Lančana reakcija polimera. Pogledajte što je "PCR" u drugim rječnicima

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

nazvan po Yasenetsky Savezna agencija za zdravstveni i socijalni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju IPO

OSNOVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodički priručnik za studente 3-4 godine

u specijalnosti opće medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovna načela metode lančane reakcije polimerazom. Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 godine studija opće medicine (060101) i pedijatrije (060103). – Krasnojarsk: Izdavačka kuća Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja KrasSMA, 2007. – 42 str.

Nastavni priručnik u potpunosti je u skladu sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte suvremene metode dijagnosticiranja nasljednih ljudskih bolesti - metoda lančane reakcije polimeraze, obrazovni materijal prilagođen je obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti izobrazbe u 3-4 godine medicinskih i pedijatrijskih fakulteta.

Recenzenti: Voditelj Odsjeka za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

"Novosibirsk State Medical University of Federal Agency for Health and Social Development", doktor medicinskih znanosti, profesor;

replikacija DNK

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nositelj genetske informacije u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s iznimkom mikroorganizama koji sadrže RNA). DNK je dvostruki lanac upleten u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. DNA lanci imaju suprotne smjerove: 5" kraj jednog lanca odgovara 3" kraju drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njena sposobnost udvostručavanja. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekule DNA događa se tijekom sintetskog razdoblja interfaze. Svaki od dva lanca "majčine" molekule služi kao predložak za "kćer". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNA sadrži jedan "majčin" lanac, a drugi je novosintetizirani "kćeri" lanac (polukonzervativna metoda). Za templatnu sintezu nove molekule DNA potrebno je da se stara molekula despira i izduži. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNA. Odsjek molekule DNA od početne točke jedne replikacije do početne točke druge naziva se replikon.

Početak replikacije je aktiviran početnice(primeri) koji se sastoje od 100-200 parova nukleotida. Enzim DNA helikaza odmotava i dijeli matičnu DNA spiralu u dvije niti, na koje se, prema principu komplementarnosti, uz sudjelovanje enzima DNA polimeraze, sklapaju "kćeri" DNA niti. Da bi enzim započeo s radom, potrebna je prisutnost početnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok nastaje interakcijom početnice s komplementarnom regijom odgovarajućeg lanca roditeljske DNA. U svakom replikonu, DNA polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca samo u jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećoj niti, kako se replikon odmotava, lanac "kćer" postupno kontinuirano raste. Na lancu koji zaostaje, lanac kćer također se sintetizira u smjeru (5`=>3`), ali u zasebnim fragmentima kako se replikon odmotava.

Stoga se dodavanje komplementarnih nukleotida "kćeri" niti događa u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima događa se istovremeno. Fragmenti i dijelovi lanaca "kćeri" sintetizirani u različitim replikonima spojeni su u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakterizira polukonzervativnost, antiparalelnost i diskontinuitet. Cijeli genom stanice replicira se jednom tijekom vremenskog razdoblja koje odgovara jednom mitotskom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, dvije molekule DNA nastaju iz jedne molekule DNA, u kojoj je jedan lanac iz matične molekule DNA, a drugi, kći, novosintetiziran (slika 1).

Riža. 1. Shema replikacije molekule DNA.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNA i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje temeljnih premaza;

3. dovršavanje lanca dječje niti.

Princip PCR metode

Osnovu PCR-a čini replikacija DNA. U PCR-u, gore navedeni procesi se provode u epruveti u cikličkom načinu rada. Prijelaz iz jednog reakcijskog stupnja u drugi postiže se promjenom temperature inkubacijske smjese. Kada se otopina zagrije na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNA. Za prelazak na sljedeću fazu - dodavanje ili "žarenje" primera - inkubacijska smjesa se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrijava na 70-72°C - optimalno za taq-DNA polimerazu - u ovoj fazi dolazi do izgradnje novog DNA lanca. Zatim se ciklus ponovno ponavlja. Drugim riječima metoda PCR je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifični dio DNK kataliziran enzimom DNK polimeraza.

Rast lanaca kćeri DNK mora se odvijati istovremeno na oba lanca majčine DNK, tako da replikacija drugog lanca također zahtijeva vlastiti početni. Stoga se u reakcijsku smjesu dodaju dva primera: jedan za lanac "+", drugi za lanac "-". Nakon što su se pričvrstili za suprotne niti molekule DNA, početnice se ograničavaju na njezin dio koji će se naknadno višestruko duplicirati ili pojačati. Duljina takvog fragmenta, nazvanog amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR faze

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze, koje se odvijaju pri različitim temperaturnim uvjetima (slika 2).

· Faza 1: denaturacija DNK . Javlja se na 93-95° 30-40 sekundi.

· Faza 2: temeljno žarenje . Pričvršćivanje početnica događa se komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNA na granicama specifične regije. Svaki par primera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: završetak DNA lanaca. Komplementarni završetak DNA lanaca događa se od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezanja početnica. Materijal za sintezu novih lanaca DNA su deoksiribonukleozid trifosfati dodani otopini. Proces sinteze katalizira enzim taq polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi lanci DNA nastali u prvom ciklusu umnožavanja služe kao predlošci za drugi ciklus umnožavanja, u kojem nastaje specifični fragment umnožavanja DNA (slika 3). U sljedećim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao predložak za sintezu novih lanaca.

Dakle, nakupljanje amplikona u otopini događa se prema formuli 2", gdje je n broj ciklusa amplifikacije. Stoga, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jednu dvolančanu molekulu DNA, tada u 30-40 ciklusa oko U otopini se nakuplja 108 molekula amplikona, što je dovoljno za pouzdanu vizualnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja provodi se u posebnom programabilnom termostatu ( termalni cikler), koji prema zadanom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za provođenje amplifikacije potrebne su sljedeće komponente:

· DNK matrica(DNA ili njezin dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Primeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida), komplementarni DNA sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se određuje). Odabir specifičnog fragmenta i odabir početnica ima ključnu ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utječe na kvalitetu analize.

· Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih lanaca DNA u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 µM)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNA polimeraza koja katalizira produljenje početnih lanaca sekvencijalnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizirane DNA, 2-3 mM).

· Puferska otopina(reakcijski medij koji sadrži ione Mg2+ potrebne za održavanje aktivnosti enzima, pH 6,8-7,8).

Kako bi se identificirale specifične regije genoma RNA virusa, kopija DNA prvo se dobiva iz RNA predloška pomoću reakcije obrnute transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Riža. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Riža. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

· klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o prepoznavanje mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o stanične tehnologije

· ekologija (kao način praćenja stanja i kvalitete okolišnih objekata i prehrambenih proizvoda)

· određivanje transgenih organizama (GMO)

Osobna identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

· opća i specifična biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriju provodi se u skladu s „Pravilima dizajna, sigurnosnim mjerama opreza, industrijskom sanitarijom, protuepidemijskim režimom i osobnom higijenom pri radu u laboratorijima (odjelima, odjelima) sanitarnih i epidemioloških ustanova zdravstvenog sustava.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike povezano je s problemom zbog visoke osjetljivosti metode – mogućnosti kontaminacija. Ulazak u tragovima pozitivne DNA u reakcijsku epruvetu (specifični produkti amplifikacije DNA – amplikoni; DNA standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNA iz kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog fragmenta DNA tijekom PCR-a i kao rezultat , do pojave lažno pozitivnih rezultata.

U procesu rada možete se susresti dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsne kontaminacije od uzorka do uzorka (tijekom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom otapanja reakcijske smjese), što dovodi do sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija produktima amplifikacije(amplikoni), što je od najveće važnosti jer se tijekom PCR procesa amplikoni nakupljaju u ogromnim količinama i idealni su produkti za reamplifikaciju.

Kontaminacija staklenog posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih stolova ili čak površine kože laboratorijskih radnika količinama amplikona u tragovima dovodi do sustavnih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnja iskustva u laboratorijima koji koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućuju nam da formuliramo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i provođenje samih analiza. Usklađenost s ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Zemljopisno su odvojeni postavljanjem u zasebne prostorije (sl. 4, 5):

· Pre-PCR soba, gdje se vrši obrada kliničkih uzoraka, izolacija DNK, priprema reakcijske smjese za PCR i izvođenje PCR-a (ukoliko postoje uvjeti, zadnje dvije faze također se preporuča provesti u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorima zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova s ​​ispitivanim tvarima čija se PCR dijagnostika provodi u ovom laboratoriju.

· Post-PCR soba, gdje se provodi detekcija proizvoda amplifikacije. Druge metode detekcije mogu se koristiti u ovoj sobi. Preporučljivo je locirati prostoriju za detekciju proizvoda umnožavanja što je dalje moguće od prostorija prije PCR-a.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim svjetiljkama s maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) pri omjeru od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala s kojima operater ima kontakt tijekom PCR analize izložene izravnom zračenju. Zračenje se provodi 1 sat prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboratorijski liječnici rade u posebnoj laboratorijskoj odjeći koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu i u jednokratnim rukavicama. Odjeća iz različitih prostorija obrađuje se odvojeno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste zasebni setovi dozatora, plastičnog i staklenog posuđa, laboratorijske opreme, ogrtača i rukavica, koji su namijenjeni za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijal i pribor u svakoj prostoriji su odgovarajuće označeni.

Sve faze rada provode se samo s potrošnim materijalom za jednokratnu upotrebu: vrhovima za automatske pipete, epruvetama, rukavicama itd. Obavezno mijenjajte vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filterom - aerosolnom barijerom kako bi se spriječilo ulazak mikrokapljica otopine u pipetu. Iskorištene cijevi i vrhovi odlažu se u posebne spremnike ili spremnike s otopinom za dezinfekciju. Klinički uzorci pohranjuju se odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka prostorija je opremljena štapićima od pamučne gaze (maramicama), pincetom, dezinfekcijskim i inaktivirajućim otopinama.

Laboratorij za PCR dijagnostiku isključuje poslove vezane uz proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže DNA sekvence ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovom laboratoriju.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti strugotina epitelnih stanica, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tekućine, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških izlučevina, biopsija.

Materijal se prikuplja u sobi za liječenje odgovarajućeg profila. Nakon uzimanja uzorke je potrebno što prije dostaviti u PCR dijagnostički laboratorij.

Uzorci se moraju uzimati sterilnim, po mogućnosti jednokratnim, instrumentima samo u jednokratnim sterilnim plastičnim epruvetama ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranim jedan sat smjesom kroma, temeljito ispranim destiliranom vodom i kalciniranim u sušionici na temperaturi od 150°C. za 1 sat.

Zona detekcije (drugi kat ili druga zgrada).

Riža. 4. PCR laboratorijski uređaj s detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi kat ili druga zgrada)

Riža. 5. PCR laboratorijski uređaj s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Riža. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija s baktericidnom lampom.

Riža. 7. Soba za pojačanje.

Riža. 8. Soba za detekciju.

Riža. 9. Uzorci krvi za DNA dijagnostiku nasljednih bolesti.

Skladištenje i transport uzoraka

Za dijagnosticiranje nasljednih bolesti uzorci krvi čuvaju se na posebnim papirnatim obrascima ili u epindorfima (plastičnim epruvetama) u smrznutom stanju dulje vrijeme (slika 9).

Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne više od 2 sata. Ako je potrebno dulje skladištenje, uzorci se mogu staviti u hladnjak na temperaturu od 2-8°C na razdoblje ne dulje od jednog dana. Dulje skladištenje (do 2 tjedna) dopušteno je zamrznuti u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka nije dopušteno.

Ako su PCR dijagnostički laboratorij i prostorija za uzimanje uzoraka geografski odvojeni, tada se prijevoz uzoraka treba obavljati u termosicama ili termospremnicima u skladu s pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za prijevoz zaraznih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Rasprostranjena je metoda sorpcije na čvrstoj fazi, koja se sastoji od dodavanja sredstva za lizu koje sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNA na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNA puferskom otopinom. Pri obradi seruma, plazme ili cijele krvi obično se koristi metoda ekstrakcije fenolom. Metoda uključuje deproteinizaciju s fenolom/kloroformom nakon čega slijedi taloženje DNA (ili RNA) s etanolom ili izopropanolom. Obrada se provodi u Eppendor P mikrocentrifugalnim epruvetama volumena 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Riža. 10. ekstrakcija DNK.

Provođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu mikrocentrifugiranu epruvetu tipa Eppendorf volumena 0,2 ili 0,5 ml te se dodaje smjesa za amplificiranje koja se sastoji od vode, PCR pufera, otopine dNTP, otopine primera i otopine. ista epruveta. Taq polimeraza (dodana u smjesu zadnja). Tipično, volumen reakcijske smjese je 25 µl. Zatim se u svaku epruvetu doda jedna kap mineralnog ulja kako bi se spriječilo isparavanje reakcijske smjese tijekom procesa umnožavanja. cijevi se prenose u programabilni termostat (pojačalo), gdje se pojačanje provodi automatski prema zadanom programu (slika 11).

Riža. jedanaest. pojačalo" Termocikler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o navedenom programu, je 2-3 sata. Paralelno s eksperimentalnim uzorcima stavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka dodaje kontrolni DNA preparat proučavanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži DNK koji se ispituje. Negativna kontrola je neophodna kako bi se provjerilo da reakcijske komponente ne sadrže DNK zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Prijava rezultata

Umnoženi specifični fragment DNA detektira se elektroforezom u agaroznom gelu u prisutnosti etidijevog bromida. Etidijev bromid tvori stabilan intersticijski spoj s fragmentima DNA, koji se pojavljuje u obliku svjetlećih traka kada se gel ozrači UV zračenjem valne duljine 290-330 nm. Ovisno o veličini amplikona nastalih kao rezultat PCR-a, koristi se gel s udjelom agaroze od 1,5% do 2,5%. Za pripremu agaroznog gela smjesa agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenoj kupelji te se doda otopina etidijevog bromida. Smjesa ohlađena na 50-60°C izlije se u kalup u sloju debljine 4-6 mm i posebnim češljevima se u gelu naprave džepovi za nanošenje uzorka. Češljevi se postavljaju na način da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, pojačivač se nanosi na džepove u količini od 5-15 μl. Preporuča se provoditi elektroforezu mješavine markera duljine fragmenata DNA paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNA duljine 100, 200, 300 itd. parova baza.

Korištenjem takvog testa moguće je provjeriti duljinu amplikona u kontrolnim i pokusnim uzorcima. Gel s nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu ispunjenu puferom, komora se spaja na izvor napajanja i provodi se elektroforetska separacija produkata amplifikacije 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/ cm. U tom slučaju prednji dio boje uključene u reakcijsku smjesu mora putovati najmanje 3 cm.

Nakon završetka elektroforeze, gel se prenosi u stakleni transiluminator i promatra pod ultraljubičastim svjetlom. Za dokumentaciju gel se fotografira na filmu Micrat 300 ili snima pomoću video sustava spojenog na računalo.

Prije svega se ocjenjuju kontrolni uzorci. Narančasta svjetleća traka trebala bi biti prisutna u elektroforetskoj stazi koja odgovara pozitivnoj kontroli. Njegova elektroforetska pokretljivost mora odgovarati duljini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli takva traka ne bi trebala biti prisutna. Prisutnost takve vrpce u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju - kontaminaciju reagensa korištenog s testnom DNK ili amplikonom. Ispitni uzorci ocjenjuju se prisutnošću trake u odgovarajućoj stazi, koja se nalazi na istoj razini kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet trake odgovara količini DNA koja se testira u uzorku, što omogućuje polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati ocjenjuju na ljestvici od četiri točke. Ako je sjaj trake u ispitnom uzorku vrlo slab, tada takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Riža. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

Primjene PCR zadijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnom zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje izravne i neizravne metode DNA dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, to se oštećenje može otkriti molekularno-genetičkim metodama. Takve se metode nazivaju izravnim. Izravnim metodama otkrivaju se nepravilnosti u primarnom nukleotidnom slijedu DNA (mutacije i njihove vrste). Izravne metode karakteriziraju točnost koja doseže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu koristiti pod određenim uvjetima:

· s poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za nastanak nasljedne bolesti;

· gen bolesti mora biti kloniran i njegova nukleotidna sekvenca poznata.

Svrha izravne DNA dijagnostike je identificirati mutirane alele.

Dakle, u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, izravno se ispituje fragment DNK koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se metoda izravne DNK dijagnostike.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira izrazita genetska heterogenost, koja ne dopušta punu primjenu izravnih DNA dijagnostičkih metoda. Stoga se u slučajevima kada je lokalizacija oštećenja nepoznata koristi drugi pristup, vezan uz proučavanje blizine gena odgovornog za gensku bolest, u kombinaciji s obiteljskom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularno-genetske dijagnostike koriste se nasljedne bolesti.

Za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija mogu se koristiti različite metode, no sve se oslanjaju na PCR metodu. Ova reakcija vam omogućuje višestruko umnožavanje sekvence nukleotida DNA i zatim traženje mutacija. Metode traženja DNA fragmenata koji nose mutacije temelje se na usporednoj analizi mutantnih i normalnih nukleotidnih sekvenci DNA.

Analiza PCR proizvoda

u procesu izravne DNA dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih značajki amplificirane genske regije. Dakle, u bolestima uzrokovanim ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, produkti amplifikacije razlikuju se po svojoj duljini (što odražava različit broj tripleta u proučavanoj genskoj regiji) i, kao posljedica toga, po brzini kretanja u gelu. Zahvaljujući tome postiže se jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i točna determinacija patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (slika 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Riža. 14. Dijagnoza brisanja GEG u genu DYT 1 u bolesnika s distonijom neovisnom o dopi (elektroforeza u poliakrilamidnom gelu). Staze 2,3,6 – bolesni; staze 1,4,5 – kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, debela strelica označava mutirani kraći alel (delecija tri nukleotida).

Ako je cijela regija DNA koja se proučava dio proširene delecije, tada PCR amplifikacija DNA iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju početnica. U tom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na temelju potpunog odsustva produkta PCR reakcije (sinteza DNA je nemoguća iz obje kopije gena). S heterozigotnom delecijom moguće je detektirati PCR produkt sintetiziran iz normalnog (zadržanog) alela; međutim, za pouzdano dijagnosticiranje takve mutacije potrebno je koristiti složenije metode snimanja DNA koje omogućuju procjenu doze konačnog PCR-a. proizvod.

Za utvrđivanje točkastih mutacija (najčešće nukleotidnih supstitucija) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su mjesto i priroda navodne točkaste mutacije točno poznati, tada restrikcijske endonukleaze (restrikcijskih enzima) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu duljine od četiri do deset nukleotida. Nakon toga se provodi restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci kao dijela dvolančane molekule DNA.Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i reže na fiksnom mjestu strogo definiran, specifičan slijed nukleotida - restrikcijsko mjesto (mjesto prepoznavanja).

U slučajevima kada točkasta mutacija mijenja prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, ovaj enzim neće moći odcijepiti mutirani PCR-amplificirani fragment. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim kojeg inače nema.

U obje situacije, mutirani i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom proizvest će restrikcijske fragmente različitih duljina, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju specifičnu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima, čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Obrada PCR produkata takvim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikcijska analiza uvelike pojednostavljuje detekciju poznatih točkastih mutacija i sada se naširoko koristi za izravnu DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Završna faza molekularno genetička analiza mutacija je odrediti nukleotidnu sekvencu DNA fragmenta koji se proučava (sekvenciranje), koji se uspoređuje s normom i formulira se konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući uspjesima molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Riža. 15. Detekcija točkaste mutacije korištenjem restrikcijske analize: A – pojačana genska regija koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu ja. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluIblokiran; B – elektroferogram restrikcijskih produkata: trag 1 – homozigotnost za normalni alel; trag 2 – homozigotnost za mutaciju; trag 3 – heterozigotno stanje (normalni alel + mutacija).

Dijagnostika nasljednih bolesti, temeljena na izravnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih obitelji ili suspektnih heterozigotnih nositelja patoloških mutacija, prikladna je za presimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojava bilo kakvih kliničkih ili biokemijskih simptoma bolesti.

Bez obzira na metodu otkrivanja mutacije, točne molekularne karakteristike svake mutacije mogu se dobiti samo izravnim sekvenciranjem. Kako bi se automatizirao ovaj proces, posljednjih godina naširoko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućuju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put ka široj primjeni molekularno-bioloških istraživanja u kliničkim dijagnostičkim laboratorijima otvara se ubrzavanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uvjeta za sprječavanje kontaminacije tijekom paralelnog ispitivanja većeg broja analita te objektivnim bilježenjem rezultate u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ova se metoda temelji na istovremenom pojačavanju nekoliko egzona gena koji se proučava u jednoj reakciji. To omogućuje troškovno učinkovit brzi probir najčešćih mutacija. Na primjer, kako bi se brzo dijagnosticirala nosivost delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa najčešće mutiranih egzona ovog gena. Budući da se ove bolesti nasljeđuju recesivno vezano za X i povezane su s oštećenjem jedinog X kromosoma kod dječaka, u slučaju produljene delecije, elektroforeza produkata reakcije otkrit će odsutnost jednog ili više fragmenata DNA (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih odjeljaka za PCR amplificiranje, moguća je prilično točna procjena ukupne duljine delecije i prijelomnih točaka gena (do egzona).

Kombinirana uporaba nekoliko multipleksnih reakcija omogućuje dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju u bolesnika s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. To predstavlja približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na vrlo visoku učinkovitost ove metode probira za DNA dijagnostiku distrofinopatija (slika 16).

Riža. 16. Izravna DNA dijagnostika Duchenneove mišićne distrofije primjenom multipleksne PCR (elektroforeza u agaroznom gelu). U svakoj od ispitivanih osoba istodobno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelicama su označeni odgovarajući produkti amplifikacije). Traka 1 – kontrola, staze 2-5 – pacijenti s Duchenneovom mišićnom distrofijom s različitim delecijama gena za distrofin (linije 2 i 5 – delecija egzona 45, staza 3 – delecija egzona 44, staza 4 – delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se temelji na korištenju dva neovisna para početnica za određenu gensku regiju: jedna početnica u oba para je zajednička, a druga početnica u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementarna je normalnoj ili mutantnoj sekvenci DNA. Kao rezultat takve reakcije, u otopini se mogu sintetizirati dvije vrste PCR proizvoda - normalni i mutant. Štoviše, dizajn upotrijebljenih primera omogućuje jasno razlikovanje normalnih i mutantnih proizvoda pojačanja prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo vizualna i omogućuje vam provjeru homo- i heterozigotnog nosioca mutantnog alela.

Metoda za mjesto usmjerenu modifikaciju amplificirane DNA

Metoda se temelji na korištenju tzv. mismatch primera u PCR-u (koji nije u potpunosti komplementaran s predloškom), koji se razlikuje od slijeda DNA predloška za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedene početnice u mutirani PCR produkt, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućuje izravnu DNA dijagnostiku određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restrikcijskog mjesta potrebno je ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je "prirodno" restrikcijsko mjesto pogođeno pojavom mutacije koja se proučava u molekuli DNA .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova se metoda koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNA kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNA dobivenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijski materijal ili stanične linije limfocita, fibroblasti, itd. Ovdje je važan uvjet ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi provodi se reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajuće molekule cDNA služe kao predložak za PCR. Nakon toga, kritična regija cDNA, umnožena u dovoljnoj količini, podvrgava se sekvencioniranju i drugim metodama probira mutacije, izravnoj elektroforetskoj studiji (otkrivanje delecija, insercija itd.) ili integraciji u sustav ekspresije kako bi se dobio proteinski produkt i njegovu izravnu analizu.

Ova metoda je posebno učinkovita za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze “skraćenog” proteina (besmislene mutacije, splacing mutacije, velike delecije) - takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi u proučavanju dugih multi-egzonskih gena, kao što je Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, ataksija-telangiektazija ili neurofibromatoza tipa 1.

PCR u stvarnom vremenu(PCR u stvarnom vremenu, engleski)

Svake godine PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda u praktičnom zdravstvu. Njegova temeljna značajka je praćenje i kvantitativna analiza nakupljanja produkata lančane reakcije polimeraze te automatska registracija i interpretacija dobivenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva stupanj elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorij. Zahvaljujući uštedi proizvodnog prostora, smanjenju broja osoblja i potražnji za kvantitativnim određivanjem DNA/RNA, ova se metoda posljednjih godina uspješno primjenjuje u najvećim sanitarno-epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u sadašnjem ("klasičnom") formatu.

PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u stvarnom vremenu omogućuje potpunu analizu uzorka unutar 20-60 minuta i teoretski je sposoban otkriti čak i jednu DNA ili RNA molekulu u uzorku.

Riža. 17. PCR u stvarnom vremenu.

PCR u stvarnom vremenu koristi TaqMan sustav koji kontrolira kinetiku PCR-a izravno tijekom pojačanja pomoću rezonantnog gašenja fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i prigušivač komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, opaža se samo manja fluorescentna emisija. Tijekom procesa pojačanja, zbog 5" egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka odlazi u otopinu, oslobođena svoje blizine gasitelju, i stvara fluorescentni signal koji se povećava u stvarnom vremenu proporcionalno nakupljanju pojačala ( Slika 17).

Glavne prednosti PCR-a u stvarnom vremenu u odnosu na PCR s gel elektroforezom:

· Cijela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

· Dovoljne su 1-2 radne sobe;

· Uz kvalitativnu procjenu rezultata postoji mogućnost kvantitativne procjene (npr. kod propisivanja antivirusne terapije za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, tj. količinu virusa po jedinici koja pruža PCR u stvarnom vremenu);

· Rizik od kontaminacije naglo je smanjen.

Zaključak

PCR metoda jedna je od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Ovu metodu kliničari trebaju razumno koristiti, a liječnik koji se odluči koristiti PCR u svom radu mora imati određena znanja o značajkama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna informacija između kliničara i PCR laboratorija, što je neophodno za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije panaceja u dijagnostici (prije svega zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje liječnik koji očekuje uspjeh mora imati.

P . S . Molekularno biološka istraživanja - mijenjanje smjernica za dijagnostiku i liječenje. Primjena molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možda se ne radi samo o pravovremenoj informaciji, već o njezinom primanju unaprijed. Ako se sada laboratorijski testovi u većini slučajeva provode već kada se bolest razvila i kada je počelo liječenje, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti prepoznavanje sklonosti osobe određenim vrstama patologije i stupanj osjetljivosti na određene lijekove. , što će opravdati prediktivnu, preventivnu i personaliziranu prirodu buduće medicine.

PROMJENA DIJAGNOZA I ORIJENTACIJA LIJEČENJA

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetska putovnica

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za rad PCR laboratorija s fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, Real-Time PCR)?

9. Što je detekcija?

10. Koje metode DNA dijagnostike postoje?

11. Rad kojeg enzima je u osnovi PCR-a?

12. Zašto se zona detekcije mora ukloniti iz ostalih radnih područja?

13. Što je restrikcijsko mjesto?

14. Koje su razlike između izravne i neizravne DNA dijagnostičke metode?

15. Što je sekvenciranje?

16. Što je multipleks PCR?

17. Koje se vrste mutacija određuju pomoću PCR-a?

18. Što je kontaminacija?

19. Što je bit metode alel-specifične amplifikacije?

20. Uvjeti čuvanja PCR materijala?

21. U kojem uređaju se događa pojačanje?

22. Što je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Što služi kao materijal za PCR dijagnostiku?

24. Nabrojite vrste kontaminacije?

Testovi za samopripremu

1. Restrikcijski enzimi endonukleaze:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji spajaju lomove u molekuli DNA;

c) enzimi koji osiguravaju spojeve koji obavljaju popravak DNA.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja se metoda molekularne genetike koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznatog niza?

a) korištenje specifičnog restrikcijskog enzima;

b) izravna detekcija korištenjem specifičnih molekularnih sondi;

c) obiteljska analiza distribucije normalnih polimorfizama dužine restrikcijskih fragmenata.

4. Sekvenciranje DNK:

a) identifikacija sekvence baze DNA;

b) višestruko ponavljanje bilo kojeg dijela DNA;

c) izolacija fragmenta DNA koji sadrži gen koji se proučava.

5. Za dobivanje uzoraka DNK možete koristiti :

b) korionske resice;

c) amnionska tekućina;

d) stanice amnionske tekućine;

e) uzorci biopsije kože, mišića, jetre,

e) sve je točno osim točke “c”,

g) sve je točno osim točke “d”,

h) sve navedeno je točno.

6. Za dijagnosticiranje koje se mutacije koristi PCR metoda:

a) genomski;

b) kromosomski;

c) gen (točka).

7. Primer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetski oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) slijed komplementaran mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao "primer" i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na matrici DNA ili RNA.

8. Tko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacije)?

10. U kojim područjima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) određivanje transgenih organizama (GMO)

c) osobna identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

d) sve navedeno,

e) ništa od navedenog..

Primjeri odgovora: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – u; 7 – u; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Glavni

1.Bočkovljeva genetika. Moskva. GEOTAR, 2002. (enciklopedijska natuknica).

Dodatni

1., Bakharev i liječenje kongenitalnih i nasljednih bolesti u djece. – Moskva, 2004.

2. DNA dijagnostika i medicinsko genetsko savjetovanje. – Moskva, 2004.

3. Ginterova genetika. – Moskva, 2003.

4. Gorbunovljeve osnove medicinske genetike. – St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menjšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 3, 2006.

7. Rad Kornienka u PCR laboratoriju tijekom in-line analize biološkog materijala. Kliničko-laboratorijska dijagnostika, broj 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorija. Metodičke upute. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni liječnik Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u stvarnom vremenu. Genome Res. – broj 6, 1996.

OSNOVNI PRINCIPI METODE

LANČANA REAKCIJA POLIMERAZE

Metodički priručnik za izvannastavni rad studenata 3-4 godine studija opće medicine (060101) i pedijatrije (060103).

GOU VPO "Krasnojarska državna medicinska akademija Savezne agencije za zdravstveni i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Principi PCR dijagnostike

SAŽETAK

poglavlja, 34 stranice, 5 slika, 5 literature

Svrha ovog rada je kratki sažetak osnovnih principa i tehnoloških značajki PCR metode, njene znanstvene i praktične primjene u dijagnostici zaraznih bolesti.

POPIS KONVENCIONALNIH KRATICA

HCV - virus hepatitisa C

dATP - deoksiadenozin trifosfat

dGTP - deoksigvanozin trifosfat

dNTP - deoksinukleotid trifosfat

dTTP - deoksitimidin trifosfat

dCTP - deoksicitozin trifosfat

DNA – deoksiribonukleinska kiselina

PCR - lančana reakcija polimeraze

RNA - ribonukleinska kiselina - imunoglobulin klase GTime PCR - PCR metoda u realnom vremenu

UVOD

PRINCIP PCR METODE

FAZE PCR ANALIZE

PCR METODA U REALNOM VREMENU

PREDNOSTI PCR METODE

OGRANIČENJA PCR METODE

PRIMJENA PCR METODE

ZAKLJUČAK

POPIS KORIŠTENE LITERATURE

UVOD

Otkriće metode lančane reakcije polimeraze (PCR) postalo je jedan od najznačajnijih razvoja u području molekularne biologije u posljednjim desetljećima. To je omogućilo podizanje medicinske dijagnostike na kvalitativno novu razinu. Princip metode lančane reakcije polimerazom razvio je Carrie Mullis 1983. godine. Za razvoj PCR analize K. Mullis je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Nakon otkrića PCR vrlo brzo je uveden u praksu. Metoda je postala toliko popularna da je danas teško zamisliti rad u području molekularne biologije bez njezine primjene. PCR metoda dobila je posebno brz razvoj zahvaljujući međunarodnom programu Human Genome. Stvorene su suvremene tehnologije laserskog sekvenciranja (dekodiranje sekvenci nukleotida DNA). Ako je u nedavnoj prošlosti bilo potrebno tjedan dana za dešifriranje DNK sekvence od 250 parova nukleotida (bp), moderni laserski sekvenceri mogu odrediti do 5000 bp. u danu. To zauzvrat pridonosi značajnom rastu baza podataka podataka koje sadrže sekvence DNK. Trenutno su predložene različite modifikacije PCR-a, prikazana je mogućnost stvaranja testnih sustava za otkrivanje mikroorganizama i identificiranje točkastih mutacija, te su opisani deseci mogućih primjena metode.

Pojava PCR metode nastala je zahvaljujući određenim dostignućima u području molekularne genetike, prvenstveno dekodiranju nukleotidnog niza genoma niza mikroorganizama. Valja napomenuti da je ovo otkriće pratio razvoj određenih tehnologija. Konkretno, pojava uređaja koji omogućuju automatsku sintezu jednolančanih fragmenata DNA (oligonukleotida). U istom razdoblju otkriveni su jedinstveni mikroorganizmi koji žive u gejzirima. Njihov enzimski sustav, posebice DNA polimeraza, podnosi visoke temperature toplih izvora i zadržava svoju biološku aktivnost do 95 °C, što je nužan uvjet za izvođenje lančane reakcije polimeraze.

Lančana reakcija polimerazom trenutno je najnaprednija dijagnostička metoda molekularne biologije, molekularne genetike i kliničke laboratorijske dijagnostike, koja omogućuje identifikaciju pojedinačnih stanica uzročnika mnogih zaraznih bolesti u tkivima i biološkim tekućinama tijela.

Metoda PCR temelji se na komplementarnom kompletiranju dijela genomske DNA ili RNA patogena, provedenom in vitro pomoću enzima termostabilne DNA polimeraze. Specifičnost metode određena je jedinstvenošću genetskog materijala detektiranih infektivnih agensa, na koji se odabiru oligonukleotidne početnice uključene u proces amplifikacije.

Dijagnostika zaraznih bolesti, uključujući one uzrokovane uzročnicima koji se teško uzgajaju, genotipizacija mikroorganizama, procjena njihove virulencije, određivanje otpornosti mikroflore na antibiotike, prenatalna dijagnostika, biološki nadzor krvnih produkata - ovo je nepotpuni popis područja medicine pomoću PCR-a. Danas je PCR analiza i dalje najraširenija tehnologija koja se dinamički razvija. Svake godine na tržištu se pojavljuju deseci novih testnih sustava za PCR analizu, dizajniranih kako za identifikaciju nukleotidnih sekvenci različitih mikroorganizama koji uzrokuju bolesti, tako i za proučavanje ljudskih gena. Cijena PCR analize stalno pada, što pridonosi sve široj primjeni metode u medicinskim i dijagnostičkim ustanovama. Broj PCR laboratorija u zemljama ZND-a eksponencijalno raste i, očito, u bliskoj budućnosti PCR analiza će postati jedna od najčešćih laboratorijskih dijagnostičkih metoda.

1. PRINCIP PCR METODE

Lančana reakcija polimerazom je metoda koja oponaša prirodnu replikaciju DNK i omogućuje detekciju jedne specifične molekule DNK u prisutnosti milijuna drugih molekula.

Bit metode je opetovano kopiranje (amplificiranje) određenih dijelova DNK u epruveti tijekom ponovljenih temperaturnih ciklusa. U svakom ciklusu amplifikacije, prethodno sintetizirani fragmenti ponovno se kopiraju pomoću DNA polimeraze. Zbog toga dolazi do višestrukog povećanja broja specifičnih fragmenata DNA, što uvelike pojednostavljuje daljnju analizu.

PCR metoda temelji se na prirodnom procesu - komplementarnom kompletiranju DNA matrice, koji se provodi pomoću enzima DNA polimeraze. Ova reakcija se naziva replikacija DNK.

Prirodna replikacija DNK uključuje nekoliko faza:

) denaturacija DNA (odmotavanje dvostruke spirale, divergencija DNA lanaca);

) Formiranje kratkih dvolančanih odsječaka DNA (primeri potrebni za pokretanje sinteze DNA);

) Sinteza novog lanca DNA (komplementarno dovršavanje oba lanca).

Ovaj se postupak može koristiti za proizvodnju kopija kratkih dijelova DNA koji su specifični za određene mikroorganizme, tj. provoditi ciljanu pretragu takvih specifičnih područja, što je i cilj genske dijagnostike za prepoznavanje uzročnika zaraznih bolesti.

Otkriće termostabilne DNA polimeraze (Taq polimeraze) iz termofilnih bakterija Thermisaquaticus, čiji je optimum u području 70-72°C, omogućio je da se proces replikacije DNA učini cikličkim i da se koristi za rad in vitro. Stvaranje programabilnih termostata (pojačala), koji provode cikličke promjene temperature prema zadanom programu, stvorilo je preduvjete za široko uvođenje PCR metode u praksu laboratorijske kliničke dijagnostike. Višestrukim ponavljanjem ciklusa sinteze dolazi do eksponencijalnog porasta broja kopija određenog fragmenta DNA, što omogućuje dobivanje dovoljnog broja kopija DNA za njihovu identifikaciju iz male količine analiziranog materijala, koji može sadržavati pojedinačne stanice. mikroorganizama.

Komplementarni završetak lanca ne počinje ni na jednom mjestu u slijedu DNA, već samo u određenim početnim blokovima – kratkim dvolančanim dijelovima. Pričvršćivanjem takvih blokova na određene dijelove DNA moguće je usmjeriti proces sinteze novog lanca samo u tom dijelu, a ne duž cijele duljine lanca DNA. Za stvaranje početnih blokova u određenim dijelovima DNA koriste se dva oligonukleotidna početnica (20 parova nukleotida), koja se nazivaju početnice. Primeri su komplementarni DNA sekvencama na lijevoj i desnoj granici specifičnog fragmenta i usmjereni su na takav način da se završetak novog DNA lanca događa samo između njih.

Dakle, PCR je višestruko povećanje broja kopija (amplifikacija) specifične regije DNA katalizirano enzimom DNA polimeraza.

. FAZE PCR ANALIZE

Postupak analize PCR metodom uključuje tri faze:

1. Izolacija DNA (RNA) iz kliničkog uzorka;

2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNA;

. Detekcija produkata amplifikacije.

. Izolacija DNA (RNA).

U ovoj fazi analize klinički uzorak se podvrgava posebnoj obradi, uslijed koje se lizira stanični materijal, odstranjuju frakcije proteina i polisaharida, te se dobiva otopina DNA ili RNA, bez inhibitora i spremna za daljnje pojačanje. Odabir tehnike ekstrakcije DNA (RNA) uglavnom je određen prirodom kliničkog materijala koji se obrađuje.

2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNA

U ovoj fazi nakupljaju se kratki specifični fragmenti DNA u količini potrebnoj za njihovu daljnju detekciju.

Za izvođenje lančane reakcije polimerazom u reakcijskoj smjesi mora biti prisutan niz komponenti:

· Primeri- umjetno sintetizirani oligonukleotidi, obično u rasponu veličine od 15 do 30 bp, identični odgovarajućim dijelovima ciljne DNA. Imaju ključnu ulogu u stvaranju produkata reakcije pojačanja. Ispravno odabrani primeri osiguravaju specifičnost i osjetljivost test sustava.

· Taq polimeraza- termostabilni enzim koji osigurava završetak 3 - kraj drugog lanca DNA prema principu komplementarnosti.

· Mješavina deoksinukleotid trifosfata (dNTP)- deoksiadenozin trifosfat (dATP), deoksigvanozin trifosfat (dGTP), deoksicitozin trifosfat (dCTP) i deoksitimidin trifosfat (dTTP) - "građevni materijal" koji Taq polimeraza koristi za sintezu drugog lanca DNA.

· Međuspremnik -mješavina kationa i aniona u određenoj koncentraciji, koja osigurava optimalne uvjete za reakciju, kao i stabilnu pH vrijednost.

· Analizirani uzorak- pripravak pripremljen za dodavanje u reakcijsku smjesu, koji može sadržavati željenu DNA, na primjer, DNA mikroorganizama, koja služi kao meta za naknadno ponovljeno kopiranje.

Slika 1 Komponente reakcijske smjese

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze koje se odvijaju u različitim temperaturnim uvjetima:

Faza 1:Denaturacija DNA (rasplet dvostruke spirale). Javlja se na 93-95°C 30-40 sekundi.

Jedan od krugova (+) koristi se kao glavna matrica. Njegovih krajeva od pet šipki učvršćuje enzim DNA polimeraza, koji osigurava izgradnju drugog lanca DNA, komplementarnog prvom, od pojedinačnih nukleotida. Ista stvar, samo u obrnutom smjeru, događa se na drugom lancu DNA, međutim, budući da se odmotavanje molekule DNA odvija obrnutim redoslijedom, novi se lanac gradi u male fragmente, koji se zatim međusobno spajaju. Da bi enzim DNA polimeraza započeo s radom, potrebna je prisutnost sjemena ili primera - malog jednolančanog fragmenta DNA, koji, kada se poveže s komplementarnom regijom jednog od matičnih lanaca DNA, tvori početni blok za uzgoj niza kćeri.

Faza 2:Pričvršćivanje primera (žarenje). Pričvršćivanje početnica događa se komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNA na granicama specifične regije. Svaki par primera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Precizno izračunata i eksperimentalno provjerena temperatura žarenja primera jedna je od karakteristika koja određuje specifičnost reakcije, isključujući vezivanje primera za nepotpuno komplementarne sekvence.

Budući da se rast lanaca kćeri DNK može dogoditi istovremeno na oba lanca majčine DNK, DNK polimeraza na drugom lancu također zahtijeva vlastiti početni. Stoga se u reakcijsku smjesu dodaju dva primera. U stvari, početnice, nakon što su pričvršćene na suprotne niti molekule DNA, ograničavaju njezin dio koji će se naknadno višestruko duplicirati ili pojačati. Takvi fragmenti DNA nazivaju se amplikoni. Duljina amplikona može biti nekoliko stotina nukleotida. Promjenom para početnica možemo prijeći s analize jednog patogena na analizu drugog.

Vrijeme žarenja -20-60 sek.

Faza 3:Kompletiranje DNA lanaca (elongacija).

Mehanizam kopiranja je takav da komplementarno dodavanje lanaca ne može započeti ni u jednom trenutku u nizu DNA, već samo u određenim početnim blokovima (kratki dvolančani dijelovi). Za stvaranje početnih blokova u određenim dijelovima DNA koriste se početnice, koje su oligonukleotidi duljine oko 20 bp, koji se nazivaju i početnice. Oni su komplementarni DNA sekvencama na lijevoj i desnoj granici određenog fragmenta i usmjereni su na takav način da se DNA sinteza koju provodi DNA polimeraza odvija samo između njih.

Komplementarno dovršenje DNA lanaca nastavlja se od 5'-kraja do 3'-kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezanja početnica. Materijal za sintezu novih lanaca DNA je uvedeni deoksiribonukleotid fosfat. Ovaj proces katalizira enzim Tag polimeraza. Nova DNA nastala u prvom ciklusu sinteze služi kao početni materijal za drugi ciklus, u kojem nastaje željeni specifični fragment DNA (amplikon) itd.

Slika 2 Princip amplifikacije DNA

Trenutno se koristi nekoliko metoda za pripremu uzorka za PCR. Postupak pripreme uzorka uključuje mikrobnu lizu i ekstrakciju nukleinske kiseline. Kako bi se uništila mikrobna stanica, koristi se jednostavno kuhanje, zamrzavanje-otapanje u prisutnosti lizozima, kao i posebni puferi za lizu koji sadrže deterdžente i proteinazu. Odabir metode obično diktira priroda mikroba, točnije, priroda njegove stanične stijenke. Metoda dobivanja čistog preparata DNA, koju je opisao B.R. Marmionetal, smatra se standardnom i već je postala klasična. (1993). Uključuje enzimatsku proteolizu nakon koje slijedi deproteinizacija i taloženje DNA alkoholom. Ova metoda omogućuje vam dobivanje čistog DNK pripravka, ali je prilično radno intenzivna i uključuje rad s takvim agresivnim i mirisnim tvarima kao što su fenol i kloroform.

Jedna od najpopularnijih je metoda ekstrakcije DNK koju je predložio R.Boometal. (1990), koji se temelji na upotrebi jakog sredstva za lizu - gvanidin tiocijanata (GuSCN) za lizu stanica i naknadnu sorpciju DNA na nosaču (staklene kuglice, dijatomejska zemlja, stakleno "mlijeko" itd.). Nakon ispiranja, DNA ostaje u uzorku, sorbirana na nosaču, s kojeg se lako uklanja puferom za ispiranje. Metoda je praktična, tehnološki napredna i prikladna za pripremu uzorka za amplificiranje. Međutim, moguć je gubitak DNA zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tijekom brojnih ispiranja. Ovo je osobito važno kada se radi s malim količinama DNK u uzorku. Osim toga, čak i tragovi GuSCN-a mogu inhibirati PCR, pa je pri korištenju ove metode vrlo važan točan izbor sorbenta i pažljivo pridržavanje tehnoloških nijansi. Treba napomenuti da je zbog velikog broja koraka dodavanja i uklanjanja otopina potreban oprez pri rukovanju uzorkom jer je moguća unakrsna kontaminacija između uzoraka i nastalog DNK aerosola.

Klasičnim postupkom fenol-kloroformske ekstrakcije DNA postiže se dobro pročišćavanje DNA, prvenstveno od inhibitora Tag polimeraze, ali su neizbježni veliki gubici nukleinske kiseline, posebno vidljivi pri radu s malim uzorcima s niskom koncentracijom uzročnika infekcije.

Druga skupina metoda pripreme uzoraka temelji se na korištenju ionskih izmjenjivača kao što je Chilex (SAD), koji, za razliku od stakla, ne apsorbiraju DNK, već nečistoće koje ometaju reakciju. Ova tehnologija u pravilu uključuje dvije faze: prokuhavanje uzorka i sorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvedbe. U većini slučajeva pogodan je za rad s kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki se mikroorganizmi ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U tim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Tijekom masovnog skrininga, kada je važno dobiti statističke podatke, moguće je koristiti jednostavne metode pomoću deterdženata ili tretiranja biološkog materijala lužinama i njihove neutralizacije. Istodobno, korištenje takvih metoda za kliničku dijagnostiku može dovesti do lažno negativnih rezultata zbog upotrebe nekvalitetnog DNK pripravka u reakcijskoj smjesi. Stoga bi izbor metode pripreme uzorka trebao biti uzet u obzir uz razumijevanje svrhe namjeravane analize.

Tijekom sljedećeg postupka - amplifikacije - u malu epruvetu unosi se uzorak koji sadrži DNA patogena s komponentama koje osiguravaju reakciju polimeraze, dvije vrste početnica, dva enzima (Tag polimeraza i N-uracil glikolaza) i četiri vrste nukleotid A, G, Ts, U. Za izvođenje reakcije polimeraze koristi se poseban uređaj (termalni cikler ili pojačalo DNA), koji vam omogućuje automatsku promjenu temperature reakcijske smjese prema određenom programu. U prvoj rundi PCR-a, uzorak se zagrijava na temperaturu od 94°C kako bi se odvojila dva komplementarna lanca DNA. Temperatura zatim pada na 40-60°C, kada se početnice pričvršćuju na jedan lanac DNA, nakon čega temperatura ponovno raste na 72°C, kada je aktivnost polimeraze najizraženija. Cijeli ciklus s promjenama temperature traje manje od 3 minute.

Za ispravnu procjenu rezultata PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, proizvodi amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNA mogu se detektirati pomoću elektroforeze nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uvjetima bliskim idealnim, što je rijetkost. Posebno velik utjecaj na učinkovitost amplifikacije ima stupanj čistoće preparata DNA, tj. prisutnost u reakcijskoj smjesi određenih inhibitora, kojih se u nekim slučajevima može vrlo teško riješiti. Ponekad se zbog njihove prisutnosti čak i deseci tisuća ciljnih molekula DNA ne mogu umnožiti. Stoga često ne postoji izravan odnos između početne količine ciljne DNA i konačne količine proizvoda amplifikacije.

Za vizualizaciju rezultata pojačanja koriste se različite metode. Danas je najzastupljenija elektroforeza koja se temelji na razdvajanju molekula DNA po veličini. Da biste to učinili, pripremite ploču agaroznog gela, koji je agaroza skrutnuta nakon taljenja u puferu za elektroforezu u koncentraciji od 1,5-2,5% uz dodatak posebne DNA boje, na primjer etidijevog bromida. Stvrdnuta agaroza tvori prostornu rešetku. Prilikom izlijevanja pomoću češljeva, u gelu se formiraju posebne jažice u koje se naknadno dodaju proizvodi za pojačavanje. Ploča s gelom se postavlja u vodoravni aparat za gel elektroforezu i spaja se izvor konstantnog napona. Negativno nabijena DNA počinje se kretati u gelu od minusa prema plusu. U tom se slučaju kraće molekule DNA kreću brže od duljih. Na brzinu kretanja DNA u gelu utječu koncentracija agaroze, jakost električnog polja, temperatura, sastav pufera za elektroforezu i, u manjoj mjeri, sastav DNA. Sve molekule iste veličine kreću se istom brzinom. Boja se planarnim skupinama ugrađuje (interkalira) u molekule DNA. Nakon završene elektroforeze, koja traje od 10 minuta do 1 sata, gel se stavlja na filter transiluminatora koji emitira svjetlost u ultraljubičastom području (254 - 310 nm). Ultraljubičasta energija koju DNA apsorbira na 260 nm prenosi se na boju, uzrokujući njezino fluoresciranje u narančasto-crvenom području vidljivog spektra (590 nm).

Kao "pozitivna kontrola" koristi se DNK standard željenog mikroorganizma. Veličina nespecifičnih amplikona može biti veća ili manja u usporedbi s "pozitivnom kontrolom". U najgorem slučaju, te se veličine mogu podudarati i čitaju se kao pozitivne u elektroforezi.

„Pozitivna kontrola” omogućuje vam da budete sigurni da sve komponente uključene u reakcijsku smjesu osiguravaju normalno odvijanje reakcije. Istodobno, pripravak DNA pripremljen za PCR iz biološkog materijala može sadržavati nečistoće inhibitora, što značajno smanjuje učinkovitost reakcije, au nekim slučajevima dovodi do odsutnosti specifičnih amplikona čak iu prisutnosti željenog patogena. Potrebno je pratiti tijek amplifikacije u svakoj epruveti s reakcijskom smjesom, za što se dodatno koristi tzv. „unutarnja kontrola“, a to je svaki standard DNA koji nije sličan DNA željenog mikroorganizma.

Za infektivne testne sustave ponekad se koristi, na primjer, p-globin gen, na čije se krajeve, korištenjem genetsko-inženjerskih manipulacija, prišivaju DNK dijelovi homologni početnicama uključenim u testni sustav. Ako se u reakcijsku smjesu doda "unutarnja kontrola", ona će postati ista meta za kaljenje primera kao i kromosomska DNK željenog infektivnog agensa. Veličina produkta amplifikacije unutarnje kontrole odabire se tako da je 2 ili više puta veća od amlikona nastalih amplificiranjem DNA željenog mikroorganizma. Kao rezultat toga, ako se DNA "unutarnje kontrole" doda u reakcijsku smjesu zajedno s testnim uzorkom, tada će, bez obzira na prisutnost mikroorganizma u biološkom uzorku, "unutarnja kontrola" uzrokovati stvaranje specifičnih amplikona, ali znatno duži (teži) od umnoška mikroorganizma. Prisutnost teških amplikona u reakcijskoj smjesi ukazuje na normalan napredak reakcije pojačanja i odsutnost inhibitora. Ukoliko se ne formiraju amplikoni potrebne veličine i „unutarnja kontrola“, možemo zaključiti da u analiziranom uzorku postoje nepoželjne nečistoće koje treba eliminirati, ali ne i da nema željene DNA.

Unatoč svoj atraktivnosti ovog pristupa, on ima značajan nedostatak. Dakle, ako je željena DNA prisutna u reakcijskoj smjesi, tada se učinkovitost njezine amplifikacije naglo smanjuje zbog natjecanja s "unutarnjom kontrolom" za početnice. Ovo je od temeljne važnosti pri niskim koncentracijama DNK u ispitnom uzorku i može dovesti do lažno negativnih rezultata. Ipak, pod uvjetom da se riješi problem konkurencije za početnice, ova metoda praćenja učinkovitosti amplifikacije svakako će biti vrlo korisna.

Slika 3. Drugi ciklus amplifikacije DNA

. Detekcija produkata amplifikacije

). Metoda horizontalne elektroforeze

Jedna od metoda vizualizacije rezultata amplifikacije je metoda elektroforeze koja se temelji na razdvajanju molekula DNA po veličini. U većini metoda, u ovoj fazi, smjesa produkata amplifikacije dobivena u 2. fazi se razdvaja horizontalnom elektroforezom u agaroznom gelu. Prije elektroforetskog odvajanja u smjesu za amplificiranje dodaje se otopina etidijevog bromida, koja stvara jake intersticijske spojeve s dvolančanim fragmentima DNA. Ovi spojevi mogu fluorescirati pod UV zračenjem, što se bilježi u obliku svjetlećih traka nakon elektroforetskog odvajanja mješavine za pojačanje u agaroznom gelu. Svjetlina traka proizvoda za pojačanje može varirati. Stoga je u PCR laboratorijima često uobičajeno ocjenjivati ​​rezultat pomoću sustava od tri, četiri ili pet točaka. Međutim, ne može se povezati s početnom količinom ciljne DNK u uzorku. Često je smanjenje svjetline vrpci povezano sa smanjenjem učinkovitosti pojačanja pod utjecajem inhibitora ili drugih čimbenika.

Slika 4. Detekcija produkata amplifikacije horizontalnom elektroforezom

). Metoda vertikalne elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze u osnovi je slična horizontalnoj elektroforezi. Njihova razlika je u tome što se u ovom slučaju umjesto agaroze koristi poliakrilamid. Provodi se u posebnoj komori za vertikalnu elektroforezu. Elektroforeza u poliakrilamidnom gelu ima veću rezoluciju u usporedbi s elektroforezom na agarozi i omogućuje razlikovanje molekula DNA različitih veličina s točnošću do jednog nukleotida. Priprema poliakrilamidnog gela je nešto kompliciranija od agaroznog gela. Osim toga, akrilamid je otrovna tvar. Budući da se rijetko javlja potreba za određivanjem veličine proizvoda amplifikacije s točnošću od 1 nukleotida, ova se metoda ne koristi u rutinskom radu.

3). Metoda hibridizacijske sonde

Kao alternativa elektroforetskoj metodi detekcije, koja ima neke nedostatke: subjektivnost u očitavanju rezultata, ograničenja u određivanju DNA različitih mikroorganizama u jednoj reakciji, mogu se predložiti hibridizacijske sheme detekcije. U tim shemama, fragment DNA nastao kao rezultat amplifikacije hibridizira (tvori dvolančane komplekse - "hibride") sa specifičnom oligonukleotidnom sondom. Registriranje takvih kompleksa može se provesti kolorimetrijski ili fluorimetrijski.

3. PCR METODA U STVARNOM VREMENU (PCR u stvarnom vremenu)

Real-Time PCR metoda omogućuje otkrivanje proizvoda amplifikacije tijekom reakcije i praćenje kinetike nakupljanja amplikona. Za detekciju PCR produkta koriste se fluorescentne boje koje daju fluorescenciju izravno proporcionalnu količini PCR produkta – reporter fluorescenciju. Mehanizmi za njegovo stvaranje razlikuju se ovisno o specifičnoj vrsti PCR-a u stvarnom vremenu.

Kinetička krivulja u koordinatama “Razina reporterske fluorescencije - ciklus pojačanja” ima S-oblik.

Može se podijeliti u tri faze:

1.Inicijacijski stadij (kada PCR proizvodi još nisu detektirani fluorescentnom oznakom).

2.Eksponencijalni stadij (u kojem postoji eksponencijalna ovisnost količine fluorescencije o PCR ciklusu).

.Plato (faza zasićenja).

Slika 5 Grafikon kinetičke krivulje fluorescencije korištenjem PCR-a u stvarnom vremenu

Registracija fluorescentnog signala provodi se tijekom procesa amplifikacije na posebnom uređaju - termalnom cikleru za Real-Time PCR. Na temelju povećanja intenziteta fluorescentnog signala, pomoću softvera isporučenog s pojačivačem izračunava se koncentracija inicijalnog uzorka DNA.

Prednosti PCR metode u realnom vremenu

n sposobnost otkrivanja nakupljanja produkata amplifikacije izravno tijekom amplifikacije;

n temeljna prednost je mogućnost otkrivanja nakupljanja amplikona bez otvaranja epruvete, što smanjuje rizik od lažno pozitivnih rezultata zbog kontaminacije uzoraka i reagensa produktima za pojačavanje;

n značajno smanjenje broja manipulacija ispitnim uzorkom smanjuje vrijeme, pojednostavljuje analizu i smanjuje vjerojatnost pogrešaka;

n Ovaj pristup omogućuje uklanjanje faze elektroforeze, što dovodi do oštrog smanjenja vjerojatnosti kontaminacije ispitnih uzoraka produktima pojačanja;

n smanjenje zahtjeva za PCR laboratorije;

n povećanje objektivnosti tumačenja rezultata PCR studije, budući da se obrada provodi pomoću softvera uređaja;

n Ukupno vrijeme istraživanja značajno je, gotovo prepolovljeno, što omogućuje dobivanje rezultata unutar 1,5 - 2 sata nakon što klinički materijal stigne u laboratorij;

n Ova metoda po prvi put omogućuje kvantificiranje sadržaja DNA mikroorganizma u kliničkom uzorku;

n uporaba hibridizacijskih sondi zajedno s primerima povećava specifičnost analize;

n mogućnost neovisne istodobne registracije fluorescentnog signala iz nekoliko hibridizacijskih DNA sondi omogućuje identifikaciju u jednoj studiji nekoliko različitih regija istih ili različitih DNA ciljeva.

. PREDNOSTI PCR METODE

n Izravna identifikacija uzročnika zaraznih bolesti

PCR metoda daje izravnu indikaciju prisutnosti specifičnog fragmenta DNA patogena u materijalu uzetom od pacijenta.

n Visoka specifičnost PCR-a

Koristeći PCR metodu, u materijalu koji se proučava izdvaja se fragment DNA koji je jedinstven za određeni patogen - bakteriju ili virus. Ovaj dio DNK je jedinstven i nije tipičan ni za jednu infekciju na zemlji. Specifičnost je određena nukleotidnim slijedom početnica, što eliminira mogućnost dobivanja lažnih rezultata, za razliku od imunoenzimske metode, gdje su česte pogreške zbog križno reagirajućih antigena.

n PCR visoke osjetljivosti

PCR metoda omogućuje otkrivanje čak i pojedinačnih stanica bakterija ili virusa. PCR dijagnostikom se otkriva prisutnost uzročnika zaraznih bolesti u slučajevima kada se to ne može učiniti drugim metodama (imunološkim, bakteriološkim, mikroskopskim). Osjetljivost PCR analize je 10-1000 stanica po uzorku (osjetljivost imunoloških i mikroskopskih pretraga je 103-105 stanica).

n Svestranost PCR-a

Budući da se patogen može nalaziti u bilo kojim biološkim izlučevinama i tkivima, PCR istraživanje može koristiti gotovo sve materijale, uključujući one nedostupne za istraživanje drugim metodama - sluz, urin, krv, serum, sputum, ejakulat, strugotine epitelnih stanica.

n Velika brzina dobivanja rezultata PCR analize

PCR analiza ne zahtijeva izolaciju i uzgoj kulture patogena, što oduzima puno vremena. Jedinstvena metoda obrade biomaterijala i detekcije produkata reakcije, te automatizacija procesa amplifikacije omogućuju provođenje kompletne analize za 4-4,5 sata.

n Sposobnost dijagnosticiranja bilo koje vrste infekcije

Visoka osjetljivost PCR metode omogućuje dijagnosticiranje infekcije ne samo u akutnom stadiju bolesti, već i kroničnih infekcija, pa čak i prisutnost pojedinačnih bakterija ili virusa.

Trenutačna prednost PCR analize u odnosu na metodu kulture za otkrivanje mikroorganizama je sljedeća:

Veća učestalost detekcije mikroba, koja premašuje isti pokazatelj pri korištenju metode kulture za 6-7%. Te se razlike objašnjavaju mogućom smrću mikroba tijekom skladištenja i transporta, dok je PCR sposoban otkriti neviabilne oblike mikroorganizama.

Vrijeme potrebno za otkrivanje patogena metodom kulture je oko 4 dana, dok korištenje PCR-a omogućuje detekciju mikroba za 4-5 sati.

Korištenje PCR tehnologije omogućuje detekciju patogena, poput klamidije, u uzorcima uzetim neinvazivno, poput urina.

PCR metoda posebno je učinkovita za dijagnosticiranje teško uzgojivih, nekulturnih i perzistentnih oblika mikroorganizama, koji se često susreću u latentnim i kroničnim infekcijama, budući da se ovom metodom izbjegavaju poteškoće vezane uz uzgoj takvih mikroorganizama u laboratorijskim uvjetima.

n Mogućnost izvođenja praćenje i procjena učinkovitosti terapije, posebice kod virusnih bolesti.

n Mogućnost detekcije pojedine podvrste i sojevi virusa i bakterija.

n Mogućnost definiranja nekoliko vrsta uzročnika (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) iz jedne epruvete s biološkim materijalom.

Ova je metoda po intenzitetu rada usporediva s klasičnim metodama (imunoenzimski test, imunofluorescencija itd.), ali pruža pouzdanije dijagnostičke podatke, omogućujući izravno otkrivanje DNA ili RNA infektivnog agensa u kliničkom materijalu. Stoga je PCR metoda, uz metodu kulture, prepoznata kao “zlatni standard” za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.

5. OGRANIČENJA PCR METODE

· Tijekom reakcije umnožava se DNK i živih i mrtvih mikroorganizama

· Mogućnost križne reakcije

Odabir početnica temelji se na postojećim spoznajama o genomu danog i sličnih mikroorganizama. Teoretski, postoji mogućnost da se isti fragment nalazi i u drugim mikroorganizmima čiji genom trenutno nije dešifriran i kod kojih nije ispitana mogućnost križne reakcije. Prisutnost takvih mikroorganizama u uzorku može dovesti do lažno pozitivnog rezultata testa.

· Varijabilnost mikroorganizama

Iako se prilikom konstruiranja testnog sustava fragment genoma koji se koristi za amplificiranje odabire iz visoko očuvane regije, varijabilnost mikroorganizama može dovesti do činjenice da neki genotipovi ili sojevi patogena koji se proučava mogu dobiti mutacije u amplificiranoj regiji genoma , i tako postaju nedostižni za ovaj testni sustav.

Posljednje dvije točke važne su za programere PCR dijagnostičkih setova. Sada su razvijeni standardi koji reguliraju količinu testiranja (uključujući testiranje na unakrsne reakcije, kao i testiranje poznatih sojeva patogena koji se otkriva) kojima testni sustav mora proći prije nego što se stavi na tržište.

6. PRIMJENA PCR METODE

dijagnostika polimerazom zarazne bolesti

PCR se koristi u mnogim područjima za analizu i znanstvene eksperimente:

1. forenzika

PCR se koristi za usporedbu takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Potreban je uzorak genetskog materijala s mjesta zločina - krvi, sline, sjemena, kose itd. To se uspoređuje s genetskim materijalom osumnjičenika. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski jedna kopija. DNK se rastavlja na fragmente i zatim umnožava pomoću PCR-a. Fragmenti se odvajaju DNA elektroforezom. Rezultirajući obrazac rasporeda DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

2. utvrđivanje očinstva

Analizom rezultata elektroforeze fragmenata DNA amplificiranih PCR-om otac-dijete-majka, otkriva se da će dijete naslijediti neke značajke genetskog otiska oba roditelja, što daje jedinstveni otisak. Iako su genetski otisci prstiju jedinstveni (osim u slučaju jednojajčanih blizanaca), obiteljski odnosi ipak se mogu uspostaviti uzimanjem nekoliko otisaka prstiju. Ista se metoda može primijeniti, malo modificirana, za utvrđivanje evolucijske povezanosti među organizmima.

3. medicinska dijagnostika

PCR omogućuje znatno ubrzanje i olakšavanje dijagnostike nasljednih i virusnih bolesti. Gen od interesa umnožava se PCR-om pomoću odgovarajućih početnica, a zatim se sekvencira kako bi se identificirale mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, tjednima ili mjesecima prije pojave simptoma.

4. kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskog inženjeringa, dobivanje velike količine produkta određenog gena. PCR se koristi za umnožavanje gena, koji se zatim umeće u vektor - dio DNK koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Na primjer, plazmidi ili virusna DNA koriste se kao vektori. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za proizvodnju produkta tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na taj način se dobivaju mnoge bjelančevine u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

5. Sekvenciranje DNA

U metodi sekvenciranja dideoksinukleotida obilježenih fluorescentnim ili radioaktivnim izotopom, PCR je sastavni dio, jer se upravo tijekom polimerizacije derivati ​​nukleotida obilježeni fluorescentnim ili radioaktivnim biljegom ugrađuju u lanac DNA. Ovo zaustavlja reakciju, omogućujući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon što se sintetizirani lanci odvoje u gelu.

6. mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda za provođenje mutageneze (izmjena nukleotidnog slijeda DNA). Korištenje PCR-a omogućilo je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, te ga učinilo pouzdanijim i ponovljivijim.

7. dijagnostika zaraznih bolesti

Primjena PCR metode za dijagnosticiranje zaraznih bolesti bakterijske i virusne prirode od ogromnog je značaja za rješavanje mnogih problema mikrobiologije i epidemiologije. Korištenje ove metode također doprinosi razvoju temeljnih istraživanja u području proučavanja kroničnih i nedovoljno poznatih zaraznih bolesti.

8. dijagnostika virusnih bolesti

Najopsežnija korist PCR-a u dijagnosticiranju virusnih bolesti može se pokazati razmatranjem infektivnog procesa uzrokovanog virusom hepatitisa C (HCV). PCR je od posebne dijagnostičke vrijednosti za otkrivanje ovog virusa iz sljedećih razloga:

) nedostatak metode za uzgoj HCV-a; 2) ne postoje setovi za dijagnostiku antigena; 3) reakcija stvaranja protutijela na HCV toliko je spora da se dijagnoza tijekom akutne faze infekcije u pravilu ne može postaviti.

Stoga je danas općeprihvaćena uporaba PCR tehnologije za dijagnostiku, kontrolu kvalitete liječenja i epidemiološku analizu morbiditeta uzrokovanog HCV-om.

Istodobno, samo PCR tehnologija omogućuje rješavanje sljedećih problema: 1) dijagnosticiranje akutne infekcije s kasnim otkrivanjem protutijela na HCV; 2) provesti etiološku dijagnostiku kroničnog hepatitisa C kod imunosuprimiranih bolesnika; 3) procijeniti učinkovitost antivirusne terapije; 4) otkriti viremiju u davatelja krvi s normalnom razinom aminotransferaza; 5) utvrditi moguću kontaminaciju krvnih pripravaka; 6) procijeniti prevalenciju HCV-a.

9. primjena PCR-a u pulmologiji i ftiziologiji

Čest uzročnik atipične upale pluća i rekurentnog kroničnog bronhitisa su mikoplazme i klamidija. Dijagnostika ovih patogena tradicionalnim metodama mikroskopije i bakterijske kulture je neučinkovita. PCR omogućuje ne samo dijagnosticiranje klamidije i mikoplazmoze, već i identifikaciju vrste patogena (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Primjena PCR metode može značajno poboljšati ranu dijagnostiku tuberkuloze. Trenutno su razvijeni i na tržištu se pojavili PCR setovi za određivanje otpornosti mikobakterija na antibiotike.

10. Primjena PCR-a u krvotvornoj praksi

Ispitivanje krvi davatelja na hepatitis, sifilis, HIV serološkim metodama ne isključuje opasnost od korištenja zaražene krvi zbog prisutnosti određenog seronegativnog razdoblja za ove bolesti, koje može trajati i do nekoliko tjedana od trenutka pojave uzročnika u tijelu. krv. Najučinkovitija metoda ispitivanja krvi za prisutnost ovih patogena je PCR metoda.

11. primjena PCR-a u neonatologiji

Brojni mikroorganizmi mogu zaraziti fetus tijekom trudnoće. To su citomegalovirus, toksoplazma, herpes virus, virus rubeole, mikoplazma, klamidija i dr. Korištenje seroloških testova za određivanje ovih infekcija u novorođenčadi je neučinkovito, budući da se formiranje imunološkog sustava djeteta odvija tijekom nekoliko mjeseci, a prisutnost infektivni agens ne mora biti popraćen proizvodnjom specifičnih protutijela. S druge strane, majčina antitijela klase IgG mogu biti prisutna u krvi novorođenčeta dugo vremena, sposobna prodrijeti kroz placentarnu barijeru. Dakle, prisutnost specifičnog IgG u djeteta u prvim mjesecima života ne ukazuje na prisutnost patogena. Korištenje PCR analize značajno povećava mogućnosti dijagnosticiranja neonatalnih infekcija, uključujući i intrauterinu fazu.

12. primjena PCR-a u uroginekološkoj praksi

Među infektivnim agensima koji zahvaćaju urogenitalni trakt, u posljednje vrijeme velika se pozornost posvećuje uzročnicima latentnih i kroničnih infekcija - klamidiji i mikoplazmi. Bolesti uzrokovane ovim patogenima karakteriziraju zamućeni klinički simptomi i kronični tijek, što često dovodi do oštećenja reproduktivnih funkcija - pobačaja, neplodnosti. Brojne studije o upotrebi PCR metode za detekciju Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, provedene u velikim klinikama u različitim zemljama, pokazale su visoku učinkovitost ove metode. Priznato je da je u smislu osjetljivosti i učinkovitosti PCR superiorniji od metode kulture, prihvaćene kao "zlatni standard".

ZAKLJUČAK

Stoga je PCR tehnologija moćan alat koji pruža mogućnost proučavanja i dijagnosticiranja kroničnih infektivnih procesa i ekologije uzročnika zaraznih bolesti. PCR dijagnostička metoda nadopunjuje postojeće metode mikrobiološke dijagnostike i kvalitativno mijenja metodologiju rješavanja primijenjenih problema medicinske mikrobiologije i epidemiologije.

Uzimajući u obzir navedeno, formulirat ćemo područja istraživanja infektivne patologije, u kojima PCR počinje igrati vodeću ulogu.

Dijagnoza kroničnih zaraznih stanja uzrokovanih postojanošću bakterija ili virusa. Ovo je najočitija primjena PCR-a u dijagnostičke svrhe.

PCR je najučinkovitija metoda za identifikaciju i proučavanje patogena koji, budući da su u "nekultiviranom" stanju, mogu tamo ustrajati, preživljavajući nepovoljne vanjske uvjete.

PCR omogućuje određivanje otpornosti na antibiotike kod spororastućih bakterija koje se teško uzgajaju.

Obećavajuća područja za praktičnu primjenu PCR dijagnostike su:

· dijagnostika onkoloških bolesti;

· dijagnostika leukemija i limfoma;

· dijagnoza raka dojke;

· dijagnostika drugih malignih bolesti;

DNK dijagnostika benignih i zloćudnih novotvorina ograničena je malom, ali rastućom količinom informacija o genima povezanim s tim bolestima;

· dijagnostika genetskih bolesti.

Dijagnoza genetskih bolesti može se razviti tek nakon opsežnih znanstvenih istraživanja ljudskog genoma. Međutim, medicinska zajednica već je prepoznala važnost proučavanja genetske osnove bolesti, kao i mogućnost dijagnosticiranja i liječenja bolesti prije nego što se pojave simptomi;

· osobna identifikacija: sudska medicina, kriminalistika; transplantacija organa i tkiva; utvrđivanje očinstva. Stručnjaci ocjenjuju ovo područje tržišta DNK dijagnostike kao jedno od najvećih i najbrže rastućih;

Često se koristi kao brza metoda za indikaciju i identifikaciju virusa.

Ovu metodu prvi je razvio K. Mullis (SAD) 1983. godine. Zbog svoje visoke osjetljivosti, specifičnosti i jednostavnosti primjene, široko se koristi u genetici, sudskoj medicini, dijagnostici i drugim područjima.

Bit metode je amplifikacija, tj. povećanje broja kopija strogo definiranih fragmenata molekule DNA in vitro. Ova metoda koristi matrični mehanizam i princip komplementarnosti. Dva jednostruka polinukleotidna lanca (nukleinske kiseline) mogu se povezati vodikovim vezama u jedan dvolančani lanac ako se nukleotidne sekvence jednog točno podudaraju s nukleotidnim slijedom drugog tako da njihove dušične baze mogu tvoriti adenin-timin i gvanin-citozin parovi.

PCR se temelji na amplifikaciji DNA pomoću termostabilne DNA polimeraze, koja sintetizira međusobno komplementarne DNA lance, počevši od dva početnica. Primer je DNA fragment koji se sastoji od 20-30 nukleotida. Ovi primeri su komplementarni suprotnim lancima DNK. Tijekom sinteze DNA, početnice se umeću u lanac novosintetiziranih molekula DNA.

Obično se PCR provodi u 25-40 ciklusa. Svaki ciklus uključuje tri faze: prva je denaturacija na 92-95 °C. U ovom slučaju, dva lanca DNK se razilaze; drugi je žarenje ili dodavanje primera na 50-65 ° C; treća je elongacija ili polimerizacija na 68-72 °C, dok DNA polimeraza provodi komplementarno dovršavanje lanaca DNA šablona pomoću četiri vrste nukleotida. Kao rezultat jednog ciklusa, željeni genetski materijal se udvostručuje. Lanci DNA nastali u prvom ciklusu služe kao predlošci za drugi ciklus itd. Nakon prvog ciklusa samo se fragment između dva prajmera umnožava. Time se broj kopija amplificirane regije udvostručuje, što omogućuje sintetiziranje milijuna (2 n) fragmenata DNA u 25-40 ciklusa - količina dovoljna za njihovu indikaciju različitim metodama (metodom hibridizacijskih sondi koje sadrže određenu etiketa, elektroforeza, itd.) . Češće se u tu svrhu koristi elektroforeza u agaroznom gelu s bojanjem etidijevim bromidom.

U PCR-u iz sekcija DNA patogena koriste se početnice koje imaju jedinstvenu sekvencu nukleotida karakterističnu samo za određeni patogen.

Postupak izvođenja PCR-a svodi se na sljedeće: DNA matrica se izolira iz materijala koji se proučava; u epruveti se izolirana DNA kombinira sa smjesom za umnožavanje, koja uključuje DNA polimerazu, sve 4 vrste nukleotida, 2 vrste početnica, MgCl, pufer, deioniziranu vodu i mineralno ulje. Zatim se epruvete stavljaju u cikler, a amplifikacija se provodi automatski prema zadanom programu koji odgovara vrsti patogena. Rezultati se češće bilježe elektroforezom u 1-2% agaroznom gelu u prisutnosti etidijevog bromida, koji se spaja s fragmentima DNA i otkriva u obliku svjetlećih traka kada se gel ozrači UV zrakama na transiluminatoru. Svi PCR postupci traju 1-2 radna dana.

Kako bi se povećala specifičnost i osjetljivost PCR-a, koriste se različite opcije: ugniježđeni PCR; PCR s "vrućim startom" pomoću parafinskog sloja ili blokiranjem aktivnih centara polimeraze s monoklonskim protutijelima. Osim toga, neke tvrtke proizvode komplete liofiliziranih reagensa za umnožavanje DNA, koji ubrzavaju PCR proces i smanjuju mogućnost lažno pozitivnih rezultata.

Trenutno se uvodi nova tehnologija, Real-Time PCR. Njegova temeljna značajka je praćenje i kvantitativna analiza nakupljanja produkata lančane reakcije polimeraze te automatska registracija i interpretacija dobivenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva korak elektroforeze, što smanjuje laboratorijske zahtjeve za PCR. PCR u stvarnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u stvarnom vremenu omogućuje potpunu analizu uzorka unutar 20-60 minuta i teoretski je način otkrivanja čak i jedne DNA ili RNA molekule u uzorku.

Sustav za detekciju proizvoda u lančanoj reakciji polimeraze u stvarnom vremenu (PCR praćenje) omogućuje vam praćenje nakupljanja umnožene DNK ciklus po ciklus. Sustav također uključuje oligonukleotidnu sondu koja se može vezati (hibridizirati) na unutarnji segment ciljne DNA. Sonda je označena na 5' kraju fluorescentnom reporterskom bojom, a na 3' kraju blokatorskom bojom (gasiteljska boja). Kako se PCR produkt nakuplja, sonda se hibridizira s njim, ali ne dolazi do luminiscencije zbog blizine između reportera i blokatora. Kao rezultat kopiranja sekvence, polimeraza doseže 5' kraj sonde. Aktivnost 5'-3' egzonukleaze polimeraze odvaja fluorescentnu oznaku s 3' kraja sonde, oslobađajući tako fluorescentni reporter od njegove veze s blokatorom signala, što dovodi do povećanja fluorescencije. Razina fluorescencije je stoga proporcionalna količini specifičnog produkta reakcije. Važno je da se rezultati PCR-a bilježe prisutnošću fluorescencije u zatvorenim epruvetama i time je riješen još jedan od glavnih problema ove metode - problem kontaminacije amplikonima.

Prednosti PCR-a: brzina analize; visoka osjetljivost i specifičnost; minimalna količina ispitnog materijala; jednostavnost izvedbe i mogućnost potpune automatizacije.

S obzirom na to da osjetljivost PCR-a može doseći i detekciju jedne kopije DNK uzorka, postoji visok stupanj opasnosti od dobivanja lažno pozitivnih rezultata. Stoga genetski dijagnostički laboratorij mora pri provođenju PCR testiranja strogo poštovati posebne zahtjeve za raspored i način rada.

PCR je jedna od komplementarnih metoda koje postoje u virološkoj dijagnostici. Ova je reakcija vrlo važna za dijagnozu virusnih infekcija kada se virusni antigeni ili virus-specifična protutijela ne mogu detektirati i kada prisutnost virusne nukleinske kiseline može biti jedini dokaz infekcije, osobito kod latentnih i miješanih infekcija.

Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.

Lančana reakcija polimerazom poznata je već 30 godina. Široko se koristi u mnogim područjima, od arheologije do genetike.

Metoda PCR pomaže u utvrđivanju očinstva, ali najčešće se koristi za identifikaciju različitih zaraznih bolesti u ljudskom tijelu.

Kako se radi PCR analiza i što je to? Pokušat ćemo detaljno odgovoriti na ova pitanja.

PCR analiza - što je to?

Lančana reakcija polimerazom (PCR) je visokoprecizna molekularna genetička dijagnostička metoda koja vam omogućuje prepoznavanje različitih zaraznih i nasljednih bolesti kod ljudi, kako u akutnom tako iu kroničnom stadiju, i mnogo prije nego što se bolest može manifestirati.

PCR metoda je apsolutno specifična i, ako se pravilno izvodi, ne može dati lažno pozitivan rezultat. Odnosno, ako nema infekcije, onda analiza nikada neće pokazati da ona postoji. Stoga, sada vrlo često, za potvrdu dijagnoze, dodatno uzimaju PCR test za određivanje patogena i njegove prirode.

Lančanu reakciju polimerazom (PCR) razvio je Kary Mullis (SAD) 1983. godine, za što je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za kemiju.

Koja je prednost ove metode?

Dijagnostika ovom metodom omogućuje vam pronalaženje patogena izravno u genu koji se nalazi u materijalima koji se proučavaju. Ovo je najprecizniji test za spolno prenosive infekcije, skrivene infekcije i razne spolno prenosive bolesti.

Razlike između PCR dijagnostike i drugih laboratorijskih istraživačkih metoda su kako slijedi:

• metoda je usmjerena na identifikaciju samog patogena;
• Dijagnostika pomoću PCR metode razlikuje se po svojoj svestranosti: za otkrivanje nekoliko patogena;
• bolesti dovoljan je samo jedan biološki uzorak bolesnika;
• metoda je vrlo osjetljiva i nije popraćena drugim križnim reakcijama.

Osim toga, prednost PCR dijagnostike je što je bilo koji biološki materijal pacijenta prikladan za analizu: krv, genitalni sekret, urin, sperma.

Koje infekcije može otkriti PCR bris?

U tijelu može biti prisutan veliki broj zaraznih agenasa, uključujući "skrivene" koji se dugo ne manifestiraju.

PCR analiza razmaza omogućuje vam otkrivanje takvih infekcija:

• ureplasmosis genitalnih organa;
• kandidijaza();
• herpes;
• prisutnost stanica raka;
• procijeniti hormonski status;

Testni materijal za PCR obično je ispljuvak, slina, urin i krv. Prije provođenja analize morate se pažljivo pripremiti za nju prvo se posavjetujte s liječnikom.

Krv za PCR obično se daje na prazan želudac. Dobri rezultati pokazuju analizu kada se materijal za istraživanje uzima iz cervikalnog kanala ili uretre. U ovom slučaju, najbolje je provesti PCR dijagnostiku najkasnije jedan dan nakon spolnog odnosa.

Vrste PCR-a

PCR se koristi u mnogim područjima za testiranje i znanstvene eksperimente. Postoje različite metode analize:

1. Reverzna transkripcija PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - koristi se za umnožavanje, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNA biblioteke.
2. Invertirani PCR(Inverzna PCR) - koristi se kada je poznata samo mala regija unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada se radi o određivanju susjednih sekvenci nakon što je DNK umetnuta u genom.
3. Ugniježđeni PCR koristi se za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Koriste se dva para primera i provode se dvije sekvencijalne reakcije.
4. Asimetrični PCR(eng. Asymmetric PCR) - provodi se kada je potrebno umnožiti pretežno jedan od lanaca izvorne DNA. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije.
5. Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR u stvarnom vremenu - koristi se za izravno praćenje mjerenja količine specifičnog PCR produkta u svakom reakcijskom ciklusu.
6. Step-by-step PCR (Touchdown PCR) - korištenjem ovog pristupa smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezanja početnica.
7. Grupno specifična PCR(eng. group-specific PCR) - PCR za srodne sekvence unutar iste ili između različitih vrsta, koristeći konzervativne početnice za te sekvence.

Ako je nukleotidni slijed predloška djelomično poznat ili uopće nepoznat, mogu se koristiti degenerirani primeri, čiji slijed sadrži degenerirane položaje u kojima se može nalaziti bilo koja baza. Na primjer, niz primera može biti: ...ATH..., gdje je H A, T ili C.

Koji biološki materijali se proučavaju?

Razni biološki mediji i ljudske tekućine mogu poslužiti kao materijal za PCR istraživanje, u kojem se može otkriti strana bakterijska DNA ili virusna DNA ili RNA:

1. Urin. Može se koristiti za infekcije genitourinarnog trakta kod muškaraca i mokraćnih organa kod žena (kod muškaraca korištenje urina kao materijala zamjenjuje struganje epitela).
2. Sputum. Koristi se za dijagnostiku tuberkuloze, a rjeđe za dijagnozu respiratornih oblika klamidije i mikoplazmoze. Sputum u količini od 15-20 ml skuplja se u sterilnu (jednokratnu) bočicu.
3. Biološke tekućine. Sok prostate, pleuralna, spinalna, amnionska tekućina, zglobna tekućina, bronhoalveolarni lavaž, slina prikupljaju se prema indikacijama.
4. Strugotine epitela sa sluznice. Obično se koristi za dijagnosticiranje spolno prenosivih bolesti (STD), kao što su gonoreja, klamidija, mikoplazmoza, ureaplazmoza, trihomonijaza, gardnereloza, herpes i druge infekcije koje zahvaćaju sluznicu.
5. Biopsije. Najčešće se za otkrivanje infekcije Helicobacter pylori koriste biopsije želuca i dvanaesnika.
6. Krv, plazma, serum. Koristi se za PCR analizu hepatitisa B, C, D, G, herpesa, CMV, HIV virusa, te istraživanje ljudskih gena.

Kako se pripremiti za test?

Pouzdanost rezultata PCR izravno ovisi o ispravnom podnošenju materijala za ispitivanje. Materijal ne smije biti kontaminiran, inače rezultat studije neće biti objektivan. Najvažnije preporuke prije poduzimanja PCR testa uključuju sljedeće zahtjeve:

1. Urin se skuplja ujutro u sterilnu posudu.
2. Krvni test za infekcije mora se uzeti ujutro na prazan želudac.
3. Ne biste trebali biti spolno aktivni dan prije testa.

Rezultat analize bit će spreman 1,5-2 dana nakon dotičnog postupka. Postoje situacije kada se rezultat može pripremiti isti dan.

Dekodiranje OPC analize

Proces interpretacije prikazanog istraživanja odlikuje se jednostavnošću. Rezultati PCR analize mogu se dobiti 1,5-2 dana nakon predaje materijala. U nekim slučajevima nalaz je spreman već prvi dan, a evo što oni mogu značiti:

• Negativan rezultat pokazuje da dijagnostički materijal ne sadrži željeni uzročnik.
• PCR pozitivan znači da je DNA ili RNA patogena prisutna u ljudskom tijelu.

U nekim slučajevima mikroorganizmi se kvantificiraju. To se posebno odnosi na bolesti uzrokovane oportunističkim mikroorganizmima. Budući da te bakterije svoje negativne učinke ispoljavaju samo u prevelikim količinama.

Također, kvantitativna PCR analiza važna je za odabir terapijske taktike te u svrhu praćenja liječenja virusnih infekcija kao što su HIV i virusi hepatitisa.

Koliko je točna PCR dijagnoza infekcija?

PCR metodu karakterizira visoka točnost, specifičnost i osjetljivost. To znači da ova analiza može:

• točno odrediti prisutnost ili odsutnost infekcije;
• točno navesti o kakvoj se infekciji radi (specifičnost);
• otkriti infekciju čak i s vrlo niskim sadržajem mikrobne DNA u biološkom materijalu,
• koji je ispitan (osjetljivost).

PCR analiza: cijena i uvjeti

Cijena pojedinog testa ovisi o tome na koju infekciju ćete se testirati. Okvirne cijene i termini:

1. STI: 300-500 rubalja, termini – 1 dan;
2. Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, herpes, citomegalovirus: 300-500 rubalja, termini - 1 dan;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: kvalitativna analiza 650 rubalja, kvantitativna analiza 2000 rubalja. Uvjeti – do 5 dana;
4. Antitijela na virus hepatitisa C, ukupna (Anti-HCV) – 420 rubalja;
5. Antitijela na virus hepatitisa C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 rubalja;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubalja, termini - 1 dan;
7. HIV (antitijela i antigeni) – 380 rubalja;
8. HIV RNA, visoka kvaliteta – 3500 rubalja;
9. HIV RNA, kvantitativno - 11 000 rubalja.

Kako biste uštedjeli novac, možete odabrati fiksni paket analize. Ovu uslugu pruža većina klinika u kojima se možete testirati PRC metodom (invitro, onclinic itd.).

Provođenje PCR analize (PCR dijagnostika) započinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvaliteta i pouzdanost naknadno dobivenih rezultata osigurana je najvišim kvalifikacijama i bogatim iskustvom liječnika medicinskog centra Euromedprestige, koji poštuju sva potrebna pravila za provođenje PCR analize: potpuna sterilnost, korištenje samo jednokratnih materijala.

Sakupljeni materijal s kista stavlja se u posudu s fiziološkom otopinom. Nakon prikupljanja uzorke je potrebno što prije dostaviti u PCR laboratorij.

PCR analiza se provodi u laboratoriju u tri faze:

1. ekstrakcija DNK
2. Amplifikacija fragmenata DNA
3. Detekcija produkata amplifikacije DNA

Ekstrakcija DNK početna je faza PCR dijagnostike, čija je bit sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tijekom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. U materijal pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Time se uklanjaju lipidi, aminokiseline, peptidi, ugljikohidrati, proteini i polisaharidi. Kao rezultat toga nastaje DNA ili RNA.

Princip PCR metode je “konstrukcija” novih DNA ili RNA infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja staničnog materijala.

Količina vremena utrošena na ekstrakciju DNA ovisi o uzročniku infekcije i vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0 Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

amplifikacija DNA

Za provođenje sljedeće faze DNK dijagnostike - DNK amplifikacije - liječnici koriste takozvane DNK matrice - DNK molekule infekcija, na koje će naknadno doći do "kloniranja" DNK. Već je spomenuto da nije nužna prisutnost kompletne DNA infekcije, za provedbu ove faze dovoljan je mali komadić molekule DNA koji je karakterističan samo za određeni mikrob (infekcija).

Osnova amplifikacije DNA i, sukladno tome, temelj cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNA za sva živa bića - replikacija DNA, koja se provodi udvostručenjem jednog lanca DNA.

Počevši od jednog fragmenta DNK, laboratorijski liječnik ga kopira i povećava broj kopija u načinu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, zatim 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom broj kopija se udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa brojka već ide u milijune, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom kemijskom reaktoru. Ovdje su u otopini sve potrebne komponente sinteze prisutne u dovoljnim količinama, prije svega nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima točna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem početnica na lanac DNA - umjetno sintetiziranih "komada" DNA (parova nukleotida) sličnih DNA mikroba (infekcija) - formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNA dijelova, koji su potrebni za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca događa se kompletiranjem svakog od dva lanca DNA. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNA polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator za reakciju i prati sekvencijalno pričvršćivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNA.

Dakle, amplifikacija DNA je višestruko povećanje broja kopija DNA koje su specifične, tj. svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe dovršavati cijeli lanac DNK da bi se vidio uzročnik infekcije. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao jedinku.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa s gastroenterologom

POPUST 25% NA DOGOVORU KOD KARDIOLOGA

- 25%primarni
Posjet liječniku
terapeut vikendom

5160 RUB umjesto 5.420 rub. Probir muškaraca na urološke infekcije

ALERGOLOGIJA 5120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi visoko ponavljajući koraci pojačanja odvijaju se na različitim temperaturama. Za provođenje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačivač, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema zadanom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. Ovisno o programu i vrsti infekcije koja se otkriva, automatizirani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Kvalifikacije laboratorijskog liječnika koji provodi analizu igraju važnu ulogu u PCR dijagnostici, o njemu ovise točne postavke PCR opreme i interpretacija rezultata. Liječnici Medicinskog centra Euromedprestige imaju bogato iskustvo u provođenju DNK dijagnostike, što osigurava pouzdanost rezultata istraživanja i jamči pozitivan uspjeh u liječenju zaraznih bolesti. U našem medicinskom centru Euromedprestige napraviti PCR testove i provesti kompletnu dijagnostiku i liječenje zaraznih bolesti.

Tijekom detekcije produkata amplifikacije odvaja se nastala smjesa produkata amplifikacije. Smjesi se dodaju posebne otopine koje fragmentima DNA daju mogućnost fluoresciranja – reflektiranog u narančasto-crvenim svjetlećim prugama. Dobiveni sjaj ukazuje na prisutnost DNA virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.