és poliszacharidokat. Ennek eredményeként DNS vagy RNS képződik.

A PCR módszer alapelve új DNS vagy RNS fertőzések „konstrukciója”. Ezt nem lehet megtenni a sejtes anyag eltávolítása nélkül.

A DNS-kivonásra fordított idő a fertőzés kórokozójától és a PCR-kutatáshoz használt anyag típusától függ. Például 1,5-2 órát vesz igénybe a vér előkészítése a következő szakaszra.

0Tömb ( => Elemzések) Tömb ( => 2) Tömb ( =>.html) 2

DNS-amplifikáció

A DNS-diagnosztika következő szakaszának - a DNS-amplifikációnak - elvégzéséhez az orvosok úgynevezett DNS-mátrixokat - fertőzések DNS-molekuláit - használnak, amelyekre a későbbiekben DNS-klónozás történik. Már említettük, hogy a fertőzés teljes DNS-ének jelenléte nem szükséges, ennek a szakasznak a végrehajtásához elegendő a DNS-molekula egy kis darabja, amely csak egy adott mikrobára (fertőzésre) jellemző.

A DNS-amplifikáció alapja, és ennek megfelelően a PCR-reakció teljes elvének alapja az összes élőlény DNS-kiegészülésének természetes folyamata - a DNS-replikáció, amelyet egyetlen DNS-lánc megkettőzésével hajtanak végre.

Egyetlen DNS-fragmenstől kezdve a laboratóriumi orvos lemásolja, és láncreakciós módban növeli a másolatok számát: az első ciklus után már 2 fragmentum van, a második ciklus után - 4, a harmadik után - 8, miután negyedik - 16, majd 32 , 64, 128, 256... Minden ciklussal megduplázódik a példányszám, és húsz ciklus után már milliókba, harminc után pedig milliárdokba megy a szám. A ciklus néhány percig tart, és egy nagyon kicsi kémiai reaktorban bizonyos hőmérsékletváltozásig forr le. Itt az oldatban a szintézishez szükséges összes komponens kellő mennyiségben jelen van, mindenekelőtt az A, G, T és C nukleotidok, valamint finom előkészítő kémiai műveleteket végeznek, hogy mindegyikből azonnal pontos másolatot készítsenek. kész DNS szegmens, majd ebből a másolatból - ismét egy másolat, ez az elágazó láncreakció.

A DNS-lánchoz primerek – a mikrobák (fertőzések) DNS-éhez hasonló mesterségesen szintetizált DNS „darabok” (nukleotidpárok) – kapcsolásával két rövid, két szál DNS-szakaszból álló hélix jön létre, amelyek a jövő szintéziséhez szükségesek. DNS.

Az új lánc szintézise a két DNS-szál mindegyikének befejezésével történik. Az amplifikációs folyamat egy meghatározott régió - DNS-polimeráz - segítségével történik, amely a laboratóriumi módszer nevét adja. A polimeráz a reakció katalizátoraként működik, és figyeli a nukleotidbázisok egymás utáni kapcsolódását a növekvő új DNS-szálhoz.

Így a DNS-amplifikáció a DNS-másolatok számának többszörös növekedése, amelyek specifikusak, azaz csak egy bizonyos szervezetben rejlenek. A fertőző ágens észleléséhez nincs szükség a teljes DNS-lánc befejezésére. Csak arra a területre van szükség, amely az adott baktériumra, mint egyedre jellemző.

5360 dörzsölje. Átfogó program költsége gasztroenterológussal

KEDVEZMÉNY 25% SZIDŐLÓGUS ELŐADÁSRA

- 25%elsődleges
Orvoslátogatás
terapeuta hétvégén

5160 RUB 5420 dörzsölés helyett. Férfiak szűrése urológiai fertőzésekre

ALLERGOLÓGIA 5120 RUB 5590 dörzsölés helyett.

Minden erősen ismétlődő amplifikációs lépés különböző hőmérsékleteken megy végbe. A PCR elemzés elvégzéséhez speciálisan programozható berendezést használnak - PCR - termosztátot vagy erősítőt, amely automatikusan változtatja a hőmérsékletet. Az amplifikációt az észlelt fertőzés típusának megfelelő adott program szerint végezzük. A programtól és az észlelt fertőzés típusától függően az automatizált PCR folyamat 2-3 órát vesz igénybe.

A PCR diagnosztikában fontos szerepet játszik az elemzést végző labororvos képzettsége, tőle függ a PCR berendezés helyes beállítása és az eredmények értelmezése. Az Euromedprestige Medical Center orvosai nagy tapasztalattal rendelkeznek a DNS-diagnosztika elvégzésében, amely biztosítja a kutatási eredmények megbízhatóságát és garantálja a fertőző betegségek kezelésének pozitív sikerét. PCR-vizsgálatok elvégzése és a fertőző betegségek teljes körű diagnosztizálása és kezelése az Euromedprestige egészségügyi központunkban.

Az amplifikációs termékek kimutatása során a keletkező amplifikációs termékek keverékét elválasztják. Speciális oldatokat adnak a keverékhez, amelyek fluoreszkáló képességet adnak a DNS-fragmenseknek - narancsvörös világító csíkokban tükrözve. A kapott izzás vírusok, mikrobák vagy baktériumok DNS-ének jelenlétét jelzi a pácienstől PCR-elemzés céljából vett anyagban.