Réaction en chaîne des polymères. Découvrez ce qu’est « PCR » dans d’autres dictionnaires

GOU VPO "Académie médicale d'État de Krasnoïarsk"

nommé d'après l'Agence fédérale Yasenetsky pour la santé et le développement social »

IPO du Département de génétique médicale et de neurophysiologie clinique

PRINCIPES DE BASE DE LA MÉTHODE

RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE

Manuel méthodologique pour les étudiants de 3-4 ans

dans les spécialités de médecine générale (060101) et

Krasnoïarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Principes de base de la méthode de réaction en chaîne par polymérase. Manuel méthodologique pour le travail périscolaire des étudiants de 3-4 ans dans les spécialités de médecine générale (060101) et de pédiatrie (060103). – Krasnoïarsk : Maison d'édition de l'Établissement d'État d'enseignement professionnel supérieur KrasSMA, 2007. – 42 p.

Le manuel pédagogique est entièrement conforme aux exigences de la norme d'État (2000) et reflète les principaux aspects de la méthode moderne de diagnostic des maladies humaines héréditaires - la méthode de réaction en chaîne par polymérase, le matériel pédagogique est adapté aux technologies éducatives, en tenant compte des spécificités de formation en 3-4 ans des facultés de médecine et de pédiatrie.

Réviseurs : Chef du Département de génétique médicale, Établissement d'enseignement public d'enseignement professionnel supérieur

"Université médicale d'État de Novossibirsk de l'Agence fédérale pour la santé et le développement social", docteur en sciences médicales, professeur ;

Réplication de l'ADN

Objet d'étude cette méthode est l'acide désoxyribonucléique (ADN). L'ADN est le support universel de l'information génétique dans tous les organismes existant sur Terre (à l'exception des micro-organismes contenant de l'ARN). L'ADN est un double brin torsadé en hélice. Chaque brin est constitué de nucléotides connectés en séquence. Les brins d'ADN ont des directions opposées : l'extrémité 5" d'un brin correspond à l'extrémité 3" du deuxième brin. Une propriété unique de l’ADN est sa capacité à doubler. Ce processus appelé réplication. La réplication de la molécule d'ADN se produit pendant la période de synthèse d'interphase. Chacune des deux chaînes de la molécule « mère » sert de modèle à la « fille ». Après la réplication, la molécule d'ADN nouvellement synthétisée contient un brin « mère » et le second est un brin « fille » nouvellement synthétisé (méthode semi-conservatrice). Pour la synthèse d'une matrice d'une nouvelle molécule d'ADN, il est nécessaire que l'ancienne molécule soit déspirée et allongée. La réplication commence à plusieurs endroits de la molécule d'ADN. La section d'une molécule d'ADN depuis le point de départ d'une réplication jusqu'au point de départ d'une autre est appelée réplicon.

Le démarrage de la réplication est activé amorces(amorces) constituées de 100 à 200 paires de nucléotides. L'enzyme ADN hélicase déroule et divise l'hélice d'ADN mère en deux brins, sur lesquels, selon le principe de complémentarité, avec la participation de l'enzyme ADN polymérase, sont assemblés des brins d'ADN « filles ». Pour que l'enzyme commence son travail, la présence d'un bloc de départ est requise - un petit fragment initial double brin. Le bloc de départ est formé par l'interaction de l'amorce avec la région complémentaire du brin correspondant de l'ADN parent. Dans chaque réplicon, l'ADN polymérase peut se déplacer le long du brin « mère » dans une seule direction (5`=>3`).

Sur le brin principal, au fur et à mesure que le réplicon se déroule, un brin « fille » se développe progressivement de manière continue. Sur le brin en retard, le brin fille synthétise également dans la direction (5`=>3`), mais en fragments séparés au fur et à mesure que le réplicon se déroule.

Ainsi, l’ajout de nucléotides complémentaires des brins « filles » se fait dans des sens opposés (antiparallèles). La réplication dans tous les réplicons se produit simultanément. Les fragments et parties de brins « filles » synthétisés dans différents réplicons sont cousus en un seul brin par l’enzyme ligase. La réplication est caractérisée par un caractère semi-conservateur, un antiparallélisme et une discontinuité. Le génome entier d’une cellule est répliqué une fois pendant une période correspondant à un cycle mitotique. À la suite du processus de réplication, deux molécules d'ADN sont formées à partir d'une molécule d'ADN, dans laquelle un brin provient de la molécule d'ADN mère et le second, fille, nouvellement synthétisé (Fig. 1).

Riz. 1. Schéma de réplication des molécules d'ADN.

Ainsi, le cycle de réplication de l'ADN comprend trois grandes étapes :

1. déroulement de l’hélice d’ADN et divergence des brins (dénaturation) ;

2. fixation des amorces ;

3. compléter la chaîne du fil enfant.

Principe de la méthode PCR

C'est la réplication de l'ADN qui constitue la base de la PCR. En PCR, les processus ci-dessus sont effectués dans un tube à essai en mode cyclique. Le passage d'une étape réactionnelle à une autre s'effectue en modifiant la température du mélange d'incubation. Lorsque la solution est chauffée à 93-95°C, une dénaturation de l’ADN se produit. Pour passer à l'étape suivante - l'ajout ou le « recuit » des amorces - le mélange d'incubation est refroidi à 50-65°C. Ensuite, le mélange est chauffé à 70-72°C - la température optimale pour la taq-ADN polymérase - à ce stade la construction d'un nouveau brin d'ADN se produit. Ensuite, le cycle se répète. Autrement dit la méthode PCR est une augmentation multiple du nombre de copies (amplification) une section spécifique d'ADN catalysée par l'enzyme ADN polymérase.

La croissance des brins d’ADN fille doit se produire simultanément sur les deux brins d’ADN maternel, donc la réplication du deuxième brin nécessite également sa propre amorce. Ainsi, deux amorces sont ajoutées au mélange réactionnel : une pour la chaîne « + », la seconde pour la chaîne « - ». S'étant attachées aux brins opposés de la molécule d'ADN, les amorces se limitent à la partie de celle-ci qui sera ensuite dupliquée ou amplifiée plusieurs fois. La longueur d'un tel fragment, appelé amplicon, est généralement de plusieurs centaines de nucléotides.

Étapes de la PCR

Chaque cycle d'amplification comprend 3 étapes, se déroulant dans des conditions de température différentes (Fig. 2).

· Étape 1: Dénaturation de l'ADN . Se produit à 93-95° pendant 30-40 secondes.

· Étape 2 : recuit d'amorce . La fixation des amorces se produit de manière complémentaire aux séquences correspondantes sur des brins d'ADN opposés aux limites d'une région spécifique. Chaque paire d'amorces a sa propre température de recuit, dont les valeurs sont comprises entre 50 et 65°C. Temps de recuit 20-60 sec.

· Étape 3 : complétion des chaînes d'ADN. La complétion complémentaire des chaînes d'ADN se produit de l'extrémité 5" à l'extrémité 3" de la chaîne dans des directions opposées, en commençant par les sites de fixation des amorces. Le matériau pour la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN est constitué de désoxyribonucléoside triphosphates ajoutés à la solution. Le processus de synthèse est catalysé par l'enzyme taq polymérase et se déroule à une température de 70-72°C. Le temps de synthèse est de 20 à 40 secondes.

Les nouvelles chaînes d'ADN formées au cours du premier cycle d'amplification servent de modèles pour le deuxième cycle d'amplification, au cours duquel un fragment d'amplicon d'ADN spécifique est formé (Fig. 3). Dans les cycles d'amplification ultérieurs, les amplicons servent de modèle pour la synthèse de nouvelles chaînes.

Ainsi, l'accumulation d'amplicons dans la solution se produit selon la formule 2", où n est le nombre de cycles d'amplification. Par conséquent, même si la solution initiale ne contenait initialement qu'une seule molécule d'ADN double brin, alors en 30 à 40 cycles environ 108 molécules d'amplicons s'accumulent dans la solution, ce qui est suffisant pour une détection visuelle fiable de ce fragment par électrophorèse sur gel d'agarose.

Le processus d'amplification est effectué dans un thermostat programmable spécial ( thermocycleur), qui, selon un programme donné, modifie automatiquement les températures en fonction du nombre de cycles d'amplification.

Pour réaliser l'amplification, les composants suivants sont nécessaires :

· Matrice d'ADN(ADN ou partie de celui-ci contenant le fragment spécifique souhaité) ;

· Apprêts(oligonucléotides synthétiques (20-30 paires de nucléotides), complémentaires des séquences d'ADN aux limites du fragment spécifique à déterminer). Le choix d'un fragment spécifique et la sélection des amorces jouent un rôle crucial dans la spécificité de l'amplification, qui affecte la qualité de l'analyse.

· Mélange de désoxynucléotide triphosphates (dNTP)(un mélange de quatre dNTP, qui constituent le matériau nécessaire à la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN complémentaires dans des concentrations équivalentes de 200 à 500 µM)

· EnzymeTaq-polymérase(ADN polymérase thermostable qui catalyse l'élongation des chaînes d'amorces par addition séquentielle de bases nucléotidiques à la chaîne croissante d'ADN synthétisé, 2-3 mM).

· Solution tampon(milieu réactionnel contenant les ions Mg2+ nécessaires au maintien de l'activité enzymatique, pH 6,8-7,8).

Pour identifier des régions spécifiques du génome des virus à ARN, une copie d'ADN est d'abord obtenue à partir d'une matrice d'ARN en utilisant une réaction de transcription inverse (RT) catalysée par l'enzyme révertase (transcriptase inverse).

Riz. 2. Amplification (1er cycle).

Riz. 3. Amplification (2ème cycle).

Principales applications de la PCR

· médecine clinique :

o diagnostic des infections,

o identification des mutations, y compris diagnostic des maladies héréditaires,

o le génotypage, y compris le génotypage HLA,

o technologies cellulaires

· écologie (comme moyen de surveiller l'état et la qualité des objets environnementaux et des produits alimentaires)

· détermination des organismes transgéniques (OGM)

Identification personnelle, établissement de paternité, médecine légale

· biologie générale et spécifique,

Principes de base

organisation des laboratoires de diagnostic

Les travaux au laboratoire PCR sont effectués conformément aux « Règles de conception, de précautions de sécurité, d'assainissement industriel, de régime anti-épidémique et d'hygiène personnelle lors du travail dans les laboratoires (départements, départements) des institutions sanitaires et épidémiologiques du système de santé.

Contamination des échantillons d'ADN

La réalisation d'un diagnostic PCR est associée à un problème causé par haute sensibilité méthode, - possibilité contamination. Des traces entrant dans le tube de réaction ADN positif(produits spécifiques d'amplification de l'ADN - amplicons ; standard d'ADN utilisé comme contrôle positif ; ADN positif d'un échantillon clinique) conduit à l'amplification d'un fragment d'ADN spécifique lors de la PCR et, par conséquent, à l'apparition de résultats faussement positifs.

Au cours du travail, vous pouvez rencontrer deux types de contamination:

1. contamination croisée d'un échantillon à l'autre (lors du traitement des échantillons cliniques ou lors de la dissolution du mélange réactionnel), conduisant à des résultats faussement positifs sporadiques ;

2. contamination par des produits d'amplification(amplicons), ce qui est de la plus haute importance, car pendant le processus de PCR, les amplicons s'accumulent en quantités énormes et constituent des produits idéaux pour la réamplification.

La contamination de la verrerie, des pipettes automatiques et du matériel de laboratoire, de la surface des paillasses de laboratoire, ou encore de la surface de la peau des laborantins par des traces d'amplicons conduit à des résultats faussement positifs systématiques. Déterminer la source de contamination peut être très difficile et nécessite un investissement important en temps et en argent. L'expérience acquise à ce jour dans les laboratoires utilisant la méthode PCR pour le diagnostic nous permet de formuler les exigences de base pour l'organisation de ces laboratoires et la réalisation des analyses elles-mêmes. Le respect de ces exigences élimine la possibilité de contamination et de résultats faussement positifs.

Étapes de l'analyse PCR

Ils sont géographiquement séparés en les plaçant dans des pièces séparées (Fig. 4, 5) :

· Salle de pré-PCR, où les échantillons cliniques sont traités, l'ADN est isolé, un mélange réactionnel pour la PCR est préparé et la PCR est réalisée (si les conditions existent, il est également recommandé d'effectuer les deux dernières étapes dans une pièce séparée supplémentaire). Dans ces locaux, il est interdit d'effectuer tout autre type de travaux avec des agents de test dont les diagnostics PCR sont réalisés dans ce laboratoire.

· Salle post-PCR, où est effectuée la détection des produits d'amplification. D'autres méthodes de détection peuvent être utilisées dans cette salle. Il est conseillé de situer la salle de détection des produits d’amplification le plus loin possible des salles de pré-PCR.

Les ateliers sont équipés de lampes ultraviolettes avec un rayonnement maximum de l'ordre de 260 nm (type DB-60) à raison de 2,5 W pour 1 m3. Les lampes sont situées de manière à ce que les surfaces des tables de travail, des équipements et des matériaux avec lesquels l'opérateur est en contact lors de l'analyse PCR soient exposées à une irradiation directe. L'irradiation est effectuée dans l'heure avant le début des travaux et dans l'heure après la fin des travaux.

Les médecins de laboratoire travaillent avec des vêtements de laboratoire spéciaux, qui sont changés lorsqu'ils se déplacent d'une pièce à l'autre, et avec des gants jetables. Les vêtements provenant de différentes pièces sont traités séparément. Différents employés travaillent à différentes étapes de l'analyse PCR.

Pour le travail, des ensembles distincts de distributeurs, de plastique et de verrerie, de matériel de laboratoire, de blouses et de gants sont utilisés, destinés aux différentes étapes d'analyse et non portables d'une pièce à l'autre. Les équipements, matériaux et fournitures présents dans chaque pièce sont identifiés de manière appropriée.

Toutes les étapes de travail sont réalisées uniquement à l'aide de consommables jetables : embouts pour pipettes automatiques, tubes à essai, gants, etc. Veillez à changer d'embout lorsque vous passez d'un échantillon à l'autre. Il est nécessaire d'utiliser des embouts avec filtre - une barrière contre les aérosols pour empêcher les microgouttelettes de solution de pénétrer dans la pipette. Les tubes et embouts usagés sont jetés dans des conteneurs spéciaux ou des conteneurs contenant solution désinfectante. Les échantillons cliniques sont stockés séparément des réactifs.

Pour traiter et nettoyer le lieu de travail, chaque pièce est équipée de cotons-tiges (lingettes), de pinces à épiler, de solutions désinfectantes et inactivantes.

Le laboratoire de diagnostic PCR exclut les travaux liés à la production (clonage) et à l'isolement de plasmides recombinants contenant des séquences d'ADN ou des fragments de gènes d'agents pathogènes diagnostiqués dans ce laboratoire.

Collection de matériel clinique

Le matériel à étudier pour la PCR peut être des grattages de cellules épithéliales, du sang, du plasma, du sérum, des liquides pleural et céphalo-rachidien, de l'urine, des crachats, du mucus et d'autres sécrétions biologiques, des biopsies.

Le matériel est collecté dans une salle de traitement du profil approprié. Après le prélèvement, les échantillons doivent être livrés au laboratoire de diagnostic PCR dès que possible.

Les échantillons doivent être prélevés à l'aide d'instruments stériles, de préférence jetables, uniquement dans des tubes stériles jetables en plastique ou en verre, prétraités pendant une heure avec un mélange de chrome, soigneusement lavés à l'eau distillée et calcinés dans une étuve de séchage à une température de 150°C. Pour 1 heure.

Zone de détection (un autre étage ou un autre bâtiment).

Riz. 4. Appareil de laboratoire PCR avec détection par électrophorèse.

Zone de détection (un autre étage ou un autre bâtiment)

Riz. 5. Appareil de laboratoire PCR avec détection fluorescente (analyse quantitative).

Riz. 6. Salle d'extraction d'ADN. Il s’agit d’une boîte de table avec une lampe germicide.

Riz. 7. Salle d'amplification.

Riz. 8. Salle de détection.

Riz. 9. Échantillons de sang pour le diagnostic ADN des maladies héréditaires.

Stockage et transport des échantillons

Pour diagnostiquer les maladies héréditaires, les échantillons de sang sont conservés pendant une longue période sur des formulaires en papier spéciaux ou dans des epindorfs (tubes en plastique) congelés (Fig. 9).

Pour diagnostiquer les maladies infectieuses, les échantillons sont conservés à température ambiante pendant 2 heures maximum. Si une conservation plus longue est nécessaire, les échantillons peuvent être placés au réfrigérateur à une température de 2 à 8 °C pendant une période ne dépassant pas une journée. Une conservation plus longue (jusqu'à 2 semaines) est autorisée, congelée au congélateur à une température de moins 20°C. La congélation et la décongélation répétées des échantillons ne sont pas autorisées.

Si le laboratoire de diagnostic PCR et la salle de procédure de prélèvement sont géographiquement séparés, alors le transport des échantillons doit être effectué dans des thermos ou des conteneurs thermiques dans le respect des règles de conservation des échantillons et des règles de transport des matières infectieuses.

Extraction d'ADN à partir d'échantillons

La méthode de sorption en phase solide s'est généralisée, qui consiste à ajouter un agent de lyse contenant une solution de guanidine, à sorber l'ADN sur un sorbant, à laver à plusieurs reprises et à résorber l'ADN avec une solution tampon. Lors du traitement du sérum, du plasma ou du sang total, la méthode d'extraction au phénol est généralement utilisée. La méthode implique une déprotéinisation avec du phénol/chloroforme suivie d'une précipitation d'ADN (ou d'ARN) avec de l'éthanol ou de l'isopropanol. Le traitement est effectué dans des tubes à microcentrifugeuse Eppendor P d'un volume de 1,5 ml. Le temps de traitement est de 1,5 à 2 heures (Fig. 10).

Riz. dix. Extraction d'ADN.

Réalisation de la PCR

Une certaine quantité d'échantillon de l'échantillon clinique traité est transférée dans un tube de microcentrifugeuse spécial de type Eppendorf d'un volume de 0,2 ou 0,5 ml. Un mélange d'amplification composé d'eau, de tampon PCR, de solution de dNTP, de solution d'amorce et de solution est ajouté à le même tube. Taq polymérase (ajoutée au mélange en dernier). Généralement, le volume du mélange réactionnel est de 25 µl. Ensuite, une goutte d'huile minérale est ajoutée dans chaque tube pour éviter l'évaporation du mélange réactionnel pendant le processus d'amplification. Le les tubes sont transférés vers un thermostat programmable (amplificateur), où l'amplification s'effectue automatiquement selon un programme donné (Fig. 11).

Riz. onze. Amplificateur " Thermocycleur ».

Le temps de réaction, selon le programme spécifié, est de 2 à 3 heures. Parallèlement aux échantillons expérimentaux, des échantillons de contrôle sont placés : le contrôle positif comprend tous les composants de la réaction, mais au lieu de l'échantillon clinique, une préparation d'ADN témoin du gène étudié est ajoutée. Le contrôle négatif inclut tous les composants de la réaction, mais au lieu du matériel clinique ou de la préparation d'ADN, une quantité appropriée d'eau désionisée ou un extrait ne contenant pas l'ADN testé est ajouté. Un contrôle négatif est nécessaire pour vérifier les composants de la réaction pour l'absence d'ADN dû à une contamination et pour exclure les résultats faussement positifs.

Enregistrement des résultats

Le fragment d'ADN spécifique amplifié est détecté par électrophorèse sur gel d'agarose en présence de bromure d'éthidium. Le bromure d'éthidium forme un composé interstitiel stable avec des fragments d'ADN, qui apparaît sous forme de bandes lumineuses lorsque le gel est irradié avec un rayonnement UV d'une longueur d'onde de 290 à 330 nm. En fonction de la taille des amplicons formés à la suite de la PCR, un gel avec une teneur en agarose de 1,5 % à 2,5 % est utilisé. Pour préparer un gel d'agarose, un mélange d'agarose, de tampon et d'eau est fondu dans un four à micro-ondes ou au bain-marie, et une solution de bromure d'éthidium est ajoutée. Le mélange, refroidi à 50-60°C, est versé dans le moule en une couche de 4-6 mm d'épaisseur et, à l'aide de peignes spéciaux, des poches sont réalisées dans le gel pour l'application de l'échantillon. Les peignes sont installés de manière à ce qu'une couche d'agarose de 0,5 à 1 mm reste entre le fond des puits et la base du gel. Une fois le gel durci, l'amplificateur est appliqué sur les poches à raison de 5 à 15 µl. Il est recommandé d'effectuer l'électrophorèse d'un mélange de marqueurs de longueur de fragments d'ADN en parallèle avec des échantillons témoins et expérimentaux. Typiquement, un tel mélange contient dix fragments d'ADN d'une longueur de 100, 200, 300, etc. paires de bases.

L'utilisation d'un tel test permet de vérifier la longueur des amplicons dans des échantillons témoins et expérimentaux. Le gel avec l'échantillon appliqué est transféré dans une chambre d'électrophorèse remplie de tampon, la chambre est connectée à une source d'alimentation et la séparation électrophorétique des produits d'amplification est effectuée pendant 30 à 45 minutes à une intensité de champ électrique de 10 à 15 V/ cm. Dans ce cas, le front du colorant inclus dans le mélange réactionnel doit parcourir au moins 3 cm.

Une fois l’électrophorèse terminée, le gel est transféré dans un transilluminateur en verre et observé sous lumière ultraviolette. A titre de documentation, le gel est photographié sur film Micrat 300 ou enregistré à l'aide d'un système vidéo connecté à un ordinateur.

Tout d'abord, des échantillons de contrôle sont évalués. Une bande lumineuse orange doit être présente sur la piste électrophorétique correspondant au contrôle positif. Sa mobilité électrophorétique doit correspondre à la longueur de l'amplicon spécifiée dans la notice.

Dans la piste électrophorétique correspondant au contrôle négatif, une telle bande doit être absente. La présence d'une telle bande dans le contrôle négatif indique une contamination - contamination des réactifs utilisés avec l'ADN ou l'amplicon du test. Les échantillons de test sont évalués par la présence d'une bande dans la piste correspondante, située au même niveau que la bande dans l'échantillon témoin positif. L'intensité de la bande correspond à la quantité d'ADN testée dans l'échantillon, ce qui permet une évaluation semi-quantitative de la PCR. En règle générale, les résultats positifs sont évalués sur une échelle de quatre points. Si la lueur de la bande dans l'échantillon de test est très faible, cet échantillon doit alors être réorganisé (Fig. 12).

Riz. 12. Électrophorèse sur gel d'agarose.

Applications du PCR pourdiagnostic des mutations ponctuelles et des polymorphismes génétiques

L'un des principaux domaines d'application de la PCR dans les soins de santé pratiques est le diagnostic des mutations ponctuelles et des polymorphismes génétiques. . Il existe des méthodes directes et indirectes de diagnostic ADN. Dans les situations où l'on connaît un gène dont les dommages conduisent au développement d'une maladie héréditaire, ces dommages peuvent être détectés par des méthodes de génétique moléculaire. De telles méthodes sont dites directes. À l'aide de méthodes directes, des irrégularités dans la séquence nucléotidique primaire de l'ADN (mutations et leurs types) sont détectées. Les méthodes directes se caractérisent par une précision atteignant près de 100 %.

Cependant, en pratique, ces méthodes peuvent être utilisées sous certaines conditions:

· avec localisation cytogénétique connue du gène responsable du développement d'une maladie héréditaire ;

· le gène de la maladie doit être cloné et sa séquence nucléotidique connue.

Le but du diagnostic direct de l’ADN est d’identifier les allèles mutants.

Ainsi, dans les situations où l'on sait quel type de dommage à l'ADN conduit à une maladie héréditaire, le fragment d'ADN contenant le dommage est examiné directement, c'est-à-dire que la méthode de diagnostic direct de l'ADN est utilisée.

Cependant, à ce jour, les gènes de nombreuses maladies n'ont pas été cartographiés, leur organisation exon-intron est inconnue et de nombreuses maladies héréditaires se caractérisent par une hétérogénéité génétique prononcée, ce qui ne permet pas l'utilisation complète des méthodes de diagnostic direct de l'ADN. Par conséquent, dans les cas où la localisation du dommage est inconnue, une autre approche est utilisée, liée à l'étude du voisinage du gène responsable de la maladie génétique, en combinaison avec l'analyse familiale, c'est-à-dire des méthodes indirectes de diagnostic génétique moléculaire de les maladies héréditaires sont utilisées.

Diverses méthodes peuvent être utilisées pour détecter des mutations ponctuelles et de petites délétions, mais elles reposent toutes sur la méthode PCR. Cette réaction permet de multiplier plusieurs fois la séquence nucléotidique de l'ADN puis de rechercher des mutations. Les méthodes de recherche de fragments d'ADN porteurs de mutations sont basées sur une analyse comparative des séquences nucléotidiques d'ADN mutantes et normales.

Analyse des produits PCR

en cours de diagnostic ADN direct

Implique l’étude des caractéristiques spécifiques de la région du gène amplifié. Ainsi, dans les maladies provoquées par l'expansion des répétitions trinucléotidiques, les produits d'amplification diffèrent par leur longueur (reflétant le nombre différent de triplets dans la région du gène étudié) et, par conséquent, par leur vitesse de déplacement dans le gel. Grâce à cela, une séparation électrophorétique claire des allèles normaux et mutants est obtenue et une détermination précise d'un fragment pathologiquement allongé est obtenue, c'est-à-dire un diagnostic ADN de la maladie (Fig. 13).

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Riz. 14. Diagnostic de suppression GAG dans le gène DYT 1 chez les patients atteints de dystonie dopa-indépendante (électrophorèse sur gel de polyacrylamide). Voies 2,3,6 – malades ; pistes 1,4,5 – contrôle. La flèche fine indique l'allèle normal, la flèche épaisse indique l'allèle mutant plus court (délétion de trois nucléotides).

Si la totalité de la région d'ADN étudiée fait partie d'une délétion étendue, alors l'amplification PCR de l'ADN de cet allèle délété ne sera pas réalisée en raison du manque de sites pour l'hybridation des amorces. Dans ce cas, une délétion homozygote sera diagnostiquée sur la base de l'absence totale de produit de réaction PCR (la synthèse d'ADN est impossible à partir des deux copies du gène). Avec une délétion hétérozygote, il est possible de détecter un produit PCR synthétisé à partir d'un allèle normal (conservé), cependant, pour un diagnostic fiable d'une telle mutation, il est nécessaire d'utiliser plus méthodes complexes Visualisation de l'ADN, permettant d'estimer la dose du produit PCR final.

Pour identifier des mutations ponctuelles (le plus souvent des substitutions nucléotidiques) dans certains sites, la méthode PCR est utilisée en combinaison avec d'autres méthodes d'analyse génétique moléculaire. Si l'emplacement et la nature de la mutation ponctuelle putative sont connus avec précision, alors le endonucléases de restriction (les enzymes de restriction) sont des enzymes cellulaires spéciales isolées de diverses souches de bactéries.

Ces enzymes reconnaissent des séquences nucléotidiques spécifiques allant de quatre à dix nucléotides. Après cela, une restriction (lat. (coupure)) de ces séquences en tant que partie d'une molécule d'ADN double brin est effectuée. Chaque enzyme de restriction reconnaît et coupe à un endroit fixe une séquence nucléotidique spécifique strictement définie - site de restriction (site de reconnaissance).

Dans les cas où une mutation ponctuelle modifie le site de reconnaissance naturel d'une enzyme de restriction particulière, cette enzyme ne sera pas capable de cliver le fragment mutant amplifié par PCR. Dans certains cas, une mutation entraîne l’apparition d’un nouveau site de reconnaissance d’une enzyme de restriction particulière, normalement absente.

Dans les deux situations, les produits de PCR mutants et normaux traités avec l'enzyme de restriction sélectionnée produiront des fragments de restriction de différentes longueurs, qui peuvent être facilement détectés par électrophorèse (Fig. 15).

Ainsi, s'il est nécessaire de détecter rapidement une mutation ponctuelle spécifique, la tâche se réduit à rechercher l'enzyme de restriction correspondante, dont le site de reconnaissance est localisé au site de la séquence nucléotidique perturbée. Le traitement des produits de PCR avec une telle enzyme de restriction permettra de différencier facilement les allèles normaux et mutants. L'analyse de restriction simplifie grandement la détection des mutations ponctuelles connues et est désormais largement utilisée pour le diagnostic direct de l'ADN des maladies héréditaires.

La dernière étape analyse génétique moléculaire des mutations consiste à déterminer la séquence nucléotidique du fragment d'ADN étudié (séquençage), qui est comparée à la norme et un diagnostic génétique final est formulé. Grâce aux succès de la génétique moléculaire, des méthodes de diagnostic ADN de plus de 400 maladies héréditaires ont désormais été développées.

Riz. 15. Détection de mutation ponctuelle par analyse de restriction : A – région du gène amplifiée contenant un site de restrictionAGCTpour endonucléase de restrictionAluminium je. Mutationg→ UNmodifie cette séquence nucléotidique, entraînant une enzyme de restrictionAluIbloqué; B – électrophérogramme des produits de restriction : piste 1 – homozygotie pour l'allèle normal ; piste 2 – homozygotie pour mutation ; piste 3 – état hétérozygote (allèle normal + mutation).

Le diagnostic des maladies héréditaires, basé sur l'examen direct des allèles mutants chez les patients, les membres de leur famille ou les porteurs hétérozygotes suspectés de mutations pathologiques, convient au diagnostic présymptomatique et prénatal, qui peut être appliqué dès les premiers stades du développement fœtal, avant le apparition de symptômes cliniques ou biochimiques de la maladie.

Quelle que soit la méthode de détection des mutations, les caractéristiques moléculaires précises de chaque mutation ne peuvent être obtenues que par séquençage direct. Pour automatiser ce processus dans dernières années Des dispositifs spéciaux sont largement utilisés - des séquenceurs, qui permettent d'accélérer considérablement le processus de lecture des informations ADN.

Beaucoup plus large application la recherche en biologie moléculaire dans les laboratoires de diagnostic clinique permet d'accélérer le processus analytique en effectuant toutes les procédures dans un seul continuum, sans transfert d'échantillons, en créant des conditions pour empêcher la contamination lors des tests parallèles d'un certain nombre d'analytes et avec un enregistrement objectif des résultats à chaque cycle.

Principales modifications de la méthode PCR

Utilisé pour analyser et rechercher rapidement des mutations génétiques connues.

PCR multiplex (multi-amorces)

Cette méthode est basée sur l'amplification simultanée de plusieurs exons du gène étudié en une seule réaction. Cela permet un dépistage rapide et rentable des mutations les plus courantes. Par exemple, pour diagnostiquer rapidement le portage de délétions dans le gène de la dystrophine chez des patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne/Becker progressive, une amplification simultanée d'un ensemble d'exons les plus fréquemment mutés de ce gène est réalisée. Étant donné que ces maladies sont héritées de manière récessive liée à l'X et sont associées à des lésions du seul chromosome X chez les garçons, en cas de délétion étendue, l'électrophorèse des produits de réaction révélera l'absence d'un ou plusieurs fragments d'ADN (exons ), qui peut servir de confirmation moléculaire du diagnostic. De plus, en sélectionnant des sections de gènes spécifiques pour l’amplification PCR, une évaluation assez précise de la longueur totale de la délétion et des points d’arrêt du gène (jusqu’à l’exon) est possible.

L'utilisation combinée de plusieurs réactions multiplex permet de diagnostiquer jusqu'à 98 % de toutes les délétions survenant chez les patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne/Becker progressive. Cela représente environ 60 % du nombre total de mutations connues dans le gène de la dystrophine et indique la très grande efficacité de cette méthode de criblage pour le diagnostic ADN des dystrophinopathies (Fig. 16).

Riz. 16. Diagnostic ADN direct de la dystrophie musculaire de Duchenne par PCR multiplex (électrophorèse sur gel d'agarose). Chez chacun des individus examinés, quatre exons du gène de la dystrophine ont été amplifiés simultanément (exons 17, 19, 44 et 45 ; les flèches indiquent les produits d'amplification correspondants). Piste 1 – contrôle, pistes 2-5 – patients atteints de dystrophie musculaire de Duchenne avec diverses délétions du gène de la dystrophine (pistes 2 et 5 – délétion de l'exon 45, piste 3 – délétion de l'exon 44, piste 4 – délétion des exons 17 et 19 ).

Amplification spécifique d'un allèle

La méthode est basée sur l'utilisation de deux paires indépendantes d'amorces pour une région génétique spécifique : une amorce dans les deux paires est commune et la deuxième amorce de chaque paire a une structure différente et est complémentaire d'une séquence d'ADN normale ou mutante. À la suite d'une telle réaction, deux types de produits PCR peuvent être synthétisés simultanément en solution - normaux et mutants. De plus, la conception des amorces utilisées permet de différencier clairement les produits d'amplification normaux et mutants par leur taille moléculaire. Cette méthode est très visuelle et permet de vérifier à la fois le portage homo- et hétérozygote de l'allèle mutant.

Méthode de modification dirigée sur site d'ADN amplifié

La méthode est basée sur l'utilisation d'une amorce dite de mésappariement dans la PCR (pas complètement complémentaire de la matrice), qui diffère de la séquence d'ADN matrice par un nucléotide. À la suite de l'inclusion de l'amorce spécifiée dans le produit PCR mutant, un site de restriction créé artificiellement pour l'une des endonucléases de restriction s'y forme, ce qui permet un diagnostic direct de l'ADN d'une certaine mutation connue à l'aide d'une analyse de restriction. La création d'un tel site de restriction artificiel est nécessaire si la recherche n'a pas révélé l'existence d'une enzyme connue et disponible dont le site de restriction « naturel » est affecté du fait de l'apparition de la mutation étudiée dans la molécule d'ADN. .

Méthode PCR par transcriptase inverse (RT- RAP)

Cette méthode est utilisée dans les cas où il est plus pratique d'utiliser non pas l'ADN génomique comme objet d'étude, mais un ADNc plus compact et riche en informations obtenu après un traitement approprié d'échantillons de tissus, par exemple du matériel de biopsie ou des lignées cellulaires de lymphocytes, fibroblastes, etc. La condition importante ici est l'expression (au moins minimale) du gène souhaité dans le tissu étudié.

Dans un premier temps, une transcription inverse de l'ARNm est effectuée et les molécules d'ADNc résultantes servent de modèle pour la PCR. Par la suite, la région critique de l'ADNc, amplifiée en quantité suffisante, est soumise à un séquençage et à d'autres méthodes de criblage de mutations, d'étude électrophorétique directe (détection de délétions, insertions, etc.) ou d'intégration dans un système d'expression afin d'obtenir un produit protéique. et son analyse directe.

Cette méthode est particulièrement efficace pour détecter les mutations conduisant à la synthèse d'une protéine « tronquée » (mutations non-sens, mutations d'épissage, délétions importantes) - ce qu'on appelle l'analyse PTT (Protein Truncation Test). L'analyse PTT est couramment utilisée dans l'étude de gènes multi-exons longs, tels que la dystrophie musculaire de Duchenne/Becker, l'ataxie-télangiectasie ou la neurofibromatose de type 1.

Pcr en temps réel(PCR en temps réel, anglais)

Chaque année, la PCR en temps réel devient une méthode de diagnostic de plus en plus populaire dans le domaine des soins de santé pratiques. Sa caractéristique fondamentale est le contrôle et l'analyse quantitative de l'accumulation de produits de réaction en chaîne par polymérase ainsi que l'enregistrement et l'interprétation automatiques des résultats obtenus. Cette méthode ne nécessite pas d’étape d’électrophorèse, ce qui réduit les besoins d’un laboratoire PCR. Grâce à l'économie d'espace de production, à la réduction du nombre de personnel et à la demande de détermination quantitative de l'ADN/ARN, cette méthode a été utilisée avec succès ces dernières années dans les plus grands centres sanitaires, épidémiologiques, de diagnostic et de recherche des pays développés du monde, remplaçant PCR dans son format actuel (« classique »).

La PCR en temps réel utilise des sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence pour détecter l'ADN au fur et à mesure de son amplification. La PCR en temps réel permet une analyse complète d'un échantillon en 20 à 60 minutes et est théoriquement capable de détecter ne serait-ce qu'une seule molécule d'ADN ou d'ARN dans un échantillon.

Riz. 17. Pcr en temps réel.

La PCR en temps réel utilise un système TaqMan qui contrôle la cinétique de la PCR directement pendant l'amplification à l'aide d'une extinction de fluorescence par résonance. Pour la détection, on utilise une sonde portant un fluorophore et un extincteur complémentaire à la partie médiane du fragment amplifié. Lorsque le fluorophore et l'extincteur sont liés à la sonde oligonucléotidique, seule une émission fluorescente mineure est observée. Au cours du processus d'amplification, grâce à l'activité exonucléase 5" de la Taq polymérase, le marqueur fluorescent entre en solution, libéré de sa proximité avec le quencher, et génère un signal fluorescent qui augmente en temps réel proportionnellement à l'accumulation de l'amplificateur ( Fig.17).

Les principaux avantages de la PCR en temps réel par rapport à la PCR avec électrophorèse sur gel:

· L'ensemble de la méthode se déroule dans un seul tube à essai ;

· La méthode dure 1 heure ;

· 1 à 2 salles de travail suffisent ;

· Parallèlement à une évaluation qualitative du résultat, apparaît la possibilité d'une évaluation quantitative (par exemple, lors de la prescription thérapie antivirale pour le SIDA ou l'hépatite virale, il est nécessaire de connaître la charge virale, c'est à dire la quantité de virus par unité, qui est fournie par PCR en temps réel) ;

· Le risque de contamination est fortement réduit.

Conclusion

La méthode PCR est l’une des méthodes les plus courantes de recherche en biologie moléculaire. Cette méthode doit être utilisée intelligemment par les cliniciens, et un médecin qui décide d'utiliser la PCR dans son travail doit avoir certaines connaissances sur les caractéristiques et les capacités de cette méthode. Deuxièmement, il doit y avoir une rétroaction étroite entre le clinicien et le laboratoire de PCR, ce qui est nécessaire pour analyser les cas complexes et développer la stratégie diagnostique correcte. Troisièmement, l'analyse PCR n'est pas une panacée en matière de diagnostic (principalement des maladies infectieuses) et ne remplace pas méthodes existantes recherche, mais ne fait que la compléter. Et surtout, la PCR ne peut pas remplacer l’intuition et la pensée analytique que doit posséder un médecin qui s’attend à réussir.

P. . S . Moléculairement -recherche biologique- changement des directives de diagnostic et de traitement. L'utilisation de méthodes de biologie moléculaire est associée à la perspective d'un changement radical d'orientation dans le diagnostic de laboratoire. Il ne s’agit peut-être pas seulement d’obtenir des informations en temps opportun, mais aussi de les recevoir à l’avance. Si désormais les tests de laboratoire sont effectués dans la plupart des cas déjà lorsque la maladie s'est développée et que le traitement a commencé, alors les informations de laboratoire de biologie moléculaire devraient permettre d'identifier l'inclination d'une personne à certains types de pathologies et le degré de sensibilité à certains médicaments. , ce qui justifiera le caractère prédictif, préventif et personnalisé de la médecine du futur.

CHANGEMENT DE DIAGNOSTIC ET ORIENTATIONS DE TRAITEMENT

MALADIES HÉRÉDITAIRES

Aujourd'hui Dans le futur

Diagnostic Passeport génétique

8. Combien de salles de travail faut-il pour faire fonctionner un laboratoire de PCR avec détection fluorescente (analyse quantitative, PCR en temps réel) ?

9. Qu'est-ce que la détection ?

10. Quelles méthodes de diagnostic ADN existe-t-il ?

11. Le travail de quelle enzyme est à la base de la PCR ?

12. Pourquoi la zone de détection doit-elle être éloignée des autres zones de travail ?

13. Qu'est-ce qu'un site de restriction ?

14. Quelles sont les différences ? méthode directe Diagnostic ADN indirect ?

15. Qu'est-ce que le séquençage ?

16. Qu’est-ce que la PCR multiplex ?

17. Quels types de mutations sont déterminés par PCR ?

18. Qu'est-ce que la contamination ?

19. Quelle est l’essence de la méthode d’amplification allèle-spécifique ?

20. Conditions de stockage du matériel PCR ?

21. Dans quel appareil l'amplification a-t-elle lieu ?

22. Qu'est-ce que la méthode PCR par transcriptase inverse (RT-PCR) ?

23. Qu'est-ce qui sert de matériel pour le diagnostic PCR ?

24. Énumérer les types de contamination ?

Tests d'auto-préparation

1. Enzymes de restriction endonucléases :

a) des enzymes qui « cassent » l'ADN à des endroits strictement précis ;

b) les enzymes qui assemblent les cassures de la molécule d'ADN ;

c) des enzymes qui fournissent des composés qui effectuent la réparation de l'ADN.

2. Amplification génétique :

3. Quelle méthode de génétique moléculaire est utilisée pour diagnostiquer les maladies causées par un gène mutant d’une séquence connue ?

a) utilisation d'une enzyme de restriction spécifique ;

b) détection directe à l'aide de sondes moléculaires spécifiques ;

c) analyse familiale de la distribution des polymorphismes normaux de longueur des fragments de restriction.

4. Séquençage ADN:

a) identification de la séquence de bases d'ADN ;

b) répétitions multiples de n'importe quelle section d'ADN ;

c) isolement d'un fragment d'ADN contenant le gène étudié.

5. Pour obtenir des échantillons d'ADN, vous pouvez utiliser :

b) villosités choriales ;

c) liquide amniotique ;

d) les cellules du liquide amniotique ;

e) des échantillons de biopsie de peau, de muscles, de foie,

e) tout est correct sauf le point « c »,

g) tout est correct sauf le point « d »,

h) tout ce qui précède est vrai.

6. Pour diagnostiquer quelles mutations la méthode PCR est utilisée :

a) génomique ;

b) chromosomique ;

c) gène (point).

7. L'amorce est :

a) section complémentaire d'ADN ;

b) une séquence d'oligonucléotide synthétique marquée (radioactivement ou fluorescente) complémentaire d'un gène mutant ou normal ;

c) un oligonucléotide qui agit comme une « amorce » et initie la synthèse d'une chaîne polynucléotidique sur une matrice d'ADN ou d'ARN.

8. Qui a développé le principe de la méthode PCR ?

b) K. Mullis

9. La méthode PCR est-elle utilisée pour diagnostiquer l’expansion des répétitions trinucléotidiques (un type de mutation dynamique) ?

10. Dans quels domaines la PCR est-elle utilisée ?

a) médecine clinique ;

b) détermination des organismes transgéniques (OGM)

c) identification personnelle, établissement de paternité, médecine légale

Tout ce qui précède,

e) aucune des réponses ci-dessus.

Exemples de réponses : 1 – une ; 2-b ; 3-b; 4 – une ; 5 – e; 6 – po ; 7 – po ; 8-b; 9 – un, 10 – g.

Principal

1.Génétique Bochkov. Moscou. GEOTAR, 2002.

Supplémentaire

1. , Bakharev et le traitement des maladies congénitales et héréditaires chez les enfants. – Moscou, 2004.

2. Diagnostic ADN et conseil en génétique médicale. – Moscou, 2004.

3. Génétique Ginter. – Moscou, 2003.

4. Principes fondamentaux Gorbunov de la génétique médicale. – Saint-Pétersbourg : Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Diagnostic clinique moléculaire. – Monde, 1999.

6. Menchikov - recherche biologique en diagnostic de laboratoire clinique : possibilités du problème (cours magistraux). Diagnostic de laboratoire clinique, n° 3, 2006.

7. Travail de Kornienko dans le laboratoire PCR lors de l’analyse en ligne du matériel biologique. Diagnostic de laboratoire clinique, n° 10, 2006.

8. Organisation du travail du laboratoire PCR. Consignes méthodiques. MU 1.3.1794-03. Médecin hygiéniste en chef de la Fédération de Russie, 2003.

9. Technologie Erlich H.A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR quantitative en temps réel. Génome Res. – N° 6, 1996.

PRINCIPES DE BASE DE LA MÉTHODE

RÉACTION EN CHAÎNE DE LA POLYMÉRASE

Manuel méthodologique pour le travail périscolaire des étudiants de 3-4 ans dans les spécialités de médecine générale (060101) et de pédiatrie (060103).

GOU VPO "Académie médicale d'État de Krasnoïarsk de l'Agence fédérale pour la santé et le développement social"

Russie, Krasnoïarsk,

Principes du diagnostic PCR

ABSTRAIT

sections, 34 pages, 5 figures, 5 références

Le but de ce travail est un bref résumé des principes de base et des caractéristiques technologiques de la méthode PCR, de son application scientifique et pratique dans le diagnostic des maladies infectieuses.

LISTE DES ABRÉVIATIONS CONVENTIONNELLES

VHC - virus de l'hépatite C

dATP - désoxyadénosine triphosphate

dGTP - désoxyguanosine triphosphate

dNTP - désoxynucléotide triphosphate

dTTP - désoxythymidine triphosphate

dCTP - désoxycytosine triphosphate

ADN - acide désoxyribonucléique

PCR - réaction en chaîne par polymérase

ARN - acide ribonucléique - classe d'immunoglobulines GTime PCR - méthode PCR en temps réel

INTRODUCTION

PRINCIPE DE LA MÉTHODE PCR

ÉTAPES DE L'ANALYSE PCR

MÉTHODE PCR EN TEMPS RÉEL

AVANTAGES DE LA MÉTHODE PCR

LIMITES DE LA MÉTHODE PCR

APPLICATION DE LA MÉTHODE PCR

CONCLUSION

LISTE DES RÉFÉRENCES UTILISÉES

INTRODUCTION

La découverte de la méthode de réaction en chaîne par polymérase (PCR) est devenue l’un des développements les plus remarquables dans le domaine de la biologie moléculaire au cours des dernières décennies. Cela a permis d'élever le diagnostic médical à un niveau qualitativement nouveau. Le principe de la méthode de réaction en chaîne par polymérase a été développé par Carrie Mullis en 1983. Pour le développement de l'analyse PCR, K. Mullis a reçu le prix Nobel de chimie en 1993.

Après la découverte de la PCR, elle a été très rapidement mise en pratique. La méthode est devenue si populaire qu'il est aujourd'hui difficile d'imaginer travailler dans le domaine de la biologie moléculaire sans son utilisation. La méthode PCR a connu un développement particulièrement rapide grâce au programme international Génome Humain. Des technologies modernes de séquençage laser (décodage des séquences de nucléotides d'ADN) ont été créées. Si, dans un passé récent, il fallait une semaine pour déchiffrer une séquence d'ADN de 250 paires de nucléotides (pb), les séquenceurs laser modernes peuvent en déterminer jusqu'à 5 000 pb. en un jour. Cela contribue à son tour à la croissance significative des bases de données d’informations contenant des séquences d’ADN. Actuellement, diverses modifications de la PCR ont été proposées, la possibilité de créer des systèmes de test pour détecter des micro-organismes et identifier des mutations ponctuelles a été démontrée et des dizaines d'applications possibles de la méthode ont été décrites.

L'émergence de la méthode PCR est due à certaines avancées dans le domaine de la génétique moléculaire, principalement le décodage de la séquence nucléotidique des génomes d'un certain nombre de micro-organismes. Il convient de noter que cette découverte s’est accompagnée du développement de certaines technologies. On note notamment l'émergence de dispositifs permettant de synthétiser automatiquement des fragments d'ADN simple brin (oligonucléotides). Au cours de la même période, des micro-organismes uniques vivant dans les geysers ont été découverts. Leur système enzymatique, notamment l'ADN polymérase, peut résister hautes températures sources chaudes et conserve son activité biologique jusqu'à 95°C, ce qui est une condition nécessaire pour effectuer une réaction en chaîne par polymérase.

La réaction en chaîne par polymérase est actuellement la méthode de diagnostic la plus avancée en biologie moléculaire, en génétique moléculaire et en clinique. diagnostic de laboratoire, qui permet d'identifier des cellules uniques d'agents pathogènes de nombreuses maladies infectieuses dans les tissus et les fluides biologiques du corps.

La méthode PCR repose sur la complétion complémentaire d'une coupe d'ADN ou d'ARN génomique du pathogène, réalisée in vitro à l'aide de l'enzyme ADN polymérase thermostable. La spécificité de la méthode est déterminée par le caractère unique du matériel génétique des agents infectieux détectés, auquel sont sélectionnées les amorces oligonucléotidiques impliquées dans le processus d'amplification.

Diagnostic des maladies infectieuses, y compris celles causées par des agents difficiles à cultiver, génotypage des micro-organismes, évaluation de leur virulence, détermination de la résistance de la microflore aux antibiotiques, diagnostic prénatal, surveillance biologique des produits sanguins - ceci est une liste incomplète des domaines de la médecine utilisant la PCR. Aujourd’hui, l’analyse PCR reste la technologie la plus répandue et la plus dynamique. Chaque année, des dizaines de nouveaux systèmes de tests d'analyse PCR apparaissent sur le marché, conçus à la fois pour identifier les séquences nucléotidiques de divers micro-organismes responsables de maladies et pour étudier les gènes humains. Le coût de l'analyse PCR diminue régulièrement, ce qui contribue à l'utilisation de plus en plus répandue de la méthode dans les établissements médicaux et de diagnostic. Le nombre de laboratoires PCR dans les pays de la CEI augmente progression géométrique et, apparemment, dans un avenir proche, l'analyse PCR deviendra l'une des méthodes de diagnostic en laboratoire les plus courantes.

1. PRINCIPE DE LA METHODE PCR

La réaction en chaîne par polymérase est une méthode qui imite la réplication naturelle de l'ADN et permet la détection d'une seule molécule d'ADN spécifique en présence de millions d'autres molécules.

L’essence de la méthode consiste à copier (amplifier) ​​à plusieurs reprises certaines sections d’ADN dans un tube à essai au cours de cycles de température répétés. A chaque cycle d'amplification, les fragments préalablement synthétisés sont à nouveau copiés par l'ADN polymérase. De ce fait, le nombre de fragments d'ADN spécifiques augmente plusieurs fois, ce qui simplifie grandement l'analyse ultérieure.

La méthode PCR est basée sur un processus naturel - complétion complémentaire de la matrice ADN, réalisée à l'aide de l'enzyme ADN polymérase. Cette réaction est appelée réplication de l'ADN.

La réplication naturelle de l'ADN comprend plusieurs étapes :

) Dénaturation de l'ADN (déroulement de la double hélice, divergence des brins d'ADN) ;

) Formation de courtes sections d'ADN double brin (amorces nécessaires pour initier la synthèse de l'ADN) ;

) Synthèse d'un nouveau brin d'ADN (achèvement complémentaire des deux brins).

Ce processus peut être utilisé pour produire des copies de courtes sections d’ADN spécifiques à des micro-organismes spécifiques, c’est-à-dire effectuer une recherche ciblée dans ces zones spécifiques, ce qui est l'objectif du diagnostic génétique pour identifier les agents pathogènes des maladies infectieuses.

Découverte de l'ADN polymérase thermostable (Taq polymérase) à partir de bactéries thermophiles Thermisaquatique, dont l'optimum se situe aux alentours de 70-72°C, a permis de rendre cyclique le processus de réplication de l'ADN et de l'utiliser pour des travaux in vitro. La création de thermostats programmables (amplificateurs), qui effectuent des changements de température cycliques selon un programme donné, a créé les conditions préalables à l'introduction généralisée de la méthode PCR dans la pratique de laboratoire. diagnostic clinique. Avec de multiples répétitions de cycles de synthèse, une augmentation exponentielle du nombre de copies d'un fragment d'ADN spécifique se produit, ce qui permet d'obtenir un nombre suffisant de copies d'ADN pour leur identification à partir d'une petite quantité de matériel analysé, qui peut contenir des cellules uniques. de micro-organismes.

La complétion de la chaîne complémentaire ne commence à aucun moment de la séquence d'ADN, mais seulement dans certains blocs de départ - de courtes sections double brin. En attachant de tels blocs à des sections spécifiques de l'ADN, il est possible de diriger le processus de synthèse d'une nouvelle chaîne uniquement dans cette section, et non sur toute la longueur de la chaîne d'ADN. Pour créer des blocs de départ dans des sections d'ADN données, deux amorces oligonucléotidiques (20 paires de nucléotides), appelées amorces, sont utilisées. Les amorces sont complémentaires des séquences d'ADN situées aux limites gauche et droite d'un fragment spécifique et sont orientées de telle manière que l'achèvement d'une nouvelle chaîne d'ADN se produit uniquement entre elles.

Ainsi, la PCR est une augmentation multiple du nombre de copies (amplification) d’une région d’ADN spécifique catalysée par l’enzyme ADN polymérase.

. ÉTAPES DE L'ANALYSE PCR

La méthode d'analyse par la méthode PCR comprend trois étapes :

1. Isolement de l'ADN (ARN) à partir d'un échantillon clinique ;

2. Amplification de fragments d'ADN spécifiques ;

. Détection des produits d'amplification.

. Isolement de l'ADN (ARN)

À ce stade de l'analyse, l'échantillon clinique est soumis à un traitement spécial, à la suite duquel le matériel cellulaire est lysé, les fractions protéiques et polysaccharidiques sont éliminées et une solution d'ADN ou d'ARN est obtenue, exempte d'inhibiteurs et prête à être utilisée. une amplification supplémentaire. Le choix de la technique d’extraction de l’ADN (ARN) est principalement déterminé par la nature du matériel clinique traité.

2.Amplification de fragments d'ADN spécifiques

À ce stade, de courts fragments d'ADN spécifiques s'accumulent en quantité nécessaire à leur détection ultérieure.

Pour réaliser une réaction en chaîne par polymérase, un certain nombre de composants doivent être présents dans le mélange réactionnel :

· Apprêts- des oligonucléotides synthétisés artificiellement, dont la taille varie généralement de 15 à 30 pb, identiques aux sections correspondantes de l'ADN cible. Ils jouent un rôle clé dans la formation des produits de réaction d’amplification. Des amorces correctement sélectionnées garantissent la spécificité et la sensibilité du système de test.

· Taq polymérase- enzyme thermostable qui assure la réalisation de 3 - la fin du deuxième brin d'ADN selon le principe de complémentarité.

· Mélange de désoxynucléotide triphosphates (dNTP)- désoxyadénosine triphosphate (dATP), désoxyguanosine triphosphate (dGTP), désoxycytosine triphosphate (dCTP) et désoxythymidine triphosphate (dTTP) - le « matériau de construction » utilisé par la Taq polymérase pour synthétiser le deuxième brin d'ADN.

· Tampon -un mélange de cations et d'anions dans une certaine concentration, fournissant conditions optimales pour la réaction, ainsi qu'une valeur de pH stable.

· Échantillon analysé- une préparation préparée pour être ajoutée au mélange réactionnel, qui peut contenir l'ADN souhaité, par exemple l'ADN de micro-organismes, qui sert de cible pour des copies répétées ultérieures.

Fig.1 Composants du mélange réactionnel

Chaque cycle d'amplification comprend 3 étapes se déroulant dans des conditions de température différentes :

Étape 1:Dénaturation de l'ADN (détressage de la double hélice). Se produit à 93-95°C pendant 30-40 secondes.

L'un des circuits (+) est utilisé comme matrice principale. Ses cinq extrémités de barre sont fixées par l'enzyme ADN polymérase, qui assure la construction d'un deuxième brin d'ADN, complémentaire du premier, à partir de nucléotides individuels. La même chose, mais dans le sens opposé, se produit sur le deuxième brin d'ADN, cependant, comme le déroulement de la molécule d'ADN se déroule dans l'ordre inverse, le nouveau brin est construit en petits fragments, qui sont ensuite cousus ensemble. Pour que l'enzyme ADN polymérase commence son travail, la présence d'une graine ou d'une amorce est requise - un petit fragment d'ADN simple brin qui, lorsqu'il est connecté à la région complémentaire de l'un des brins d'ADN parent, forme un bloc de départ. pour faire grandir le brin fille.

Étape 2 :Fixation des apprêts (recuit). La fixation des amorces se produit de manière complémentaire aux séquences correspondantes sur des brins d'ADN opposés aux limites d'une région spécifique. Chaque paire d'amorces a sa propre température de recuit, dont les valeurs sont comprises entre 50 et 65°C. La température d'hybridation des amorces, calculée avec précision et vérifiée expérimentalement, est l'une des caractéristiques qui déterminent la spécificité de la réaction, excluant la fixation des amorces à des séquences incomplètement complémentaires.

Étant donné que la croissance des brins d’ADN filles peut se produire simultanément sur les deux brins d’ADN maternel, l’ADN polymérase du deuxième brin nécessite également sa propre amorce. Ainsi, deux amorces sont ajoutées au mélange réactionnel. En fait, les amorces, s'étant attachées aux brins opposés de la molécule d'ADN, limitent la partie de celle-ci qui sera ensuite dupliquée ou amplifiée plusieurs fois. Ces fragments d'ADN sont appelés amplicons. La longueur d'un amplicon peut atteindre plusieurs centaines de nucléotides. En changeant une paire d’amorces, nous pouvons passer de l’analyse d’un agent pathogène à l’analyse d’un autre.

Temps de recuit -20-60 sec.

Étape 3 :Achèvement des chaînes d'ADN (allongement).

Le mécanisme de copie est tel que l'addition complémentaire de brins ne peut commencer à aucun moment de la séquence d'ADN, mais seulement dans certains blocs de départ (sections courtes double brin). Pour créer des blocs de départ dans des sections données d'ADN, des amorces sont utilisées, qui sont des oligonucléotides d'environ 20 pb de longueur, également appelés amorces. Ils sont complémentaires des séquences d'ADN situées aux limites gauche et droite d'un fragment spécifique et sont orientés de telle manière que la synthèse d'ADN réalisée par l'ADN polymérase n'a lieu qu'entre elles.

La complétion complémentaire des chaînes d'ADN se déroule de l'extrémité 5' à l'extrémité 3' de la chaîne dans des directions opposées, en commençant par les sites de fixation des amorces. Le matériau pour la synthèse de nouvelles chaînes d'ADN est le phosphate de désoxyribonucléotide introduit. Ce processus est catalysé par l’enzyme Tag polymérase. Le nouvel ADN formé au cours du premier cycle de synthèse sert de matière première pour le deuxième cycle, au cours duquel le fragment d'ADN spécifique souhaité (amplicon) est formé, etc.

Fig.2 Principe de l'amplification de l'ADN

Actuellement, plusieurs méthodes sont utilisées pour préparer un échantillon pour la PCR. La procédure de préparation des échantillons comprend la lyse microbienne et l'extraction acide nucléique. Afin de détruire la cellule microbienne, une simple ébullition, une congélation-décongélation en présence de lysozyme, ainsi que des tampons de lyse spéciaux contenant des détergents et de la protéinase sont utilisés. En règle générale, le choix de la méthode est dicté par la nature du microbe, plus précisément par la nature de son paroi cellulaire. La méthode d'obtention d'une préparation d'ADN pur, décrite par B.R. Marmionétal, est considérée comme standard et est déjà devenue classique. (1993). Elle implique une protéolyse enzymatique suivie d'une déprotéinisation et d'une précipitation de l'ADN avec de l'alcool. Cette méthode permet d'obtenir une préparation d'ADN pure, mais elle demande beaucoup de travail et implique de travailler avec des substances aussi agressives et odorantes que le phénol et le chloroforme.

L’une des plus populaires est la méthode d’extraction d’ADN proposée par R.Boometal. (1990), basé sur l'utilisation d'un agent de lyse puissant - le thiocyanate de guanidine (GuSCN) pour la lyse cellulaire et la sorption ultérieure de l'ADN sur un support (billes de verre, terre de diatomées, « lait » de verre, etc.). Après lavage, l'ADN reste dans l'échantillon, sorbé sur le support, d'où il est facilement éliminé à l'aide d'un tampon d'élution. La méthode est pratique, technologiquement avancée et adaptée à la préparation d’un échantillon pour amplification. Cependant, une perte d'ADN est possible en raison d'une sorption irréversible sur le support, ainsi que lors de nombreux lavages. Ceci est particulièrement important lorsque l’on travaille avec de petites quantités d’ADN dans un échantillon. De plus, même des traces de GuSCN peuvent inhiber la PCR. Par conséquent, lors de l'utilisation de cette méthode, le choix correct du sorbant et le respect scrupuleux des nuances technologiques sont très importants. Il convient de noter qu'en raison du grand nombre d'étapes d'ajout et de retrait de solutions, des précautions sont nécessaires lors de la manipulation de l'échantillon, car une contamination croisée entre les échantillons et l'aérosol d'ADN résultant est possible.

Avec la procédure classique d'extraction de l'ADN au phénol-chloroforme, une bonne purification de l'ADN est obtenue, principalement à partir d'inhibiteurs de la Tag polymérase, mais des pertes importantes d'acide nucléique sont inévitables, particulièrement visibles lorsque l'on travaille avec de petits échantillons avec une faible concentration de l'agent infectieux.

Un autre groupe de méthodes de préparation d'échantillons repose sur l'utilisation d'échangeurs d'ions tels que Chilex (USA), qui, contrairement au verre, n'absorbent pas l'ADN, mais les impuretés qui interfèrent avec la réaction. En règle générale, cette technologie comprend deux étapes : l'ébullition de l'échantillon et la sorption des impuretés sur un échangeur d'ions. La méthode est extrêmement attractive de par sa simplicité d’exécution. Dans la plupart des cas, il convient au travail avec du matériel clinique. Malheureusement, il arrive parfois que des échantillons contiennent des impuretés qui ne peuvent pas être éliminées à l'aide d'échangeurs d'ions. De plus, certains micro-organismes ne peuvent pas être détruits par simple ébullition. Dans ces cas, il est nécessaire d’introduire des étapes supplémentaires de traitement des échantillons.

Lors du dépistage de masse, lorsqu'il est important d'obtenir des données statistiques, il est possible d'utiliser des méthodes simples utilisant des détergents ou en traitant le matériel biologique avec des alcalis puis en le neutralisant. Dans le même temps, l'utilisation de telles méthodes pour le diagnostic clinique peut conduire à des résultats faussement négatifs en raison de l'utilisation d'une préparation d'ADN de mauvaise qualité dans le mélange réactionnel. Ainsi, le choix de la méthode de préparation des échantillons doit être pris en compte en comprenant les objectifs de l’analyse envisagée.

Au cours de la procédure suivante - l'amplification - un échantillon contenant l'ADN de l'agent pathogène est introduit dans un petit tube à essai avec des composants qui assurent la réaction polymérase, deux types d'amorces, deux enzymes (Tag polymérase et N-uracil glycolase) et quatre types de nucléotide A, G, Ts, U. Pour réaliser la réaction de polymérase, un dispositif spécial est utilisé (thermocycleur ou amplificateur d'ADN), qui permet de modifier automatiquement la température du mélange réactionnel selon un certain programme. Lors du premier cycle de PCR, l’échantillon est chauffé à une température de 94°C pour séparer les deux brins d’ADN complémentaires. La température chute ensuite à 40-60°C, moment auquel les amorces sont attachées à un seul brin d'ADN, après quoi la température remonte à 72°C, lorsque l'activité polymérase est la plus prononcée. L'ensemble du cycle avec changements de température dure moins de 3 minutes.

Pour évaluer correctement les résultats de la PCR, il est important de comprendre que cette méthode n’est pas quantitative. Théoriquement, les produits d’amplification de molécules d’ADN à cible unique peuvent être détectés par électrophorèse après 30 à 35 cycles. Cependant, en pratique, cela n'est effectué que dans les cas où la réaction se déroule dans des conditions proches de l'idéal, ce qui est rare. Le degré de pureté de la préparation d'ADN a une influence particulièrement grande sur l'efficacité de l'amplification, c'est-à-dire la présence dans le mélange réactionnel de certains inhibiteurs, qui dans certains cas peuvent être extrêmement difficiles à éliminer. Parfois, en raison de leur présence, même des dizaines de milliers de molécules d’ADN cibles ne peuvent pas être amplifiées. Ainsi, il n’existe souvent aucune relation directe entre la quantité initiale d’ADN cible et la quantité finale de produits d’amplification.

Diverses méthodes sont utilisées pour visualiser les résultats de l’amplification. La plus courante aujourd’hui est l’électrophorèse, basée sur la séparation des molécules d’ADN selon leur taille. Pour ce faire, préparez une plaque de gel d'agarose, qui est de l'agarose solidifié après fusion dans un tampon d'électrophorèse à une concentration de 1,5 à 2,5 % avec l'ajout d'un colorant ADN spécial, par exemple du bromure d'éthidium. L'agarose solidifié forme un réseau spatial. Lors du versement à l'aide de peignes, des puits spéciaux se forment dans le gel, dans lesquels des produits d'amplification sont ensuite ajoutés. La plaque de gel est placée dans un appareil d'électrophorèse sur gel horizontal et la source est connectée Tension continue. L'ADN chargé négativement commence à se déplacer dans le gel du moins au plus. Dans ce cas, les molécules d’ADN les plus courtes se déplacent plus rapidement que les plus longues. La vitesse de déplacement de l'ADN dans le gel est influencée par la concentration d'agarose, l'intensité du champ électrique, la température, la composition du tampon d'électrophorèse et, dans une moindre mesure, la composition de l'ADN. Toutes les molécules de même taille se déplacent à la même vitesse. Le colorant est incorporé (intercalé) par des groupes planaires dans les molécules d'ADN. Après l'électrophorèse, qui dure de 10 minutes à 1 heure, le gel est placé sur un filtre transilluminateur qui émet de la lumière dans la gamme ultraviolette (254 - 310 nm). L'énergie ultraviolette absorbée par l'ADN à 260 nm est transférée au colorant, le faisant émettre une fluorescence dans la région rouge orangé du spectre visible (590 nm).

Le standard ADN du micro-organisme recherché est utilisé comme « contrôle positif ». La taille des amplicons non spécifiques peut être plus grande ou plus petite par rapport au « contrôle positif ». Dans le pire des cas, ces tailles peuvent coïncider et sont lues comme positives en électrophorèse.

Le « contrôle positif » permet de s'assurer que tous les composants inclus dans le mélange réactionnel assurent le déroulement normal de la réaction. Dans le même temps, une préparation d'ADN préparée pour la PCR à partir de matériel biologique peut contenir des impuretés d'inhibiteurs, qui réduisent considérablement l'efficacité de la réaction et conduisent dans certains cas à l'absence d'amplicons spécifiques même en présence de l'agent pathogène souhaité. Il est nécessaire de surveiller la progression de l'amplification dans chaque tube à essai avec le mélange réactionnel, pour lequel un « contrôle interne » supplémentaire est utilisé, qui est tout étalon d'ADN différent de l'ADN du micro-organisme souhaité.

Pour les systèmes de tests infectieux, on utilise parfois, par exemple, le gène p-globine, aux extrémités duquel, à l'aide de manipulations de génie génétique, des coupes d'ADN homologues aux amorces incluses dans le système de test sont cousues. Si un « contrôle interne » est ajouté au mélange réactionnel, il deviendra la même cible pour l’hybridation des amorces que l’ADN chromosomique de l’agent infectieux souhaité. La taille du produit d'amplification du contrôle interne est sélectionnée de telle sorte qu'elle soit 2 fois ou plus grande que les amplicons formés à partir de l'amplification de l'ADN de micro-organisme souhaité. En conséquence, si l'ADN du « contrôle interne » est ajouté au mélange réactionnel avec l'échantillon à tester, alors, quelle que soit la présence d'un micro-organisme dans l'échantillon biologique, le « contrôle interne » provoquera la formation d'amplicons spécifiques, mais significativement plus long (plus lourd) que l’amplicon du micro-organisme. La présence d'amplicons lourds dans le mélange réactionnel indique l'évolution normale de la réaction d'amplification et l'absence d'inhibiteurs. Si des amplicons de la taille requise et un « contrôle interne » ne sont pas formés, nous pouvons conclure qu'il existe des impuretés indésirables dans l'échantillon analysé qui devraient être éliminées, mais pas à l'absence de l'ADN souhaité.

Malgré tout l’attrait de cette approche, elle présente un défaut important. Ainsi, si l'ADN souhaité est présent dans le mélange réactionnel, alors l'efficacité de son amplification diminue fortement en raison de la compétition avec le « contrôle interne » des amorces. Ceci est fondamentalement important en cas de faibles concentrations d’ADN dans l’échantillon de test et peut conduire à des résultats faussement négatifs. Néanmoins, à condition que le problème de la compétition pour les amorces soit résolu, cette méthode de contrôle de l’efficacité de l’amplification sera certainement très utile.

Fig. 3 Deuxième cycle d'amplification de l'ADN

. Détection des produits d'amplification

). Méthode d'électrophorèse horizontale

L'une des méthodes permettant de visualiser les résultats de l'amplification est la méthode d'électrophorèse, basée sur la séparation des molécules d'ADN par taille. Dans la plupart des méthodes, à cette étape, le mélange de produits d'amplification obtenu à la 2ème étape est séparé par électrophorèse horizontale dans un gel d'agarose. Avant la séparation électrophorétique, une solution de bromure d'éthidium est ajoutée au mélange d'amplification, qui forme des composés interstitiels forts avec des fragments d'ADN double brin. Ces composés sont capables d'être fluorescents sous irradiation UV, qui est enregistrée sous forme de bandes lumineuses après séparation électrophorétique du mélange d'amplification dans un gel d'agarose. La luminosité des bandes du produit d'amplification peut varier. C'est pourquoi il est souvent d'usage dans les laboratoires de PCR d'évaluer le résultat par trois, quatre ou trois système en cinq points. Cependant, il ne peut pas être associé à la quantité initiale d’ADN cible dans l’échantillon. Souvent, une diminution de la luminosité des bandes est associée à une diminution de l'efficacité de l'amplification sous l'influence d'inhibiteurs ou d'autres facteurs.

Fig.4 Détection des produits d'amplification par électrophorèse horizontale

). Méthode d'électrophorèse verticale

La méthode d'électrophorèse verticale est fondamentalement similaire à l'électrophorèse horizontale. Leur différence est que dans ce cas, du polyacrylamide est utilisé à la place de l'agarose. Elle est réalisée dans appareil photo spécial pour électrophorèse verticale. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide a une plus grande résolution que l'électrophorèse sur agarose et permet de distinguer des molécules d'ADN de différentes tailles avec une précision d'un nucléotide. La préparation du gel de Polyacrylamide est un peu plus compliquée que celle du gel d'agarose. De plus, l'acrylamide est une substance toxique. Étant donné qu'il est rarement nécessaire de déterminer la taille d'un produit d'amplification avec une précision de 1 nucléotide, cette méthode n'est pas utilisée dans les travaux de routine.

3). Méthode de sonde d'hybridation

En alternative à la méthode de détection électrophorétique, qui présente certains inconvénients : subjectivité dans la lecture des résultats, limitations dans la détermination de l'ADN de divers micro-organismes en une seule réaction, des schémas de détection par hybridation peuvent être proposés. Dans ces schémas, le fragment d'ADN formé à la suite de l'amplification s'hybride (forme des complexes à 2 brins - « hybrides ») avec une sonde oligonucléotidique spécifique. L'enregistrement de tels complexes peut être effectué par colorimétrie ou fluorimétrie.

3. MÉTHODE PCR EN TEMPS RÉEL (PCR en temps réel)

La méthode Real-Time PCR permet de détecter les produits d'amplification lors de la réaction et de suivre la cinétique d'accumulation des amplicons. Pour détecter un produit PCR, on utilise des colorants fluorescents qui fournissent une fluorescence directement proportionnelle à la quantité de produit PCR – fluorescence rapporteur. Les mécanismes de génération varient en fonction du type spécifique de PCR en temps réel.

La courbe cinétique aux coordonnées « Niveau de fluorescence du rapporteur - cycle d'amplification » a une forme en S.

Elle peut être divisée en trois étapes :

1.Étape d'initiation (lorsque les produits PCR ne sont pas encore détectés par un marqueur fluorescent).

2.Stade exponentiel (dans lequel il existe une dépendance exponentielle de la quantité de fluorescence sur le cycle PCR).

.Plateau (stade de saturation).

Fig.5 Graphique de la courbe cinétique de fluorescence par PCR en temps réel

L'enregistrement du signal fluorescent est effectué pendant le processus d'amplification sur un appareil spécial - un thermocycleur pour la PCR en temps réel. En fonction de l'augmentation de l'intensité du signal fluorescent, la concentration de la matrice d'ADN initiale est calculée à l'aide du logiciel fourni avec l'amplificateur.

Avantages de la méthode PCR en temps réel

n la capacité de détecter l'accumulation de produits d'amplification directement pendant l'amplification ;

n l'avantage fondamental est la possibilité de détecter l'accumulation d'amplicons sans ouvrir le tube, ce qui minimise le risque de résultats faussement positifs dus à la contamination des échantillons et des réactifs par des produits d'amplification ;

n une réduction significative du nombre de manipulations avec l'échantillon à tester réduit le temps, simplifie l'analyse et réduit le risque d'erreurs ;

n Cette approche permet de supprimer l'étape d'électrophorèse, ce qui conduit à une forte diminution du risque de contamination des échantillons testés par les produits d'amplification ;

n réduction des exigences pour les laboratoires PCR ;

n augmenter l'objectivité de l'interprétation des résultats d'une étude PCR, puisque le traitement est effectué à l'aide du logiciel de l'appareil ;

n Le temps total de recherche est considérablement réduit de moitié, ce qui permet d'obtenir les résultats dans un délai de 1,5 à 2 heures après l'arrivée du matériel clinique au laboratoire ;

n Cette méthode permet pour la première fois de quantifier la teneur en ADN d'un micro-organisme dans un échantillon clinique ;

n l'utilisation de sondes d'hybridation ainsi que d'amorces augmente la spécificité de l'analyse ;

n la possibilité d'un enregistrement simultané indépendant du signal fluorescent provenant de plusieurs sondes d'ADN d'hybridation permet l'identification dans une étude de plusieurs régions différentes de cibles d'ADN identiques ou différentes.

. AVANTAGES DE LA MÉTHODE PCR

n Identification directe des agents pathogènes des maladies infectieuses

La méthode PCR donne une indication directe de la présence d'un fragment d'ADN spécifique de l'agent pathogène dans le matériel prélevé sur le patient.

n Haute spécificité de la PCR

À l'aide de la méthode PCR, un fragment d'ADN est isolé dans le matériel étudié, qui est propre à un agent pathogène spécifique - une bactérie ou un virus. Cette section d’ADN est unique et n’est typique d’aucune infection sur terre. La spécificité est déterminée par la séquence nucléotidique des amorces, ce qui élimine la possibilité d'obtenir de faux résultats, contrairement à la méthode de test immuno-enzymatique, où les erreurs dues aux antigènes à réaction croisée sont courantes.

n PCR haute sensibilité

La méthode PCR vous permet de détecter même des cellules individuelles de bactéries ou de virus. Le diagnostic PCR détecte la présence d'agents pathogènes de maladies infectieuses dans les cas où cela ne peut être réalisé par d'autres méthodes (immunologiques, bactériologiques, microscopiques). La sensibilité de l'analyse PCR est de 10 à 1 000 cellules par échantillon (la sensibilité des tests immunologiques et microscopiques est de 103 à 105 cellules).

n La polyvalence de la PCR

Étant donné que l'agent pathogène peut être contenu dans n'importe quelle sécrétion et tissu biologique, la recherche par PCR peut utiliser presque tous les matériaux, y compris ceux inaccessibles à la recherche par d'autres méthodes - mucus, urine, sang, sérum, crachats, éjaculat, grattages de cellules épithéliales.

n Grande vitesse d'obtention des résultats d'analyse PCR

L'analyse PCR ne nécessite pas d'isoler et de cultiver une culture de l'agent pathogène, ce qui prend beaucoup de temps. Une méthode unifiée de traitement des biomatériaux et de détection des produits de réaction, ainsi que l'automatisation du processus d'amplification permettent d'effectuer une analyse complète en 4 à 4,5 heures.

n Capacité à diagnostiquer tout type d’infection

La haute sensibilité de la méthode PCR permet de diagnostiquer une infection non seulement au stade aigu de la maladie, mais également des infections chroniques et même la présence de bactéries ou de virus isolés.

Actuellement, l'avantage de l'analyse PCR par rapport à la méthode culturelle de détection des micro-organismes est le suivant :

Une fréquence plus élevée de détection du microbe, dépassant de 6 à 7 % le même indicateur lors de l'utilisation de la méthode de culture. Ces différences s’expliquent par la mort possible du microbe lors du stockage et du transport, alors que la PCR est capable de détecter les formes non viables du micro-organisme.

Le temps nécessaire pour détecter un agent pathogène par la méthode de culture est d'environ 4 jours, tandis que l'utilisation de la PCR permet la détection du microbe en 4 à 5 heures.

L'utilisation de la technologie PCR permet la détection d'agents pathogènes, tels que la chlamydia, dans des échantillons prélevés de manière non invasive, comme l'urine.

La méthode PCR est particulièrement efficace pour diagnostiquer les formes de micro-organismes difficiles à cultiver, incultivables et persistantes, souvent rencontrées dans les infections latentes et chroniques, car cette méthode évite les difficultés liées à la culture de tels micro-organismes dans des conditions de laboratoire.

n Possibilité de réaliser surveiller et évaluer l’efficacité du traitement, notamment pour les maladies virales.

n Possibilité de détection sous-types et souches individuels de virus et de bactéries.

n Possibilité de définition plusieurs types d'agents pathogènes (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) à partir d'un tube contenant du matériel biologique.

Cette méthode est comparable en intensité de travail aux méthodes classiques (dosage immunoenzymatique, immunofluorescence, etc.), mais fournit des informations diagnostiques plus fiables, permettant la détection directe de l'ADN ou de l'ARN d'un agent infectieux dans le matériel clinique. Par conséquent, la méthode PCR, ainsi que la méthode de culture, sont reconnues comme la « référence » pour le diagnostic des maladies infectieuses.

5. LIMITES DE LA METHODE PCR

· Au cours de la réaction, l'ADN des micro-organismes vivants et morts est amplifié

· Possibilité de réaction croisée

La sélection des amorces est basée sur les connaissances existantes sur le génome d'un micro-organisme donné et similaire. Théoriquement, il existe une possibilité que le même fragment soit présent dans d'autres micro-organismes dont le génome n'a pas encore été déchiffré et qui n'ont pas été testés pour la possibilité de réactions croisées. La présence de tels micro-organismes dans l’échantillon peut conduire à un résultat de test faussement positif.

· Variabilité des micro-organismes

Bien que lors de la construction d'un système de test, le fragment du génome utilisé pour l'amplification soit sélectionné dans une région hautement conservée, la variabilité des micro-organismes peut conduire au fait que certains génotypes ou souches de l'agent pathogène étudié peuvent acquérir des mutations dans la région amplifiée du génome. , et deviennent ainsi insaisissables pour ce système de test.

Les deux derniers points sont importants pour les développeurs de kits de diagnostic PCR. Des normes ont désormais été élaborées pour réglementer la quantité de tests (y compris les tests de réactions croisées, ainsi que les tests de souches connues de l'agent pathogène détecté) qu'un système de test doit subir avant d'arriver sur le marché.

6. APPLICATION DE LA METHODE PCR

diagnostic par polymérase maladie infectieuse

La PCR est utilisée dans de nombreux domaines pour l’analyse et les expériences scientifiques :

1. médecine légale

La PCR est utilisée pour comparer ce que l’on appelle les « empreintes génétiques ». Un échantillon de matériel génétique provenant de la scène du crime est requis - sang, salive, sperme, cheveux, etc. Celui-ci est comparé au matériel génétique du suspect. Une très petite quantité d’ADN suffit, en théorie une copie. L'ADN est décomposé en fragments puis amplifié par PCR. Les fragments sont séparés par électrophorèse de l'ADN. Le modèle résultant de la disposition des bandes d’ADN est appelé empreinte génétique.

2. établir la paternité

Lors de l'analyse des résultats de l'électrophorèse de fragments d'ADN amplifiés par PCR père-enfant-mère, on découvre que l'enfant héritera de certaines caractéristiques de l'empreinte génétique des deux parents, ce qui donne une empreinte unique. Même si les empreintes génétiques sont uniques (sauf dans le cas de vrais jumeaux), des liens familiaux peuvent néanmoins être établis par la prise de plusieurs empreintes digitales. La même méthode peut être appliquée, légèrement modifiée, pour établir une relation évolutive entre les organismes.

3. diagnostic médical

La PCR permet d'accélérer et de faciliter considérablement le diagnostic des maladies héréditaires et maladies virales. Le gène d'intérêt est amplifié par PCR à l'aide d'amorces appropriées, puis séquencé pour identifier les mutations. Les infections virales peuvent être détectées immédiatement après l’infection, des semaines ou des mois avant l’apparition des symptômes.

4. clonage de gènes

Le clonage de gènes est le processus d'isolement de gènes et, à la suite de manipulations de génie génétique, d'obtention d'une grande quantité du produit d'un gène donné. La PCR est utilisée pour amplifier un gène, qui est ensuite inséré dans un vecteur - un morceau d'ADN qui transfère un gène étranger dans le même organisme ou dans un autre organisme propice à la croissance. Par exemple, des plasmides ou de l'ADN viral sont utilisés comme vecteurs. L'insertion de gènes dans un organisme étranger est généralement utilisée pour produire le produit de ce gène - un ARN ou, le plus souvent, une protéine. De cette manière, de nombreuses protéines sont obtenues en quantités industrielles pour être utilisées en agriculture, en médecine, etc.

5. Séquençage de l'ADN

Dans une méthode de séquençage utilisant un marquage fluorescent ou isotope radioactif La PCR des didésoxynucléotides en fait partie intégrante, puisque c'est lors de la polymérisation que les dérivés nucléotidiques marqués par un marqueur fluorescent ou radioactif sont insérés dans la chaîne d'ADN. Cela arrête la réaction, permettant de déterminer les positions de nucléotides spécifiques après la séparation des chaînes synthétisées dans le gel.

6. mutagenèse

Actuellement, la PCR est devenue la principale méthode de mutagenèse (modification de la séquence nucléotidique de l'ADN). L'utilisation de la PCR a permis de simplifier et d'accélérer la procédure de mutagenèse, ainsi que de la rendre plus fiable et reproductible.

7. diagnostic des maladies infectieuses

L'utilisation de la méthode PCR pour diagnostiquer les maladies infectieuses de nature bactérienne et virale est d'une importance capitale pour résoudre de nombreux problèmes de microbiologie et d'épidémiologie. L'utilisation de cette méthode contribue également au développement Recherche basique dans le domaine de l'étude des maladies infectieuses chroniques et mal comprises.

8. diagnostic des maladies virales

Les avantages les plus complets de la PCR dans le diagnostic des maladies virales peuvent être démontrés en considérant le processus infectieux provoqué par le virus de l'hépatite C (VHC). spécial valeur diagnostique La PCR pour détecter ce virus représente les raisons suivantes:

) absence de méthode de culture du VHC ; 2) il n’existe pas de kits de diagnostic antigénique ; 3) la réaction de formation d'anticorps contre le VHC est si lente qu'un diagnostic ne peut généralement pas être posé pendant la phase aiguë de l'infection.

Par conséquent, l’utilisation de la technologie PCR pour le diagnostic, le contrôle de la qualité du traitement et l’analyse épidémiologique de la morbidité causée par le VHC est désormais généralement acceptée.

Parallèlement, seule la technologie PCR permet de résoudre les problèmes suivants : 1) diagnostic Infection aiguë avec détection tardive des anticorps anti-VHC ; 2) réaliser le diagnostic étiologique de l'hépatite C chronique chez les patients immunodéprimés ; 3) évaluer l'efficacité du traitement antiviral ; 4) détecter la virémie chez les donneurs de sang présentant des taux d'aminotransférases normaux ; 5) déterminer une éventuelle contamination des produits sanguins ; 6) évaluer la prévalence du VHC.

9. application de la PCR en pneumologie et phtisiologie

Les mycoplasmes et la chlamydia sont une cause fréquente de pneumonie atypique et de bronchite chronique récurrente. Diagnostic de ces agents pathogènes méthodes traditionnelles la microscopie et la culture bactérienne sont inefficaces. La PCR permet non seulement de diagnostiquer la chlamydia et la mycoplasmose, mais également de procéder à l'identification des espèces de l'agent pathogène (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). L'utilisation de la méthode PCR peut améliorer considérablement le diagnostic précoce de la tuberculose. Actuellement, des kits PCR ont été développés et sont apparus sur le marché pour déterminer la résistance des mycobactéries aux antibiotiques.

10. Application de la PCR dans la pratique des services de transfusion sanguine

L'examen du sang des donneurs pour l'hépatite, la syphilis, le VIH par des méthodes sérologiques n'exclut pas le danger d'utiliser du sang infecté en raison de la présence d'une certaine période séronégative pour ces maladies, qui peut aller jusqu'à plusieurs semaines à partir du moment où l'agent pathogène apparaît dans le sang. La méthode la plus efficace pour tester le sang pour détecter la présence de ces agents pathogènes est la méthode PCR.

11. application de la PCR en néonatalogie

Un certain nombre de micro-organismes peuvent infecter le fœtus pendant la grossesse. Il s'agit du cytomégalovirus, du toxoplasme, du virus de l'herpès, du virus de la rubéole, des mycoplasmes, de la chlamydia, etc. L'utilisation de tests sérologiques pour déterminer ces infections chez le nouveau-né est inefficace, car la formation du système immunitaire de l'enfant se produit sur plusieurs mois et la présence d'un L'agent infectieux peut ne pas s'accompagner de la production d'anticorps spécifiques. En revanche, les anticorps maternels de la classe IgG peuvent être présents pendant longtemps dans le sang d'un nouveau-né, capables de pénétrer la barrière placentaire. Ainsi, la présence d'IgG spécifiques chez un enfant dans les premiers mois de sa vie n'indique pas la présence d'un agent pathogène. L'utilisation de l'analyse PCR augmente considérablement les possibilités de diagnostic des infections néonatales, y compris au stade intra-utérin.

12. application de la PCR dans la pratique urogynécologique

Parmi les agents infectieux affectant le tractus urogénital, une grande attention a récemment été accordée aux agents responsables des infections latentes et chroniques - la chlamydia et les mycoplasmes. Les maladies causées par ces agents pathogènes se caractérisent par des symptômes cliniques flous et une évolution chronique, entraînant souvent des dommages aux fonctions de reproduction - fausse couche, infertilité. De nombreuses études examinant l'utilisation de la méthode PCR pour la détection de Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, menées dans de grandes cliniques de différents pays, ont montré la grande efficacité de cette méthode. Il est reconnu qu’en termes de sensibilité et d’efficacité, la PCR est supérieure à la méthode de culture, acceptée comme le « gold standard ».

CONCLUSION

Ainsi, la technologie PCR est un outil puissant qui permet d'étudier et de diagnostiquer les processus infectieux chroniques et l'écologie des agents pathogènes des maladies infectieuses. La méthode de diagnostic PCR complète les méthodes de diagnostic microbiologique déjà existantes et modifie qualitativement la méthodologie pour résoudre les problèmes appliqués de la microbiologie médicale et de l'épidémiologie.

Compte tenu de ce qui précède, nous formulerons des domaines de recherche en pathologie infectieuse, dans lesquels la PCR commence à jouer un rôle de premier plan.

Diagnostic des affections infectieuses chroniques causées par la persistance de bactéries ou de virus. Il s’agit de l’application la plus évidente de la PCR à des fins diagnostiques.

La PCR est la méthode la plus efficace pour identifier et étudier les agents pathogènes qui, étant à l’état « non cultivé », sont capables d’y persister et de survivre à des conditions extérieures défavorables.

La PCR permet de déterminer la résistance aux antibiotiques chez des bactéries à croissance lente et difficiles à cultiver.

Les domaines prometteurs pour l’utilisation pratique du diagnostic PCR sont :

· diagnostic des maladies oncologiques;

· diagnostic de leucémie et de lymphomes ;

· diagnostic de cancer du sein;

· diagnostic d'autres maladies malignes ;

Diagnostic ADN des maladies bénignes et Néoplasmes malins limité par un corpus restreint mais croissant de connaissances sur les gènes associés à ces maladies ;

· Diagnostique maladies génétiques.

Le diagnostic des maladies génétiques ne peut se développer qu’après des recherches scientifiques approfondies sur le génome humain. Cependant, la communauté médicale a déjà reconnu l'importance d'étudier les bases génétiques des maladies, ainsi que la possibilité de diagnostiquer et de traiter une maladie avant l'apparition de ses symptômes ;

· identification personnelle : médecine légale, criminologie ; transplantation d'organes et de tissus; détermination de la paternité. Les experts évaluent ce domaine du marché du diagnostic ADN comme l'un des plus importants et à la croissance la plus rapide ;

Souvent utilisé comme méthode rapide pour l’indication et l’identification des virus.

Cette méthode a été développée pour la première fois par K. Mullis (États-Unis) en 1983. En raison de sa sensibilité élevée, de sa spécificité et de sa facilité de mise en œuvre, elle est largement utilisée en génétique, en médecine légale, en diagnostic et dans d'autres domaines.

L'essence de la méthode est l'amplification, c'est-à-dire l'augmentation du nombre de copies de fragments strictement définis d'une molécule d'ADN in vitro. Cette méthode utilise un mécanisme matriciel et le principe de complémentarité. Deux chaînes polynucléotidiques simples (acides nucléiques) sont capables d'être liées par des liaisons hydrogène en une chaîne double brin si les séquences nucléotidiques de l'une correspondent exactement à la séquence nucléotidique de l'autre afin que leurs bases azotées puissent former de l'adénine-thymine et de la guanine-cytosine. paires.

La PCR est basée sur l'amplification de l'ADN à l'aide d'une ADN polymérase thermostable, qui synthétise des brins d'ADN mutuellement complémentaires, à partir de deux amorces. Une amorce est un fragment d'ADN composé de 20 à 30 nucléotides. Ces amorces sont complémentaires des brins d'ADN opposés. Lors de la synthèse de l'ADN, des amorces sont insérées dans la chaîne de molécules d'ADN nouvellement synthétisées.

Habituellement, la PCR est réalisée en 25 à 40 cycles. Chaque cycle comprend trois étapes : la première est la dénaturation à 92-95 °C. Dans ce cas, les deux brins d’ADN divergent ; la seconde est le recuit, ou l'ajout d'amorces à 50-65°C ; le troisième est l'élongation, ou polymérisation à 68-72°C, tandis que l'ADN polymérase réalise la complétion complémentaire des chaînes matrices d'ADN à l'aide de quatre types de nucléotides. À la suite d'un cycle, le matériel génétique souhaité est doublé. Les chaînes d'ADN formées au premier cycle servent de matrices pour le deuxième cycle, etc. Après le premier cycle, seul le fragment entre les deux amorces est amplifié. Ainsi, le nombre de copies de la région amplifiée est doublé, ce qui permet de synthétiser des millions (2 n) de fragments d'ADN en 25 à 40 cycles - une quantité suffisante pour leur indication par diverses méthodes (la méthode d'hybridation des sondes contenant un certain étiquette, électrophorèse, etc.) . Le plus souvent, l'électrophorèse sur gel d'agarose avec coloration au bromure d'éthidium est utilisée à cette fin.

Dans la PCR à partir de coupes d'ADN d'un agent pathogène, on utilise des amorces qui possèdent une séquence unique de nucléotides caractéristique uniquement d'un agent pathogène particulier.

La procédure pour réaliser la PCR se résume à la suivante : une matrice d'ADN est isolée du matériel étudié ; dans un tube à essai, l'ADN isolé est combiné avec un mélange d'amplification comprenant de l'ADN polymérase, les 4 types de nucléotides, 2 types d'amorces, du MgCl, un tampon, de l'eau désionisée et de l'huile minérale. Ensuite les tubes sont placés dans un cycleur, et l'amplification est réalisée automatiquement selon un programme donné correspondant au type d'agent pathogène. Les résultats sont enregistrés le plus souvent par électrophorèse dans un gel d'agarose à 1-2% en présence de bromure d'éthidium, qui se combine avec des fragments d'ADN et se révèle sous forme de bandes lumineuses lorsque le gel est irradié aux rayons UV sur un transilluminateur. Toutes les procédures PCR prennent 1 à 2 jours ouvrables.

Afin d'augmenter la spécificité et la sensibilité de la PCR, différentes options sont utilisées : la PCR nichée ; PCR avec un « hot start » utilisant une couche de paraffine ou bloquant les centres actifs de la polymérase avec des anticorps monoclonaux. En outre, certaines entreprises produisent des kits de réactifs lyophilisés pour l’amplification de l’ADN, qui accélèrent le processus PCR et réduisent le risque de résultats faussement positifs.

Une nouvelle technologie, la PCR en temps réel, est actuellement en cours d'introduction. Sa caractéristique fondamentale est la surveillance et l'analyse quantitative de l'accumulation de produits de réaction en chaîne par polymérase ainsi que l'enregistrement et l'interprétation automatiques des résultats obtenus. Cette méthode ne nécessite pas d’étape d’électrophorèse, ce qui réduit les exigences des laboratoires en matière de PCR. La PCR en temps réel utilise des sondes oligonucléotidiques marquées par fluorescence pour détecter l'ADN au fur et à mesure de son amplification. La PCR en temps réel permet une analyse complète d'un échantillon en 20 à 60 minutes et constitue théoriquement un moyen de détecter ne serait-ce qu'une seule molécule d'ADN ou d'ARN dans un échantillon.

Le système de détection de produits en amplification en chaîne par polymérase en temps réel (surveillance PCR) permet de suivre l'accumulation d'ADN amplifié cycle par cycle. Le système comprend également une sonde oligonucléotidique capable de se fixer (s'hybrider) au segment interne de l'ADN cible. La sonde est marquée à l’extrémité 5’ avec un colorant rapporteur fluorescent et à l’extrémité 3’ avec un colorant bloqueur (colorant quencher). Au fur et à mesure que le produit PCR s'accumule, la sonde s'y hybride, mais aucune luminescence ne se produit en raison de la proximité entre le rapporteur et le bloqueur. Suite à la copie de la séquence, la polymérase atteint l’extrémité 5’ de la sonde. L'activité exonucléase 5'-3' de la polymérase détache l'étiquette fluorescente de l'extrémité 3' de la sonde, libérant ainsi le rapporteur fluorescent de sa connexion avec le bloqueur de signal, ce qui entraîne une augmentation de la fluorescence. Le niveau de fluorescence est donc proportionnel à la quantité de produit de réaction spécifique. Il est important que les résultats de la PCR soient enregistrés par la présence de fluorescence dans des tubes fermés et, ainsi, un autre des principaux problèmes de cette méthode est résolu - le problème de la contamination par les amplicons.

Avantages de la PCR : rapidité d’analyse ; sensibilité et spécificité élevées; quantité minimale de matériel de test ; simplicité d'exécution et possibilité d'automatisation complète.

Étant donné que la sensibilité de la PCR peut aller jusqu'à la détection d'une copie de la matrice d'ADN, il existe haut degré risque d’obtenir des résultats faussement positifs. Par conséquent, lors de la réalisation de tests PCR, un laboratoire de diagnostic génétique doit strictement se conformer à des exigences particulières en matière d'agencement et de mode de fonctionnement.

La PCR est l'une des méthodes complémentaires existantes en diagnostic virologique. Cette réaction est très importante pour le diagnostic des infections virales lorsque les antigènes viraux ou les anticorps spécifiques du virus ne peuvent pas être détectés et lorsque la présence d'acide nucléique viral peut être la seule preuve d'infection, en particulier dans les infections latentes et mixtes.

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La réaction en chaîne par polymérase est connue depuis 30 ans. Il est largement utilisé dans de nombreux domaines, de l’archéologie à la génétique.

C'est la méthode PCR qui permet d'établir la paternité, mais elle est le plus souvent utilisée pour identifier diverses maladies infectieuses dans le corps humain.

Comment se déroule l’analyse PCR et de quoi s’agit-il ? Nous allons essayer de répondre à ces questions en détail.

Analyse PCR - qu'est-ce que c'est ?

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) est une méthode de diagnostic génétique moléculaire de haute précision qui vous permet d'identifier diverses infections et maladies héréditaires, tant au stade aigu que chronique, et bien avant que la maladie ne se manifeste.

La méthode PCR est absolument spécifique et, si elle est effectuée correctement, elle ne peut donner résultat faussement positif. Autrement dit, s’il n’y a pas d’infection, l’analyse ne montrera jamais son existence. C'est pourquoi, très souvent, pour confirmer le diagnostic, ils effectuent en outre un test PCR pour déterminer l'agent pathogène et sa nature.

La réaction en chaîne par polymérase (PCR) a été développée par Kary Mullis (États-Unis) en 1983, pour laquelle il a reçu le prix Nobel de chimie en 1993.

Quel est l'avantage de cette méthode ?

Le diagnostic par cette méthode vous permet de trouver l'agent pathogène directement dans le gène contenu dans le matériel étudié. Il s’agit du test le plus précis pour détecter les infections sexuellement transmissibles, les infections cachées et diverses maladies sexuellement transmissibles.

Différences entre le diagnostic PCR et les autres méthodes de recherche en laboratoire sont les suivants:

• la méthode vise à identifier l'agent pathogène lui-même ;
• Le diagnostic par la méthode PCR se distingue par sa polyvalence : pour détecter plusieurs pathogènes ;
• maladies, un seul échantillon biologique du patient suffit ;
• la méthode est très sensible et ne s'accompagne pas d'autres réactions croisées.

De plus, l'avantage du diagnostic PCR est que tout matériel biologique du patient peut être analysé : sang, sécrétions génitales, urine, sperme.

Quelles infections un frottis PCR peut-il détecter ?

Un grand nombre d'agents infectieux peuvent être présents dans l'organisme, y compris des agents « cachés » qui ne se manifestent pas longtemps.

Analyse de frottis PCR vous permet de détecter de telles infections:

• uréplasmose des organes génitaux;
• candidose();
• herpès;
• présence de cellules cancéreuses;
• évaluer le statut hormonal;

Le matériel de test pour la PCR est généralement constitué d’expectorations, de salive, d’urine et de sang. Avant de procéder à l'analyse, vous devez vous y préparer soigneusement en consultant au préalable un médecin.

Le sang destiné à la PCR est généralement donné à jeun. De bons résultats sont montrés par analyse lorsque le matériel de recherche est prélevé dans le canal cervical ou l'urètre. Dans ce cas, il est préférable d'effectuer un diagnostic PCR au plus tard un jour après un rapport sexuel.

Types de PCR

La PCR est utilisée dans de nombreux domaines pour des tests et des expériences scientifiques. Il existe différentes méthodes d'analyse :

1. PCR par transcription inverse(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - utilisé pour amplifier, isoler ou identifier une séquence connue à partir d'une bibliothèque d'ARN.
2. PCR inversée(PCR inverse) - utilisé lorsque seule une petite région de la séquence souhaitée est connue. Cette méthode est particulièrement utile lorsqu’il s’agit de déterminer des séquences voisines après l’insertion de l’ADN dans le génome.
3. La PCR nichée est utilisée pour réduire le nombre de sous-produits de réaction. Deux paires d'amorces sont utilisées et deux réactions séquentielles sont réalisées.
4. PCR asymétrique(eng. PCR asymétrique) - est réalisée lorsqu'il est nécessaire d'amplifier principalement l'un des brins de l'ADN d'origine. Utilisé dans certaines techniques d'analyse de séquençage et d'hybridation.
5. PCR quantitative(Quantitative PCR, Q-PCR (anglais)) ou PCR en temps réel - utilisé pour surveiller directement la mesure de la quantité d'un produit PCR spécifique dans chaque cycle de réaction.
6. PCR étape par étape (Touchdown PCR) - en utilisant cette approche, l'influence de la liaison non spécifique des amorces est réduite.
7. PCR spécifique au groupe(eng. PCR spécifique à un groupe) - PCR pour des séquences apparentées au sein de la même espèce ou entre différentes espèces, en utilisant des amorces conservatrices pour ces séquences.

Si la séquence nucléotidique de la matrice est partiellement connue ou inconnue du tout, des amorces dégénérées peuvent être utilisées, dont la séquence contient des positions dégénérées dans lesquelles n'importe quelle base peut être localisée. Par exemple, la séquence d'amorce pourrait être : ...ATH..., où H est A, T ou C.

Quels matériels biologiques sont étudiés ?

Divers milieux biologiques et fluides humains peuvent servir de matériau pour la recherche par PCR, dans lesquels de l'ADN bactérien étranger ou de l'ADN ou de l'ARN viral peuvent être détectés :

1. Urine. Peut être utilisé pour les infections des voies génito-urinaires chez l'homme et des organes urinaires chez la femme (chez l'homme, l'utilisation de l'urine comme matériau remplace le grattage épithélial).
2. Expectorations. Il est utilisé pour diagnostiquer la tuberculose et, plus rarement, pour diagnostiquer les formes respiratoires de chlamydia et de mycoplasmose. Les crachats en quantité de 15 à 20 ml sont collectés dans un flacon stérile (jetable).
3. Fluides biologiques. Le jus de la prostate, le liquide pleural, rachidien, amniotique, le liquide articulaire, le lavage broncho-alvéolaire, la salive sont collectés selon les indications.
4. Raclages épithéliaux des muqueuses. Généralement utilisé pour diagnostiquer les maladies sexuellement transmissibles (MST), telles que la gonorrhée, la chlamydia, la mycoplasmose, l'uréeplasmose, la trichomonase, la gardnerellose, l'herpès et d'autres infections qui affectent les muqueuses.
5. Biopsies. Le plus souvent, des biopsies de l'estomac et du duodénum sont utilisées pour détecter une infection à Helicobacter pylori.
6. Sang, plasma, sérum. Utilisé pour l'analyse PCR des virus de l'hépatite B, C, D, G, de l'herpès, du CMV, du VIH et la recherche des gènes humains.

Comment se préparer à l'examen ?

La fiabilité du résultat PCR dépend directement de la soumission correcte du matériel à l'examen. Le matériel ne doit pas être contaminé, sinon le résultat de l'étude ne sera pas objectif. Au plus recommandations importantes Avant de passer un test PCR, les conditions suivantes s'appliquent :

1. L'urine est collectée le matin dans un récipient stérile.
2. Un test sanguin pour les infections doit être effectué à jeun le matin.
3. Vous ne devez pas être sexuellement actif la veille du test.

Le résultat de l'analyse sera prêt 1,5 à 2 jours après la procédure en question. Il existe des situations où le résultat peut être préparé le même jour.

Décodage de l'analyse OPC

Le processus d'interprétation de la recherche présentée se distingue par sa simplicité. résultats Analyse PCR peut être reçu 1,5 à 2 jours après la soumission du matériel. Dans certains cas, le résultat est prêt dès le premier jour, et voici ce que cela peut signifier :

• Résultat négatif montre que le matériel de diagnostic ne contient pas l’agent infectieux souhaité.
• PCR positif signifie que l’ADN ou l’ARN de l’agent pathogène est présent dans le corps humain.

Dans certains cas, les micro-organismes sont quantifiés. Cela est particulièrement vrai pour les maladies provoquées par des micro-organismes opportunistes. Puisque ces bactéries présentent leur impact négatif seulement en quantités excédentaires.

En outre, l'analyse PCR quantitative est importante pour choisir les tactiques thérapeutiques et pour surveiller le traitement des infections virales telles que le VIH et les virus de l'hépatite.

Quelle est la précision du diagnostic PCR des infections ?

La méthode PCR se caractérise par une précision, une spécificité et une sensibilité élevées. Cela signifie que cette analyse est capable de :

• déterminer avec précision la présence ou l'absence d'infection ;
• indiquer exactement de quel type d'infection il s'agit (spécificité) ;
• détecter une infection même avec une très faible teneur en ADN microbien dans le matériel biologique,
• qui a été testé (sensibilité).

Analyse PCR : prix et timing

Le prix d’un test spécifique dépendra de l’infection pour laquelle vous serez testé. Prix ​​et conditions approximatifs :

1. STI : 300-500 roubles, durées – 1 jour ;
2. Virus d'Epstein-Barr, virus du papillome humain, herpès, cytomégalovirus : 300-500 roubles, durée - 1 jour ;
3. Hépatite A, B, C, D, G : analyse qualitative 650 roubles, analyse quantitative 2000 roubles. Conditions – jusqu'à 5 jours ;
4. Anticorps contre le virus de l'hépatite C, total (Anti-VHC) – 420 roubles ;
5. Anticorps contre le virus de l'hépatite C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 roubles ;
6. Helicobacter pylori : 300-400 roubles, durée – 1 jour ;
7. VIH (anticorps et antigènes) – 380 roubles ;
8. ARN du VIH, de haute qualité – 3 500 roubles ;
9. ARN du VIH, quantitativement – ​​11 000 roubles.

Pour économiser de l'argent, vous pouvez choisir un forfait d'analyse fixe. Ce service est proposé par la plupart des cliniques où vous pouvez vous faire tester selon la méthode PRC (invitro, onclinic, etc.).

La réalisation d'une analyse PCR (diagnostic PCR) commence par la collecte de matériel pour examen par un gynécologue, un urologue ou un dermatovénérologue. La qualité et la fiabilité des résultats obtenus ultérieurement sont assurées par les plus hautes qualifications et la vaste expérience des médecins du centre médical Euromedprestige, qui respectent toutes les règles nécessaires à la réalisation de l'analyse PCR : stérilité totale, utilisation uniquement de matériel jetable.

Le matériau collecté par la brosse est placé dans un récipient contenant une solution saline. Après le prélèvement, les échantillons doivent être livrés au laboratoire PCR dans les plus brefs délais.

L'analyse PCR est réalisée en laboratoire en trois étapes :

1. Extraction d'ADN
2. Amplification de fragments d'ADN
3. Détection des produits d'amplification de l'ADN

L'extraction d'ADN est l'étape initiale du diagnostic PCR, dont l'essence est la suivante : le médecin prélève du matériel de recherche sur le patient et le soumet à un traitement spécial. Pendant le traitement, la double hélice d'ADN est divisée en brins individuels. Un liquide spécial est ajouté au matériel du patient, qui dissout les substances organiques qui interfèrent avec la « pureté » de la réaction. Cela élimine les lipides, les acides aminés, les peptides, les glucides, les protéines et les polysaccharides. En conséquence, de l’ADN ou de l’ARN se forme.

Le principe de la méthode PCR est la « construction » de nouvelles infections à ADN ou ARN. Cela ne peut se faire sans retirer le matériel cellulaire.

Le temps consacré à l’extraction de l’ADN dépend de l’agent causal de l’infection et du type de matériel utilisé pour la recherche PCR. Par exemple, il faut 1,5 à 2 heures pour préparer le sang pour l'étape suivante.

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Amplification de l'ADN

Pour réaliser l'étape suivante du diagnostic de l'ADN - l'amplification de l'ADN - les médecins utilisent ce qu'on appelle des matrices d'ADN - des molécules d'ADN d'infections, sur lesquelles le « clonage » d'ADN se produira ensuite. Il a déjà été mentionné que la présence de l'ADN complet de l'infection n'est pas nécessaire : pour réaliser cette étape, il suffit d'un petit morceau de la molécule d'ADN, caractéristique uniquement d'un microbe donné (infection).

La base de l'amplification de l'ADN et, par conséquent, la base de tout le principe de la réaction PCR est le processus naturel de complétion de l'ADN pour tous les êtres vivants - la réplication de l'ADN, qui est réalisée en doublant une seule chaîne d'ADN.

En commençant par un seul fragment d'ADN, le médecin du laboratoire le copie et augmente le nombre de copies selon une réaction en chaîne : après le premier cycle, vous avez déjà 2 fragments, après le deuxième cycle - 4, après le troisième - 8, après le quatrième - 16, puis 32 , 64, 128, 256... À chaque cycle, le nombre de copies double, et après vingt cycles, le décompte passe déjà en millions, et après trente - en milliards. Le cycle dure quelques minutes et se résume à un certain changement de température dans un très petit réacteur chimique. Ici, dans la solution, tous les composants nécessaires à la synthèse sont présents en quantité suffisante, tout d'abord les nucléotides A, G, T et C, et des opérations chimiques préparatoires délicates sont également effectuées pour qu'une copie exacte soit immédiatement prélevée de chaque segment d'ADN fini, puis à partir de cette copie - encore une copie, c'est la réaction en chaîne ramifiée.

En attachant des amorces à la chaîne d’ADN – des « morceaux » d’ADN synthétisés artificiellement (paires de nucléotides) similaires à l’ADN des microbes (infections) – deux courtes hélices constituées de deux brins de sections d’ADN sont formées, nécessaires à la synthèse des futurs ADN.

La synthèse d'une nouvelle chaîne se produit en complétant chacun des deux brins d'ADN. Le processus d'amplification se produit à l'aide d'une région spécifique - l'ADN polymérase, qui donne son nom à la méthode de laboratoire. La polymérase agit comme un catalyseur pour la réaction et surveille la fixation séquentielle des bases nucléotidiques au nouveau brin d'ADN en croissance.

Ainsi, l'amplification de l'ADN est une augmentation multiple du nombre de copies d'ADN spécifiques, c'est-à-dire inhérentes uniquement à un certain organisme. Il n’est pas nécessaire de parcourir toute la chaîne d’ADN pour détecter l’agent infectieux. Seule la zone caractéristique d’une bactérie donnée en tant qu’individu est nécessaire.

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Toutes les étapes d’amplification très répétitives se déroulent à des températures différentes. Pour effectuer l'analyse PCR, un équipement spécialement programmable est utilisé - PCR - thermostat ou amplificateur, qui modifie automatiquement les températures. L'amplification est réalisée selon un programme donné correspondant au type d'infection détectée. Selon le programme et le type d'infection détectée, le processus PCR automatisé prend de 2 à 3 heures.

Les qualifications du médecin de laboratoire effectuant l'analyse jouent un rôle important dans le diagnostic PCR ; de lui dépendent les réglages corrects de l'équipement PCR et l'interprétation des résultats. Les médecins du Centre Médical Euromedprestige possèdent une vaste expérience dans la réalisation de diagnostics ADN, ce qui garantit la fiabilité des résultats de la recherche et garantit un succès positif dans le traitement des maladies infectieuses. Réaliser des tests PCR et réaliser un diagnostic et un traitement complet des maladies infectieuses dans notre centre médical Euromedprestige.

Lors de la détection des produits d'amplification, le mélange résultant de produits d'amplification est séparé. Des solutions spéciales sont ajoutées au mélange, qui confèrent aux fragments d'ADN la capacité de devenir fluorescentes, ce qui se reflète dans des bandes lumineuses rouge orangé. La lueur qui en résulte indique la présence d'ADN de virus, de microbes ou de bactéries dans le matériel prélevé sur le patient pour analyse PCR.