Polimerna lančana reakcija. Pogledajte šta je “PCR” u drugim rječnicima

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

nazvan po Yasenetsky Federalnoj agenciji za zdravstvo i društveni razvoj »

Zavod za medicinsku genetiku i kliničku neurofiziologiju IPO

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za studente 3-4 godine

na specijalnostima opšte medicine (060101) i

Krasnojarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Osnovni principi metode polimerazne lančane reakcije. Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103). – Krasnojarsk: Izdavačka kuća Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja KrasSMA, 2007. – 42 str.

Priručnik za nastavu je u potpunosti usklađen sa zahtjevima Državnog standarda (2000) i odražava glavne aspekte savremene metode dijagnosticiranja nasljednih bolesti ljudi - metodu lančane reakcije polimeraze, obrazovni materijal je prilagođen obrazovnim tehnologijama, uzimajući u obzir specifičnosti. školovanja na 3-4 godine medicinskog i pedijatrijskog fakulteta.

Recenzenti:Šef Katedre za medicinsku genetiku Državne obrazovne ustanove visokog stručnog obrazovanja

„Novosibirski državni medicinski univerzitet Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj“, doktor medicinskih nauka, profesor;

DNK replikacija

Predmet proučavanja ove metode je deoksiribonukleinska kiselina (DNK). DNK je univerzalni nosilac genetskih informacija u svim organizmima koji postoje na Zemlji (s izuzetkom mikroorganizama koji sadrže RNK). DNK je dvostruki lanac uvijen u spiralu. Svaki lanac se sastoji od nukleotida povezanih u nizu. DNK lanci imaju suprotne smjerove: kraj od 5" jednog lanca odgovara kraju od 3" drugog lanca. Jedinstveno svojstvo DNK je njegova sposobnost udvostručavanja. Ovaj proces se zove replikacija. Replikacija molekula DNK događa se tokom sintetičkog perioda interfaze. Svaki od dva lanca "majčinog" molekula služi kao šablon za "ćerku". Nakon replikacije, novosintetizirana molekula DNK sadrži jedan „majčinski“ lanac, a drugi je novosintetizirani „ćerki“ lanac (polukonzervativna metoda). Za sintezu nove DNK molekule potrebno je da se stari molekul despirira i produži. Replikacija počinje na nekoliko mjesta u molekuli DNK. Zove se dio molekule DNK od početne točke jedne replikacije do početne točke druge replicon.

Početak replikacije je aktiviran prajmeri(prajmeri) koji se sastoje od 100-200 parova nukleotida. Enzim DNK helikaza se odmotava i dijeli matičnu spiralu DNK na dva lanca, na kojima se, po principu komplementarnosti, uz učešće enzima DNK polimeraze, sklapaju „ćerki“ DNK lanci. Da bi enzim započeo svoj rad, potrebno je prisustvo startnog bloka - malog početnog dvolančanog fragmenta. Početni blok se formira interakcijom prajmera sa komplementarnim regionom odgovarajućeg lanca roditeljske DNK. U svakom replikonu, DNK polimeraza se može kretati duž "majčinskog" lanca u samo jednom smjeru (5`=>3`).

Na vodećim pramenovima, kako se replikon odmotava, "kćerka" lanac postepeno kontinuirano raste. Na zaostalom lancu, lanac kćerka se takođe sintetiše u pravcu (5`=>3`), ali u odvojenim fragmentima kako se replikon odmotava.

Dakle, dodavanje komplementarnih nukleotida lanaca "ćerke" događa se u suprotnim smjerovima (antiparalelno). Replikacija u svim replikonima se dešava istovremeno. Fragmenti i dijelovi "kćeri" lanaca sintetizirani u različitim replikonima su ušiveni u jedan lanac pomoću enzima ligaze. Replikaciju karakteriziraju polukonzervativnost, antiparalelnost i diskontinuitet. Cijeli genom ćelije se replicira jednom u vremenskom periodu koji odgovara jednom mitotičkom ciklusu. Kao rezultat procesa replikacije, iz jednog molekula DNK formiraju se dva molekula DNK, pri čemu je jedan lanac iz matičnog molekula DNK, a drugi, kćer, novosintetizovan (slika 1).

Rice. 1. Shema replikacije molekula DNK.

Dakle, ciklus replikacije DNK uključuje tri glavne faze:

1. odmotavanje spirale DNK i divergencija lanaca (denaturacija);

2. pričvršćivanje prajmera;

3. dovršavanje lanca podređene niti.

Princip PCR metode

Replikacija DNK čini osnovu PCR-a. U PCR-u, gore navedeni procesi se izvode u epruveti u cikličnom režimu. Prijelaz iz jedne faze reakcije u drugu postiže se promjenom temperature inkubacione smjese. Kada se rastvor zagreje na 93-95°C, dolazi do denaturacije DNK. Da bi se prešlo na sljedeću fazu - dodavanje ili "žarenje" prajmera - smjesa za inkubaciju se ohladi na 50-65°C. Zatim se smjesa zagrije na 70-72°C - optimalnu za taq-DNK polimerazu - u ovoj fazi dolazi do izgradnje novog lanca DNK. Zatim se ciklus ponovo ponavlja. Drugim riječima PCR metoda je višestruko povećanje broja kopija (pojačanje) specifičan dio DNK koji katalizira enzim DNK polimeraza.

Rast ćerki DNK lanaca mora se odvijati istovremeno na oba lanca DNK majke, tako da replikacija drugog lanca takođe zahteva sopstveni prajmer. Tako se u reakcionu smjesu dodaju dva prajmera: jedan za lanac “+”, drugi za lanac “-”. Nakon što se pričvrste za suprotne lance molekule DNK, prajmeri se ograničavaju na njen dio koji će se kasnije umnožavati ili umnožavati mnogo puta. Dužina takvog fragmenta, nazvanog amplikon, obično je nekoliko stotina nukleotida.

PCR faze

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 stupnja, koji se javljaju pri različitim temperaturnim uslovima (slika 2).

· 1. faza: Denaturacija DNK . Pojavljuje se na 93-95° u trajanju od 30-40 sekundi.

· 2. faza: prajmer žarenje . Vezivanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog regiona. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Vrijeme žarenja 20-60 sek.

· Faza 3: kompletiranje DNK lanaca Komplementarno kompletiranje DNK lanaca se dešava od 5" kraja do 3" kraja lanca u suprotnim smerovima, počevši od mesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih DNK lanaca je deoksiribonukleozid trifosfat koji se dodaje u otopinu. Proces sinteze katalizira enzim taq polimeraza i odvija se na temperaturi od 70-72°C. Vrijeme sinteze je 20-40 sekundi.

Novi DNK lanci formirani u prvom ciklusu amplifikacije služe kao šabloni za drugi ciklus amplifikacije, u kojem se formira specifični fragment DNK amplikona (slika 3). U narednim ciklusima amplifikacije, amplikoni služe kao šablon za sintezu novih lanaca.

Dakle, akumulacija amplikona u rastvoru se dešava prema formuli 2", gde je n broj ciklusa amplifikacije. Dakle, čak i ako je početna otopina u početku sadržavala samo jedan dvolančani DNK molekul, onda u 30-40 ciklusa oko U rastvoru se akumulira 108 molekula amplikona, što je dovoljno za pouzdanu vizuelnu detekciju ovog fragmenta elektroforezom u agaroznom gelu.

Proces pojačanja se izvodi u posebnom programabilnom termostatu ( termalni ciklus), koji prema datom programu automatski mijenja temperature prema broju ciklusa pojačanja.

Za izvođenje pojačanja potrebne su sljedeće komponente:

· DNK matrica(DNK ili njen dio koji sadrži željeni specifični fragment);

· Prajmeri(sintetski oligonukleotidi (20-30 parova nukleotida), komplementarni DNK sekvencama na granicama specifičnog fragmenta koji se utvrđuje). Izbor specifičnog fragmenta i odabir prajmera igra ključnu ulogu u specifičnosti amplifikacije, što utiče na kvalitet analize.

· Smjesa deoksinukleotid trifosfata (dNTP)(mješavina četiri dNTP-a, koji su materijal za sintezu novih komplementarnih DNK lanaca u ekvivalentnim koncentracijama od 200-500 µM)

· EnzimTaq-polimeraza(termostabilna DNK polimeraza koja katalizuje produžavanje lanaca prajmera uzastopnim dodavanjem nukleotidnih baza rastućem lancu sintetizovane DNK, 2-3 mM).

· Puferski rastvor(reakcioni medij koji sadrži jone Mg2+ neophodne za održavanje aktivnosti enzima, pH 6,8-7,8).

Za identifikaciju specifičnih regiona genoma RNA virusa, prvo se dobije kopija DNK iz RNA šablona koristeći reakciju reverzne transkripcije (RT) koju katalizira enzim revertaza (reverzna transkriptaza).

Rice. 2. Amplifikacija (1. ciklus).

Rice. 3. Amplifikacija (2. ciklus).

Glavne primjene PCR-a

· klinička medicina:

o dijagnoza infekcija,

o identifikacija mutacija, uključujući dijagnozu nasljednih bolesti,

o genotipizacija, uključujući HLA genotipizaciju,

o ćelijske tehnologije

· ekologija (kao način praćenja stanja i kvaliteta ekoloških objekata i prehrambenih proizvoda)

· određivanje transgenih organizama (GMO)

Lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

· opšta i specifična biologija,

Osnovni principi

organizacija dijagnostičkih laboratorija

Rad u PCR laboratoriji obavlja se u skladu sa „Pravilima uređenja, sigurnosnih mjera, industrijske sanitacije, protivepidemijskog režima i lične higijene pri radu u laboratorijama (odjelima, odjeljenjima) sanitarno-epidemioloških ustanova zdravstvenog sistema.

Kontaminacija DNK uzoraka

Provođenje PCR dijagnostike je povezano s problemom zbog visoke osjetljivosti metode - mogućnost kontaminacije. Unošenje tragova pozitivne DNK u reakcijsku epruvetu (specifični proizvodi amplifikacije DNK - amplikoni; DNK standard koji se koristi kao pozitivna kontrola; pozitivna DNK iz kliničkog uzorka) dovodi do amplifikacije specifičnog DNK fragmenta tokom PCR-a i kao rezultat , do pojave lažno pozitivnih rezultata.

U procesu rada možete naići dvije vrste kontaminacije:

1. unakrsna kontaminacija od uzorka do uzorka (tokom obrade kliničkih uzoraka ili prilikom rastvaranja reakcione smjese), što dovodi do sporadičnih lažno pozitivnih rezultata;

2. kontaminacija proizvodima amplifikacije(amplikoni), što je od najveće važnosti, jer se tokom PCR procesa amplikoni akumuliraju u ogromnim količinama i idealni su proizvodi za reamplifikaciju.

Kontaminacija staklenog posuđa, automatskih pipeta i laboratorijske opreme, površine laboratorijskih klupa, pa čak i površine kože laboratorijskih radnika sa količinama u tragovima amplikona dovodi do sistematskih lažno pozitivnih rezultata. Utvrđivanje izvora kontaminacije može biti vrlo teško i zahtijeva značajno ulaganje vremena i novca. Dosadašnje iskustvo stečeno u laboratorijama koje koriste PCR metodu za dijagnostiku omogućava nam da formulišemo osnovne zahtjeve za organizaciju takvih laboratorija i izvođenje samih analiza. Usklađenost sa ovim zahtjevima eliminira mogućnost kontaminacije i lažno pozitivnih rezultata.

Faze PCR analize

Geografski su razdvojeni tako što su smešteni u odvojene prostorije (sl. 4, 5):

· Pre-PCR soba, gde se obrađuju klinički uzorci, izoluje se DNK, priprema reakciona smeša za PCR i obavlja se PCR (ako postoje uslovi, preporučljivo je i poslednje dve faze da se sprovedu u dodatnoj zasebnoj prostoriji). U ovim prostorijama zabranjeno je obavljanje svih drugih vrsta radova sa test agensima, čija se PCR dijagnostika obavlja u ovoj laboratoriji.

· Post-PCR soba, gdje se vrši detekcija produkata amplifikacije. U ovoj prostoriji mogu se koristiti i druge metode detekcije. Preporučljivo je locirati prostoriju za detekciju proizvoda amplifikacije što je dalje moguće od prostorija za pre-PCR.

Radne prostorije su opremljene ultraljubičastim lampama sa maksimalnim zračenjem u području od 260 nm (tip DB-60) po stopi od 2,5 W po 1 m3. Lampe su postavljene tako da su površine radnih stolova, opreme i materijala sa kojima operater ima kontakt prilikom PCR analize izložene direktnom zračenju. Ozračenje se vrši u roku od 1 sata prije početka rada i 1 sat nakon završetka rada.

Laboranti rade u specijalnoj laboratorijskoj odjeći koja se mijenja pri prelasku iz jedne prostorije u drugu i u jednokratnim rukavicama. Odjeća iz različitih prostorija se obrađuje posebno. Različiti zaposlenici rade u različitim fazama PCR analize.

Za rad se koriste odvojeni setovi dozatora, plastično i stakleno posuđe, laboratorijska oprema, mantili i rukavice, namijenjeni za različite faze analize i nisu prenosivi iz jedne prostorije u drugu. Oprema, materijali i potrepštine u svakoj prostoriji su na odgovarajući način označeni.

Sve faze rada se izvode samo uz pomoć potrošnog materijala za jednokratnu upotrebu: vrhova za automatske pipete, epruvete, rukavice itd. Obavezno promijenite vrhove kada prelazite s uzorka na uzorak. Potrebno je koristiti vrhove s filterom - aerosolnom barijerom kako bi se spriječilo da mikrokapljice otopine uđu u pipetu. Korištene cijevi i vrhovi se odlažu u posebne posude ili posude koje sadrže otopinu za dezinfekciju. Klinički uzorci se čuvaju odvojeno od reagensa.

Za obradu i čišćenje radnog mjesta svaka prostorija je opremljena štapićima od pamučne gaze (maramice), pincetama, dezinfekcijskim i inaktivirajućim otopinama.

PCR dijagnostička laboratorija isključuje poslove vezane za proizvodnju (kloniranje) i izolaciju rekombinantnih plazmida koji sadrže sekvence DNK ili fragmente gena patogena koji se dijagnosticiraju u ovoj laboratoriji.

Prikupljanje kliničkog materijala

Materijal koji se proučava za PCR može biti struganje epitelnih ćelija, krvi, plazme, seruma, pleuralne i cerebrospinalne tečnosti, urina, sputuma, sluzi i drugih bioloških sekreta, biopsije.

Materijal se prikuplja u sali za tretmane odgovarajućeg profila. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR dijagnostičku laboratoriju.

Uzorci se moraju uzimati sterilnim, po mogućnosti za jednokratnu upotrebu, instrumentima samo u sterilnim plastičnim epruvetama za jednokratnu upotrebu ili staklenim epruvetama, prethodno tretiranih sat vremena mešavinom hroma, dobro isprati destilovanom vodom i kalcinisati u sušionici na temperaturi od 150°C za 1 sat.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada).

Rice. 4. PCR laboratorijski uređaj sa detekcijom elektroforezom.

Zona detekcije (drugi sprat ili druga zgrada)

Rice. 5. PCR laboratorijski uređaj sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza).

Rice. 6. Soba za ekstrakciju DNK. Prikazana je stolna kutija sa germicidnom lampom.

Rice. 7. Amplification room.

Rice. 8. Soba za detekciju.

Rice. 9. Uzorci krvi za DNK dijagnostiku nasljednih bolesti.

Čuvanje i transport uzoraka

Za dijagnosticiranje nasljednih bolesti, uzorci krvi se pohranjuju na posebnim papirnim formularima ili u epindorfima (plastične epruvete) u zamrznutom stanju dugo vremena (slika 9).

Za dijagnosticiranje zaraznih bolesti, uzorci se drže na sobnoj temperaturi ne više od 2 sata. Ako je potrebno duže skladištenje, uzorci se mogu staviti u frižider na temperaturu od 2-8°C ne duže od jednog dana. Duže skladištenje (do 2 sedmice) dozvoljeno je zamrznuti u zamrzivaču na temperaturi od minus 20°C. Ponovljeno zamrzavanje i odmrzavanje uzoraka nije dozvoljeno.

Ako su PCR dijagnostička laboratorija i prostorija za uzimanje uzoraka geografski razdvojeni, transport uzoraka treba obavljati u termosama ili termo posudama u skladu sa pravilima za čuvanje uzoraka i pravilima za transport infektivnih materijala.

Ekstrakcija DNK iz uzoraka

Postala je široko rasprostranjena metoda sorpcije na čvrstoj fazi koja se sastoji od dodavanja sredstva za lizu koji sadrži otopinu gvanidina, sorpcije DNK na sorbentu, ponovljenog ispiranja i resorpcije DNK puferskom otopinom. Prilikom obrade seruma, plazme ili pune krvi obično se koristi metoda ekstrakcije fenola. Metoda uključuje deproteinizaciju fenolom/hloroformom nakon čega slijedi precipitacija DNK (ili RNK) etanolom ili izopropanolom. Obrada se vrši u Eppendor P epruvetama za mikrocentrifugu zapremine 1,5 ml. Vrijeme obrade je 1,5-2 sata (slika 10).

Rice. 10. Ekstrakcija DNK.

Izvođenje PCR-a

Određena količina uzorka iz obrađenog kliničkog uzorka prenosi se u specijalnu mikrocentrifugirnu epruvetu tipa Eppendorf zapremine 0,2 ili 0,5 ml. U koju se dodaje mešavina za amplifikacija koja se sastoji od vode, PCR pufera, dNTP rastvora, rastvora prajmera i rastvora. ista epruveta. Taq polimeraza (koja se dodaje u smešu poslednja). Obično je zapremina reakcione smeše 25 µl. Zatim se u svaku epruvetu dodaje jedna kap mineralnog ulja kako bi se sprečilo isparavanje reakcione smeše tokom procesa amplifikacije. cijevi se prenose na programabilni termostat (pojačalo), gdje se pojačavanje vrši automatski prema zadatom programu (slika 11).

Rice. jedanaest. Pojačalo" Thermocycler ».

Vrijeme reakcije, ovisno o navedenom programu, je 2-3 sata. Paralelno sa eksperimentalnim uzorcima postavljaju se kontrolni uzorci: pozitivna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto materijala kliničkog uzorka dodaje kontrolni DNK preparat ispitivanog gena. Negativna kontrola uključuje sve komponente reakcije, ali se umjesto kliničkog materijala ili DNK preparata dodaje odgovarajuća količina deionizirane vode ili ekstrakta koji ne sadrži DNK koja se testira. Negativna kontrola je neophodna da bi se provjerili komponente reakcije na odsustvo DNK zbog kontaminacije i da bi se isključili lažno pozitivni rezultati.

Registracija rezultata

Amplificirani specifični DNK fragment se detektuje elektroforezom u agaroznom gelu u prisustvu etidijum bromida. Etidijum bromid formira stabilno intersticijalno jedinjenje sa fragmentima DNK, koje se pojavljuje u obliku svetlećih traka kada se gel ozrači UV zračenjem talasne dužine 290-330 nm. U zavisnosti od veličine amplikona nastalih kao rezultat PCR-a, koristi se gel sa sadržajem agaroze od 1,5% do 2,5%. Za pripremu agaroznog gela, mješavina agaroze, pufera i vode se otopi u mikrovalnoj pećnici ili u vodenom kupatilu i doda se otopina etidijevog bromida. Smjesa, ohlađena na 50-60°C, ulijeva se u kalup u sloju debljine 4-6 mm i posebnim češljevima se prave džepovi u gelu za nanošenje uzorka. Češljevi se postavljaju na način da između dna jažica i baze gela ostane sloj agaroze od 0,5-1 mm. Nakon što se gel stvrdne, pojačalo se nanosi na džepove u količini od 5-15 μl. Preporučuje se izvođenje elektroforeze mješavine markera dužine DNK fragmenta paralelno s kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Tipično, takva mješavina sadrži deset fragmenata DNK dužine 100, 200, 300, itd. parova baza.

Korištenje ovakvog testa omogućava verifikaciju dužine amplikona u kontrolnim i eksperimentalnim uzorcima. Gel sa nanesenim uzorkom se prenosi u komoru za elektroforezu napunjenu puferom, komora se povezuje na izvor napajanja i vrši se elektroforetsko odvajanje produkata amplifikacije u trajanju od 30-45 minuta pri jakosti električnog polja od 10-15 V/ cm. U tom slučaju, prednji dio boje uključen u reakcijsku smjesu mora se kretati najmanje 3 cm.

Nakon što je elektroforeza završena, gel se prenosi u stakleni transiluminator i gleda pod ultraljubičastim svjetlom. Za dokumentaciju, gel se fotografiše na Micrat 300 filmu ili snima pomoću video sistema spojenog na računar.

Prije svega, procjenjuju se kontrolni uzorci. Narandžasta svijetleća traka trebala bi biti prisutna u elektroforetskoj stazi koja odgovara pozitivnoj kontroli. Njegova elektroforetska pokretljivost mora odgovarati dužini amplikona navedenoj u uputama.

U elektroforetskoj stazi koja odgovara negativnoj kontroli, takva traka bi trebala biti odsutna. Prisustvo takve trake u negativnoj kontroli ukazuje na kontaminaciju – kontaminaciju reagensa korišćenih sa test DNK ili amplikonom. Test uzorci se ocjenjuju prisustvom trake na odgovarajućoj stazi, koja se nalazi na istom nivou kao i traka u uzorku pozitivne kontrole. Intenzitet trake odgovara količini DNK koja se testira u uzorku, što omogućava polukvantitativnu procjenu PCR-a. Obično se pozitivni rezultati ocjenjuju na skali od četiri stepena. Ako je sjaj trake u ispitnom uzorku vrlo slab, onda takav uzorak treba preurediti (slika 12).

Rice. 12. Elektroforeza u agaroznom gelu.

Primjena PCR zadijagnostika tačkastih mutacija i polimorfizama gena

Jedno od vodećih područja primjene PCR-a u praktičnoj zdravstvu je dijagnostika točkastih mutacija i polimorfizama gena. . Postoje direktne i indirektne metode DNK dijagnostike. U situacijama kada je poznat gen čije oštećenje dovodi do razvoja nasljedne bolesti, ovo oštećenje se može otkriti molekularno genetskim metodama. Takve metode se nazivaju direktnim. Direktnim metodama otkrivaju se nepravilnosti u primarnoj sekvenci nukleotida DNK (mutacije i njihovi tipovi). Direktne metode karakteriziraju preciznost koja dostiže gotovo 100%.

Međutim, u praksi se ove metode mogu koristiti pod određenim uslovima:

· sa poznatom citogenetskom lokalizacijom gena odgovornog za nastanak nasledne bolesti;

· gen bolesti mora biti kloniran i poznata njegova nukleotidna sekvenca.

Svrha direktne DNK dijagnostike je identifikacija mutantnih alela.

Tako se u situacijama kada se zna kakvo oštećenje DNK dovodi do nasljedne bolesti, direktno se ispituje DNK fragment koji sadrži oštećenje, odnosno koristi se direktna dijagnostička metoda DNK.

Međutim, do danas geni mnogih bolesti nisu mapirani, njihova egzon-intronska organizacija je nepoznata, a mnoge nasljedne bolesti karakterizira naglašena genetska heterogenost, što ne dozvoljava potpunu primjenu direktnih dijagnostičkih metoda DNK. Stoga se u slučajevima kada je lokalizacija oštećenja nepoznata, koristi se drugi pristup, koji se odnosi na proučavanje blizine gena odgovornog za gensku bolest, u kombinaciji sa porodičnom analizom, odnosno indirektnim metodama molekularno-genetske dijagnostike bolesti. koriste se nasljedne bolesti.

Različite metode se mogu koristiti za otkrivanje točkastih mutacija i malih delecija, ali sve se oslanjaju na PCR metodu. Ova reakcija vam omogućava da umnožite sekvencu nukleotida DNK mnogo puta, a zatim tražite mutacije. Metode za traženje fragmenata DNK koji nose mutacije zasnivaju se na komparativnoj analizi mutantnih i normalnih DNK nukleotidnih sekvenci.

Analiza PCR proizvoda

u procesu direktne DNK dijagnostike

Uključuje proučavanje specifičnih karakteristika amplificiranog genskog regiona. Dakle, kod bolesti uzrokovanih ekspanzijom trinukleotidnih ponavljanja, proizvodi amplifikacije se razlikuju po dužini (što odražava različit broj tripleta u proučavanom genskom području) i, kao posljedicu, po brzini kretanja u gelu. Zahvaljujući tome postiže se jasno elektroforetsko razdvajanje normalnih i mutantnih alela i precizno određivanje patološki izduženog fragmenta, odnosno DNK dijagnostika bolesti (Sl. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Rice. 14. Dijagnoza delecije GAG u genu DYT 1 kod pacijenata sa dopa nezavisnom distonijom (elektroforeza na poliakrilamidnom gelu). Trake 2,3,6 – bolesni; staze 1,4,5 – kontrola. Tanka strelica označava normalni alel, debela strelica označava mutantni kraći alel (brisanje tri nukleotida).

Ako je cijela DNK regija koja se proučava dio proširene delecije, tada PCR amplifikacija DNK iz ovog izbrisanog alela neće biti provedena zbog nedostatka mjesta za hibridizaciju prajmera. U ovom slučaju, homozigotna delecija će se dijagnosticirati na osnovu potpunog odsustva produkta PCR reakcije (sinteza DNK je nemoguća iz obje kopije gena). Kod heterozigotne delecije moguće je detektirati PCR proizvod sintetiziran iz normalnog (zadržanog) alela; međutim, da bi se pouzdano dijagnosticirala takva mutacija, potrebno je koristiti složenije metode snimanja DNK koje omogućavaju procjenu doze konačnog PCR-a. proizvod.

Za identifikaciju tačkastih mutacija (najčešće supstitucije nukleotida) na određenim mjestima koristi se PCR metoda u kombinaciji s drugim metodama molekularne genetičke analize. Ako su lokacija i priroda navodne tačkaste mutacije precizno poznate, onda je restrikcijske endonukleaze (restrikcijskim enzimima) su posebni stanični enzimi izolirani iz različitih sojeva bakterija.

Ovi enzimi prepoznaju specifične nukleotidne sekvence u rasponu od četiri do deset nukleotida u dužini. Nakon toga se vrši restrikcija (lat. (rezanje)) ovih sekvenci kao dijela dvolančane DNK molekule.Svaki restrikcijski enzim prepoznaje i na određenom mjestu seče strogo definisanu, specifičnu nukleotidnu sekvencu - restriktivno mjesto (mjesto za prepoznavanje).

U slučajevima kada tačkasta mutacija promijeni prirodno mjesto prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim, ovaj enzim neće moći odcijepiti mutantni fragment amplificiran PCR-om. U nekim slučajevima, mutacija dovodi do pojave novog mjesta prepoznavanja za određeni restrikcijski enzim koji je normalno odsutan.

U obje situacije, mutantni i normalni PCR produkti tretirani odabranim restrikcijskim enzimom će proizvesti restrikcijske fragmente različite dužine, koji se mogu lako detektirati elektroforezom (slika 15).

Dakle, ako je potrebno brzo otkriti bilo koju specifičnu točkastu mutaciju, zadatak se svodi na traženje odgovarajućeg restrikcijskog enzima čije je mjesto prepoznavanja lokalizirano na mjestu poremećene sekvence nukleotida. Tretman PCR proizvoda takvim restrikcijskim enzimom omogućit će lako razlikovanje normalnih i mutantnih alela. Restrikciona analiza uvelike pojednostavljuje otkrivanje poznatih tačkastih mutacija i sada se široko koristi za direktnu DNK dijagnozu nasljednih bolesti.

Završna faza molekularna genetska analiza mutacija je određivanje nukleotidne sekvence fragmenta DNK koji se proučava (sekvenciranje), koji se upoređuje sa normom i formuliše konačna genetska dijagnoza. Zahvaljujući uspjesima molekularne genetike, danas su razvijene DNK dijagnostičke metode za više od 400 nasljednih bolesti.

Rice. 15. Detekcija tačkaste mutacije pomoću restrikcijske analize: A – amplificirana genska regija koja sadrži restrikcijsko mjestoAGCTza restrikcijsku endonukleazuAlu I. MutacijaG→ Amijenja ovu nukleotidnu sekvencu, što rezultira restrikcijskim enzimomAluIblokiran; B – elektroferogram restrikcijskih proizvoda: kolosek 1 – homozigotnost za normalni alel; kolosijek 2 – homozigotnost za mutaciju; kolosijek 3 – heterozigotno stanje (normalan alel + mutacija).

Dijagnoza nasljednih bolesti, zasnovana na direktnom ispitivanju mutantnih alela kod pacijenata, članova njihovih porodica ili sumnjivih heterozigotnih nosilaca patoloških mutacija, pogodna je za predsimptomatsku i prenatalnu dijagnostiku, koja se može primijeniti u najranijim fazama fetalnog razvoja, prije pojava bilo kakvih kliničkih ili biohemijskih simptoma bolesti.

Bez obzira na metodu detekcije mutacije, tačne molekularne karakteristike svake mutacije mogu se dobiti samo direktnim sekvenciranjem. Za automatizaciju ovog procesa posljednjih godina uveliko se koriste posebni uređaji - sekvenceri, koji omogućavaju značajno ubrzanje procesa čitanja DNK informacija.

Put ka široj upotrebi molekularno bioloških istraživanja u kliničko-dijagnostičkim laboratorijama otvara se ubrzavanjem analitičkog procesa izvođenjem svih postupaka u jednom kontinuumu, bez prijenosa uzorka, stvaranjem uslova za sprječavanje kontaminacije pri paralelnom ispitivanju većeg broja analita i objektivnim evidentiranjem rezultata. rezultate u svakom ciklusu.

Glavne modifikacije PCR metode

Koristi se za brzo skeniranje i traženje poznatih genskih mutacija.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ova metoda se zasniva na istovremenoj amplifikaciji nekoliko egzona ispitivanog gena u jednoj reakciji. Ovo omogućava ekonomičan brzi skrining najčešćih mutacija. Na primjer, za brzo dijagnosticiranje delecija u genu za distrofin kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom, provodi se simultana amplifikacija skupa najčešće mutiranih egzona ovog gena. Budući da se ove bolesti nasljeđuju na X-vezani recesivni način i da su povezane s oštećenjem jedinog X hromozoma kod dječaka, u slučaju produžene delecije, elektroforeza produkta reakcije će otkriti odsustvo jednog ili više fragmenata DNK (egzona). ), što može poslužiti kao molekularna potvrda dijagnoze. Osim toga, odabirom specifičnih genskih sekcija za PCR amplifikaciju, moguća je prilično precizna procjena ukupne dužine delecije i graničnih tačaka gena (sve do egzona).

Kombinovana upotreba nekoliko multipleksnih reakcija omogućava dijagnosticiranje do 98% svih delecija koje se javljaju kod pacijenata s progresivnom Duchenne/Beckerovom mišićnom distrofijom. Ovo predstavlja približno 60% od ukupnog broja poznatih mutacija u genu za distrofin i ukazuje na veoma visoku efikasnost ove metode skrininga za DNK dijagnozu distrofinopatija (Sl. 16).

Rice. 16. Direktna DNK dijagnoza Duchenneove mišićne distrofije korištenjem multipleks PCR (agaroznog gel elektroforeza). Kod svake od ispitivanih osoba istovremeno su amplificirana četiri egzona gena za distrofin (egzoni 17, 19, 44 i 45; strelice pokazuju odgovarajuće produkte amplifikacije). Traka 1 – kontrolna, traka 2-5 – pacijenti sa Duchenneovom mišićnom distrofijom sa različitim delecijama gena za distrofin (trake 2 i 5 – delecija egzona 45, staza 3 – delecija egzona 44, staza 4 – delecija egzona 17 i 19 ).

Alel-specifična amplifikacija

Metoda se zasniva na upotrebi dva nezavisna para prajmera za specifičnu regiju gena: jedan prajmer u oba para je uobičajen, a drugi prajmer u svakom paru ima drugačiju strukturu i komplementaran je normalnoj ili mutantnoj DNK sekvenci. Kao rezultat takve reakcije, dvije vrste PCR proizvoda mogu se istovremeno sintetizirati u otopini - normalni i mutantni. Štaviše, dizajn prajmera koji se koristi omogućava jasno razlikovanje normalnih i mutantnih produkata amplifikacije prema njihovoj molekularnoj veličini. Ova metoda je vrlo vizualna i omogućava vam da provjerite i homo- i heterozigotno nošenje mutiranog alela.

Metoda za modifikaciju amplificirane DNK usmjerene na mjesto

Metoda se zasniva na upotrebi takozvanog mismatch prajmera u PCR-u (koji nije u potpunosti komplementaran šablonu), koji se od šablonske DNK sekvence razlikuje za jedan nukleotid. Kao rezultat uključivanja navedenog prajmera u mutantni PCR proizvod, u njemu se formira umjetno stvoreno restrikcijsko mjesto za jednu od restrikcijskih endonukleaza, što omogućava direktnu DNK dijagnozu određene poznate mutacije pomoću restrikcijske analize. Stvaranje takvog umjetnog restriktivnog mjesta je neophodno ako pretraga nije otkrila postojanje poznatog i dostupnog enzima, čije je „prirodno” restriktivno mjesto pogođeno kao rezultat pojave mutacije koja se proučava u molekuli DNK. .

PCR metoda reverzne transkriptaze (RT- PCR)

Ova metoda se koristi u slučajevima kada je prikladnije koristiti ne genomsku DNK kao predmet proučavanja, već kompaktniju i informacijski bogatiju cDNK dobijenu nakon odgovarajuće obrade uzoraka tkiva, na primjer, biopsijskog materijala ili ćelijskih linija limfocita, fibroblasti, itd. Važan uslov je ekspresija (barem minimalna) željenog gena u tkivu koje se proučava.

U prvoj fazi se vrši reverzna transkripcija mRNA, a rezultirajući molekuli cDNK služe kao šablon za PCR. Nakon toga, kritični region cDNK, amplificiran u dovoljnoj količini, podvrgava se sekvenciranju i drugim metodama skrininga mutacija, direktnoj elektroforetskoj studiji (detekcija delecija, insercija, itd.) ili integraciji u sistem ekspresije kako bi se dobio proteinski proizvod i njegovu direktnu analizu.

Ova metoda je posebno efikasna za otkrivanje mutacija koje dovode do sinteze “krnjeg” proteina (besmislene mutacije, mutacije spajanja, velike delecije) – takozvana PTT analiza (Protein Truncation Test). PTT analiza se obično koristi u proučavanju dugih multi-egzonskih gena, kao što su Duchenne/Beckerova mišićna distrofija, ataksija-telangiektazija ili neurofibromatoza tipa 1.

PCR u realnom vremenu(PCR u realnom vremenu, engleski)

Svake godine PCR u realnom vremenu postaje sve popularnija dijagnostička metoda u praktičnoj zdravstvenoj zaštiti. Njegova osnovna karakteristika je praćenje i kvantitativna analiza akumulacije proizvoda lančane reakcije polimeraze i automatska registracija i interpretacija dobijenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva fazu elektroforeze, što smanjuje zahtjeve za PCR laboratorijom. Zahvaljujući uštedi proizvodnog prostora, smanjenju broja osoblja i potražnji za kvantitativnim određivanjem DNK/RNA, ova metoda se posljednjih godina uspješno koristi u najvećim sanitarno-epidemiološkim, dijagnostičkim i istraživačkim centrima u razvijenim zemljama svijeta, zamjenjujući PCR u svom trenutnom („klasičnom“) formatu.

PCR u realnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u realnom vremenu omogućava potpunu analizu uzorka u roku od 20-60 minuta i teoretski je sposoban detektirati čak i jedan DNK ili RNK molekul u uzorku.

Rice. 17. PCR u realnom vremenu.

PCR u realnom vremenu koristi TaqMan sistem koji kontroliše PCR kinetiku direktno tokom amplifikacije koristeći gašenje rezonancije fluorescencije. Za detekciju se koristi sonda koja nosi fluorofor i gasitelj komplementaran srednjem dijelu amplificiranog fragmenta. Kada su fluorofor i gasitelj vezani za oligonukleotidnu sondu, uočava se samo manja fluorescentna emisija. Tokom procesa amplifikacije, zbog 5" egzonukleazne aktivnosti Taq polimeraze, fluorescentna oznaka odlazi u rastvor, oslobođena od svoje blizine gasitelju, i generiše fluorescentni signal koji se povećava u realnom vremenu proporcionalno akumulaciji pojačala ( Slika 17).

Glavne prednosti PCR u realnom vremenu u odnosu na PCR sa gel elektroforezom:

· Cela metoda se odvija u jednoj epruveti;

· Metoda traje 1 sat;

· 1-2 radne sobe su dovoljne;

· Uz kvalitativnu procjenu rezultata, postoji mogućnost kvantitativne procjene (npr. kod propisivanja antivirusne terapije za AIDS ili virusni hepatitis potrebno je znati virusno opterećenje, odnosno količinu virusa po jedinici koja obezbeđuje PCR u realnom vremenu);

· Rizik od kontaminacije je naglo smanjen.

Zaključak

PCR metoda je jedna od najčešćih metoda molekularno bioloških istraživanja. Kliničari bi ovu metodu trebali inteligentno koristiti, a ljekar koji odluči da koristi PCR u svom radu mora imati određena znanja o karakteristikama i mogućnostima ove metode. Drugo, mora postojati bliska povratna informacija između kliničara i PCR laboratorije, koja je neophodna za analizu složenih slučajeva i razvoj ispravne dijagnostičke strategije. Treće, PCR analiza nije lijek za dijagnostiku (prvenstveno zaraznih bolesti) i ne zamjenjuje postojeće metode istraživanja, već ih samo nadopunjuje. I što je najvažnije, PCR ne može zamijeniti intuiciju i analitičko razmišljanje koje liječnik koji očekuje uspjeh mora imati.

P . S . Molekularno biološka istraživanja - mijenjanje smjernica za dijagnozu i liječenje. Upotreba molekularno bioloških metoda povezana je s perspektivom radikalne promjene naglaska u laboratorijskoj dijagnostici. Možda se ne radi samo o pravovremenim informacijama, već o tome da ih dobijete unaprijed. Ako se sada laboratorijski testovi u većini slučajeva provode već kada se bolest razvila i liječenje je počelo, onda se očekuje da će molekularno-biološki laboratorijski podaci omogućiti da se utvrdi sklonost osobe određenim vrstama patologije i stepen osjetljivosti na određene lijekove. , koji će opravdati prediktivnu, preventivnu i personalizovanu prirodu buduće medicine.

PROMJENA DIJAGNOSTIKE I ORIJENTACIJE U LJEČENJU

NASLJEDNE BOLESTI

Danas U budućnosti

Dijagnoza Genetski pasoš

8. Koliko je radnih prostorija potrebno za rad PCR laboratorije sa fluorescentnom detekcijom (kvantitativna analiza, PCR u realnom vremenu)?

9. Šta je detekcija?

10. Koje metode DNK dijagnostike postoje?

11. Rad kog enzima je u osnovi PCR?

12. Zašto se zona detekcije mora ukloniti iz drugih radnih područja?

13. Šta je restriktivna lokacija?

14. Koje su razlike između direktne i indirektne DNK dijagnostičke metode?

15. Šta je sekvenciranje?

16. Šta je multipleks PCR?

17. Koje vrste mutacija se određuju PCR-om?

18. Šta je kontaminacija?

19. Koja je suština alel-specifične metode amplifikacije?

20. Uslovi skladištenja PCR materijala?

21. U kom uređaju se pojačava?

22. Šta je metoda PCR reverzne transkriptaze (RT-PCR)?

23. Šta služi kao materijal za PCR dijagnostiku?

24. Navedite vrste kontaminacije?

Testovi za samopripremu

1. Endonukleazni restrikcijski enzimi:

a) enzimi koji "razbijaju" DNK na strogo određenim mjestima;

b) enzimi koji spajaju lomove u molekulu DNK;

c) enzimi koji obezbeđuju jedinjenja koja vrše popravku DNK.

2. Amplifikacija gena:

3. Koja metoda molekularne genetike se koristi za dijagnosticiranje bolesti uzrokovanih mutiranim genom poznate sekvence?

a) upotreba specifičnog restriktivnog enzima;

b) direktna detekcija upotrebom specifičnih molekularnih sondi;

c) porodična analiza distribucije polimorfizama dužine normalnih restrikcijskih fragmenata.

4. DNK sekvenciranje:

a) identifikacija sekvence baze DNK;

b) višestruko ponavljanje bilo kojeg dijela DNK;

c) izolacija fragmenta DNK koji sadrži gen koji se proučava.

5. Za dobijanje DNK uzoraka možete koristiti :

b) horionske resice;

c) amnionska tečnost;

d) ćelije amnionske tečnosti;

e) biopsijski uzorci kože, mišića, jetre,

e) sve je tačno osim tačke "c",

g) sve je tačno osim tačke “d”,

h) sve gore navedeno je tačno.

6. Za dijagnosticiranje koje se mutacije koristi PCR metoda:

a) genomski;

b) hromozomski;

c) gen (tačka).

7. Prajmer je:

a) komplementarni dio DNK;

b) sintetički oligonukleotid označen (radioaktivno ili fluorescentno) sekvencu komplementarnu mutantnom ili normalnom genu;

c) oligonukleotid koji djeluje kao “prajmer” i inicira sintezu polinukleotidnog lanca na DNK ili RNK matrici.

8. Ko je razvio princip PCR metode?

b) K. Mullis

9. Koristi li se PCR metoda za dijagnosticiranje ekspanzije trinukleotidnih ponavljanja (dinamički tip mutacije)?

10. U kojim oblastima se koristi PCR?

a) klinička medicina;

b) određivanje transgenih organizama (GMO)

c) lična identifikacija, utvrđivanje očinstva, forenzika

d) sve gore navedeno,

e) ništa od navedenog..

Primjeri odgovora: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – u; 7 – u; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Main

1.Bočkova genetika. Moskva. GEOTAR, 2002.

Dodatno

1. , Bakharev i liječenje urođenih i nasljednih bolesti kod djece. – Moskva, 2004.

2. DNK dijagnostika i medicinsko genetičko savjetovanje. – Moskva, 2004.

3. Ginter genetika. – Moskva, 2003.

4. Gorbunov osnove medicinske genetike. – Sankt Peterburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molekularna klinička dijagnostika. – Svijet, 1999.

6. Menšikov - biološka istraživanja u kliničkoj laboratorijskoj dijagnostici: mogućnosti problema (predavanja). Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 3, 2006.

7. Kornienkov rad u PCR laboratoriji tokom in-line analize biološkog materijala. Klinička laboratorijska dijagnostika, br. 10, 2006.

8. Organizacija rada PCR laboratorije. Metodička uputstva. MU 1.3.1794-03. Glavni sanitarni doktor Ruske Federacije, 2003.

9. Erlich H. A. PCR tehnologija. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Kvantitativni PCR u realnom vremenu. Genome Res. – br. 6, 1996.

OSNOVNI PRINCIPI METODE

POLIMERAZNA LANČANA REAKCIJA

Metodički priručnik za vannastavni rad studenata 3-4 godine na specijalnostima opšte medicine (060101) i pedijatrije (060103).

GOU VPO "Državna medicinska akademija Krasnojarsk Federalne agencije za zdravstvo i socijalni razvoj"

Rusija, Krasnojarsk,

Principi PCR dijagnostike

SAŽETAK

sekcije, 34 strane, 5 slika, 5 referenci

Svrha ovog rada je kratak sažetak osnovnih principa i tehnoloških karakteristika PCR metode, njene naučne i praktične primjene u dijagnostici zaraznih bolesti.

SPISAK KONVENCIONALNIH SKRAĆENICA

HCV - virus hepatitisa C

dATP - deoksiadenozin trifosfat

dGTP - deoksiguanozin trifosfat

dNTP - deoksinukleotid trifosfat

dTTP - deoksitimidin trifosfat

dCTP - deoksicitozin trifosfat

DNK - deoksiribonukleinska kiselina

PCR - lančana reakcija polimeraze

RNA - ribonukleinska kiselina - klasa imunoglobulina GTime PCR - PCR metoda u realnom vremenu

UVOD

PRINCIP PCR METODE

FAZE PCR ANALIZE

PCR METODA U REALNOM VREMENU

PREDNOSTI PCR METODE

OGRANIČENJA PCR METODE

PRIMJENA PCR METODE

ZAKLJUČAK

LISTA KORIŠTENE REFERENCE

UVOD

Otkriće metode lančane reakcije polimeraze (PCR) postalo je jedan od najznačajnijih razvoja u oblasti molekularne biologije u posljednjih nekoliko desetljeća. To je omogućilo podizanje medicinske dijagnostike na kvalitativno novi nivo. Princip metode lančane reakcije polimerazom razvila je Carrie Mullis 1983. godine. Za razvoj PCR analize, K. Mullis je dobio Nobelovu nagradu za hemiju 1993. godine.

Nakon otkrića PCR-a, vrlo brzo je uveden u praksu. Metoda je postala toliko popularna da je danas teško zamisliti rad na polju molekularne biologije bez njene upotrebe. PCR metoda je dobila posebno brz razvoj zahvaljujući međunarodnom programu Human Genome. Stvorene su moderne tehnologije laserskog sekvenciranja (dekodiranje sekvenci nukleotida DNK). Ako je u nedavnoj prošlosti trebalo nedelju dana da se dešifruje DNK sekvenca od 250 parova nukleotida (bp), savremeni laserski sekvenceri mogu da odrede i do 5000 bp. za jedan dan. Ovo zauzvrat doprinosi značajnom rastu informacionih baza podataka koje sadrže sekvence DNK. Trenutno su predložene različite modifikacije PCR-a, prikazana je mogućnost stvaranja test sistema za detekciju mikroorganizama i identifikaciju tačkastih mutacija, te opisano na desetine mogućih primjena metode.

Pojava PCR metode je posljedica određenih dostignuća u oblasti molekularne genetike, prvenstveno dekodiranja nukleotidnog niza genoma niza mikroorganizama. Treba napomenuti da je ovo otkriće pratio razvoj određenih tehnologija. Konkretno, pojava uređaja koji omogućavaju automatsku sintetizaciju jednolančanih fragmenata DNK (oligonukleotida). U istom periodu otkriveni su jedinstveni mikroorganizmi koji žive u gejzirima. Njihov enzimski sistem, posebno DNK polimeraza, podnosi visoke temperature toplih izvora i zadržava svoju biološku aktivnost do 95°C, što je neophodan uslov za izvođenje lančane reakcije polimeraze.

Lančana reakcija polimerazom je trenutno najnaprednija dijagnostička metoda molekularne biologije, molekularne genetike i kliničke laboratorijske dijagnostike, koja omogućava identifikaciju pojedinačnih ćelija patogena mnogih zaraznih bolesti u tkivima i biološkim tečnostima organizma.

PCR metoda se temelji na komplementarnom kompletiranju dijela genomske DNK ili RNK patogena, koji se provodi in vitro uz korištenje enzima termostabilne DNK polimeraze. Specifičnost metode je određena jedinstvenošću genetskog materijala otkrivenih infektivnih agenasa za koji se biraju oligonukleotidni prajmeri uključeni u proces amplifikacije.

Dijagnoza zaraznih bolesti, uključujući i one uzrokovane uzročnicima koji se teško uzgajaju, genotipizacija mikroorganizama, procjena njihove virulencije, određivanje rezistencije mikroflore na antibiotike, prenatalna dijagnoza, biološki monitoring krvnih produkata - ovo je nepotpuna lista oblasti medicine koristeći PCR. Danas je PCR analiza i dalje najrasprostranjenija i najdinamičnija tehnologija u razvoju. Svake godine se na tržištu pojavljuju desetine novih test sistema za PCR analizu, dizajniranih kako za identifikaciju nukleotidnih sekvenci različitih mikroorganizama koji uzrokuju bolesti, tako i za proučavanje ljudskih gena. Troškovi PCR analize stalno opadaju, što doprinosi sve široj upotrebi metode u medicinskim i dijagnostičkim ustanovama. Broj PCR laboratorija u zemljama ZND eksponencijalno raste i, po svemu sudeći, u bliskoj budućnosti PCR analiza će postati jedna od najčešćih laboratorijskih dijagnostičkih metoda.

1. PRINCIP PCR METODE

Lančana reakcija polimerazom je metoda koja oponaša prirodnu replikaciju DNK i omogućava detekciju jednog specifičnog molekula DNK u prisustvu miliona drugih molekula.

Suština metode je u stalnom kopiranju (amplificiranju) određenih dijelova DNK u epruveti tokom ponovljenih temperaturnih ciklusa. U svakom ciklusu amplifikacije, prethodno sintetisani fragmenti se ponovo kopiraju pomoću DNK polimeraze. Zbog toga dolazi do višestrukog povećanja broja specifičnih fragmenata DNK, što uvelike pojednostavljuje dalju analizu.

PCR metoda se zasniva na prirodnom procesu - komplementarnom dovršavanju DNK matriksa, koji se provodi pomoću enzima DNK polimeraze. Ova reakcija se naziva replikacija DNK.

Prirodna replikacija DNK uključuje nekoliko faza:

) denaturacija DNK (odmotavanje dvostruke spirale, divergencija lanaca DNK);

) Formiranje kratkih dvolančanih DNK sekcija (prajmeri neophodni za iniciranje sinteze DNK);

) Sinteza novog lanca DNK (komplementarni završetak oba lanca).

Ovaj proces se može koristiti za proizvodnju kopija kratkih dijelova DNK koji su specifični za specifične mikroorganizme, tj. vršiti ciljanu potragu za takvim specifičnim područjima, što je cilj genske dijagnostike za identifikaciju uzročnika zaraznih bolesti.

Otkriće termostabilne DNK polimeraze (Taq polimeraze) iz termofilnih bakterija Thermisaquaticus, čiji je optimum u području od 70-72°C, omogućio je da se proces replikacije DNK učini cikličnim i koristi za rad in vitro. Stvaranjem programabilnih termostata (pojačavača), koji vrše ciklične promjene temperature prema zadatom programu, stvoreni su preduslovi za široko uvođenje PCR metode u praksu laboratorijske kliničke dijagnostike. Višestrukim ponavljanjem ciklusa sinteze dolazi do eksponencijalnog povećanja broja kopija određenog fragmenta DNK, što omogućava da se dobije dovoljan broj kopija DNK za njihovu identifikaciju iz male količine analiziranog materijala, koji može sadržavati pojedinačne ćelije. mikroorganizama.

Komplementarni završetak lanca ne počinje ni u jednoj tački u DNK sekvenci, već samo u određenim početnim blokovima - kratkim dvolančanim dijelovima. Pričvršćivanjem takvih blokova na određene dijelove DNK, moguće je usmjeriti proces sinteze novog lanca samo u ovoj dionici, a ne cijelom dužinom lanca DNK. Za stvaranje početnih blokova u datim dijelovima DNK, koriste se dva oligonukleotidna prajmera (20 nukleotidnih parova), nazvana prajmeri. Prajmeri su komplementarni DNK sekvencama na lijevoj i desnoj granici određenog fragmenta i orijentirani su na takav način da se završetak novog lanca DNK događa samo između njih.

Dakle, PCR je višestruko povećanje broja kopija (amplifikacija) specifične regije DNK katalizirano enzimom DNK polimerazom.

. FAZE PCR ANALIZE

Metoda analize pomoću PCR metode uključuje tri faze:

1. Izolacija DNK (RNA) iz kliničkog uzorka;

2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNK;

. Detekcija produkata pojačanja.

. Izolacija DNK (RNA).

U ovoj fazi analize klinički uzorak se podvrgava posebnoj obradi, kao rezultat toga se lizira ćelijski materijal, uklanjaju proteinske i polisaharidne frakcije i dobija se rastvor DNK ili RNK, bez inhibitora i spreman za dalje pojačanje. Izbor tehnike ekstrakcije DNK (RNA) uglavnom je određen prirodom kliničkog materijala koji se obrađuje.

2. Amplifikacija specifičnih fragmenata DNK

U ovoj fazi, kratki specifični DNK fragmenti se akumuliraju u količini potrebnoj za njihovo dalje otkrivanje.

Da bi se izvela lančana reakcija polimeraze, u reakcijskoj smjesi mora biti prisutan niz komponenti:

· Prajmeri- umjetno sintetizirani oligonukleotidi, obično veličine od 15 do 30 bp, identični odgovarajućim dijelovima ciljne DNK. Oni igraju ključnu ulogu u formiranju produkata reakcije amplifikacije. Pravilno odabrani prajmeri osiguravaju specifičnost i osjetljivost test sistema.

· Taq polimeraza- termostabilni enzim koji osigurava završetak 3 - kraj drugog lanca DNK po principu komplementarnosti.

· Smjesa deoksinukleotid trifosfata (dNTP)- deoksiadenozin trifosfat (dATP), deoksiguanozin trifosfat (dGTP), deoksicitozin trifosfat (dCTP) i deoksitimidin trifosfat (dTTP) - "građevinski materijal" koji koristi Taq polimeraza za sintezu drugog lanca DNK.

· tampon -mješavina katjona i anjona u određenoj koncentraciji, koja osigurava optimalne uslove za reakciju, kao i stabilnu pH vrijednost.

· Analizirani uzorak- preparat pripremljen za dodavanje u reakcionu smjesu, koji može sadržavati željenu DNK, na primjer, DNK mikroorganizama, koja služi kao meta za naknadno ponovljeno kopiranje.

Slika 1. Komponente reakcione smjese

Svaki ciklus pojačanja uključuje 3 faze koje se javljaju u različitim temperaturnim uslovima:

1. faza:Denaturacija DNK (rasplet dvostruke spirale). Javlja se na 93-95°C u trajanju od 30-40 sekundi.

Jedno od kola (+) se koristi kao glavna matrica. Njegovih pet krajeva fiksira enzim DNK polimeraza, koji osigurava izgradnju drugog lanca DNK, komplementarnog prvom, od pojedinačnih nukleotida. Ista stvar, samo u suprotnom smjeru, događa se i na drugom lancu DNK, međutim, budući da se odvijanje molekule DNK odvija obrnutim redoslijedom, novi lanac se gradi u malim fragmentima, koji se zatim spajaju. Da bi enzim DNK polimeraze započeo svoj rad, potrebno je prisustvo sjemena ili prajmera - malog jednolančanog DNK fragmenta, koji, kada je povezan s komplementarnom regijom jednog od roditeljskih lanaca DNK, formira početni blok. za uzgoj ćerke.

2. faza:Pričvršćivanje prajmera (žarenje). Vezivanje prajmera se dešava komplementarno odgovarajućim sekvencama na suprotnim lancima DNK na granicama specifičnog regiona. Svaki par prajmera ima svoju temperaturu žarenja, čije su vrijednosti u rasponu od 50-65°C. Precizno izračunata i eksperimentalno verifikovana temperatura žarenja prajmera je jedna od karakteristika koja određuje specifičnost reakcije, isključujući vezivanje prajmera za nepotpuno komplementarne sekvence.

Pošto se rast ćerki DNK lanca može desiti istovremeno na oba lanca DNK majke, DNK polimeraza na drugom lancu takođe zahteva sopstveni prajmer. Tako se u reakcionu smjesu dodaju dva prajmera. Zapravo, prajmeri, koji su vezani za suprotne niti molekule DNK, ograničavaju njen dio koji će se kasnije umnožavati ili umnožavati mnogo puta. Takvi fragmenti DNK nazivaju se amplikoni. Dužina amplikona može biti nekoliko stotina nukleotida. Promjenom para prajmera možemo prijeći s analize jednog patogena na analizu drugog.

Vrijeme žarenja -20-60 sec.

Faza 3:Završetak DNK lanaca (elongacija).

Mehanizam kopiranja je takav da komplementarno dodavanje lanaca ne može započeti ni u jednom trenutku u sekvenci DNK, već samo u određenim početnim blokovima (kratki dvolančani dijelovi). Za stvaranje početnih blokova u datim dijelovima DNK koriste se prajmeri, koji su oligonukleotidi dužine oko 20 bp, koji se također nazivaju prajmeri. Oni su komplementarni DNK sekvencama na lijevoj i desnoj granici određenog fragmenta i orijentirani su tako da se sinteza DNK koju provodi DNK polimeraza odvija samo između njih.

Komplementarno dovršavanje DNK lanaca ide od 5'-kraja do 3'-kraja lanca u suprotnim smjerovima, počevši od mjesta vezivanja prajmera. Materijal za sintezu novih DNK lanaca je uvedeni deoksiribonukleotid fosfat. Ovaj proces katalizira enzim Tag polimeraza. Nova DNK nastala u prvom ciklusu sinteze služi kao polazni materijal za drugi ciklus, u kojem se formira željeni specifični DNK fragment (amplikon) itd.

Slika 2 Princip amplifikacije DNK

Trenutno se koristi nekoliko metoda za pripremu uzorka za PCR. Postupak pripreme uzorka uključuje mikrobnu lizu i ekstrakciju nukleinske kiseline. Da bi se uništila mikrobna stanica, koristi se jednostavno kuhanje, zamrzavanje-odmrzavanje u prisustvu lizozima, kao i posebni puferi za lizu koji sadrže deterdžente i proteinazu. Izbor metode obično je diktiran prirodom mikroba, tačnije, prirodom njegovog ćelijskog zida. Metoda za dobivanje čistog DNK preparata, koju je opisao B.R. Marmionetal, smatra se standardnom i već je postala klasična. (1993). Uključuje enzimsku proteolizu praćenu deproteinizacijom i precipitacijom DNK alkoholom. Ova metoda vam omogućuje da dobijete čistu DNK pripremu, ali je prilično radno intenzivna i uključuje rad s takvim agresivnim tvarima jakog mirisa kao što su fenol i kloroform.

Jedna od najpopularnijih je metoda ekstrakcije DNK koju je predložio R.Boometal. (1990), na osnovu upotrebe jakog sredstva za lizu - gvanidin tiocijanata (GuSCN) za lizu ćelija i naknadnu sorpciju DNK na nosaču (staklene perle, dijatomejska zemlja, stakleno „mlijeko“ itd.). Nakon ispiranja, DNK ostaje u uzorku, sorbiran na nosaču, iz kojeg se lako uklanja pomoću pufera za eluiranje. Metoda je zgodna, tehnološki napredna i pogodna za pripremu uzorka za amplifikaciju. Međutim, gubitak DNK je moguć zbog ireverzibilne sorpcije na nosaču, kao i tokom brojnih pranja. Ovo je posebno važno kada se radi sa malim količinama DNK u uzorku. Osim toga, čak i količine GuSCN-a u tragovima mogu inhibirati PCR, tako da je pri korištenju ove metode vrlo važan pravilan izbor sorbenta i pažljivo pridržavanje tehnoloških nijansi. Treba napomenuti da je zbog velikog broja koraka dodavanja i uklanjanja otopina potrebna pažnja pri rukovanju uzorkom, jer je moguća unakrsna kontaminacija između uzoraka i rezultirajućeg DNK aerosola.

Klasičnom procedurom fenol-hloroformske ekstrakcije DNK postiže se dobro prečišćavanje DNK, prvenstveno od inhibitora Tag polimeraze, ali su neizbježni veliki gubici nukleinske kiseline, posebno uočljivi pri radu sa malim uzorcima sa niskom koncentracijom infektivnog agensa.

Druga grupa metoda pripreme uzoraka bazira se na upotrebi ionskih izmjenjivača kao što je Chilex (SAD), koji, za razliku od stakla, sorbiraju ne DNK, već nečistoće koje ometaju reakciju. U pravilu, ova tehnologija uključuje dvije faze: ključanje uzorka i sorpciju nečistoća na ionskom izmjenjivaču. Metoda je izuzetno atraktivna zbog svoje jednostavnosti izvođenja. U većini slučajeva pogodan je za rad sa kliničkim materijalom. Nažalost, ponekad postoje uzorci s nečistoćama koje se ne mogu ukloniti pomoću ionskih izmjenjivača. Osim toga, neki mikroorganizmi se ne mogu uništiti jednostavnim kuhanjem. U ovim slučajevima potrebno je uvesti dodatne faze obrade uzorka.

Prilikom masovnog skrininga, kada je važno dobiti statističke podatke, moguće je koristiti jednostavne metode pomoću deterdženata ili tretiranja biološkog materijala alkalijama i potom ih neutralizirati. Istovremeno, korištenje ovakvih metoda za kliničku dijagnostiku može dovesti do lažno negativnih rezultata zbog upotrebe nekvalitetnog DNK preparata u reakcijskoj smjesi. Stoga, izbor metode pripreme uzorka treba uzeti u obzir uz razumijevanje svrhe namjeravane analize.

Prilikom sljedeće procedure – amplifikacije – uzorak koji sadrži DNK patogena unosi se u malu epruvetu sa komponentama koje osiguravaju reakciju polimeraze, dvije vrste prajmera, dva enzima (Tag polimeraza i N-uracil glikolaza) i četiri vrste nukleotid A, G, Ts, U. Za izvođenje reakcije polimeraze koristi se poseban uređaj (termalni ciklus ili DNK amplifier), koji vam omogućava da automatski mijenjate temperaturu reakcione smjese prema određenom programu. U prvom krugu PCR-a, uzorak se zagrijava na temperaturu od 94°C kako bi se odvojila dva komplementarna DNK lanca. Temperatura tada pada na 40-60°C, pri čemu se prajmeri pričvršćuju za jedan lanac DNK, nakon čega temperatura ponovo raste na 72°C, kada je aktivnost polimeraze najizraženija. Cijeli ciklus sa promjenama temperature traje manje od 3 minute.

Za ispravnu procjenu rezultata PCR-a, važno je razumjeti da ova metoda nije kvantitativna. Teoretski, proizvodi amplifikacije pojedinačnih ciljnih molekula DNK mogu se detektovati elektroforezom nakon 30-35 ciklusa. Međutim, u praksi se to radi samo u slučajevima kada se reakcija odvija u uslovima bliskim idealnim, što je retkost. Posebno veliki uticaj na efikasnost amplifikacije ima stepen čistoće DNK preparata, tj. prisutnost u reakcijskoj smjesi određenih inhibitora, kojih se u nekim slučajevima može biti izuzetno teško riješiti. Ponekad, zbog njihovog prisustva, čak i desetine hiljada ciljnih molekula DNK ne mogu se umnožiti. Stoga često ne postoji direktna veza između početne količine ciljne DNK i konačne količine produkata amplifikacije.

Za vizualizaciju rezultata amplifikacije koriste se različite metode. Danas je najčešća elektroforeza, zasnovana na razdvajanju molekula DNK po veličini. Da biste to učinili, pripremite ploču agaroznog gela, koja je očvrsnuta agarozom nakon topljenja u puferu za elektroforezu u koncentraciji od 1,5-2,5% uz dodatak posebne DNK boje, na primjer etidijum bromida. Učvršćena agaroza formira prostornu rešetku. Prilikom izlijevanja pomoću češljeva, u gelu se formiraju posebne jažice u koje se naknadno dodaju proizvodi za pojačavanje. Gel ploča se postavlja u horizontalni aparat za gel elektroforezu i priključuje se izvor konstantnog napona. Negativno nabijena DNK počinje da se kreće u gelu od minusa do plusa. U ovom slučaju, kraći molekuli DNK kreću se brže od dužih. Na brzinu kretanja DNK u gelu utiču koncentracija agaroze, jačina električnog polja, temperatura, sastav pufera za elektroforezu i, u manjoj meri, sastav DNK. Svi molekuli iste veličine kreću se istom brzinom. Boja je ugrađena (interkalirana) planarnim grupama u molekule DNK. Nakon završene elektroforeze, koja traje od 10 minuta do 1 sat, gel se postavlja na transiluminator filter koji emituje svjetlost u ultraljubičastom opsegu (254 - 310 nm). Ultraljubičasta energija koju apsorbuje DNK na 260 nm prenosi se na boju, uzrokujući da ona fluorescira u narandžasto-crvenoj oblasti vidljivog spektra (590 nm).

DNK standard željenog mikroorganizma koristi se kao “pozitivna kontrola”. Veličina nespecifičnih amplikona može biti ili veća ili manja u odnosu na “pozitivnu kontrolu”. U najgorem slučaju, ove veličine se mogu poklapati i čitaju se kao pozitivne u elektroforezi.

“Pozitivna kontrola” vam omogućava da osigurate da sve komponente uključene u reakcijsku smjesu osiguravaju normalan napredak reakcije. Istovremeno, DNK preparat pripremljen za PCR iz biološkog materijala može sadržavati nečistoće inhibitora, koje značajno smanjuju efikasnost reakcije, au nekim slučajevima dovode do odsustva specifičnih amplikona čak iu prisustvu željenog patogena. Potrebno je pratiti napredak amplifikacije u svakoj epruveti sa reakcionom smjesom, za šta se koristi dodatna tzv. „interna kontrola“, a to je bilo koji DNK standard koji je različit od DNK željenog mikroorganizma.

Za infektivne testne sisteme ponekad se koristi, na primjer, p-globin gen, na čije krajeve se, pomoću manipulacija genetskog inženjeringa, prišivaju dijelovi DNK koji su homologni prajmerima uključenim u test sistem. Ako se u reakcionu smjesu doda „unutrašnja kontrola“, ona će postati ista meta za žarenje prajmera kao hromozomska DNK željenog infektivnog agensa. Veličina internog kontrolnog amplifikacionog proizvoda odabrana je tako da bude 2 ili više puta veća od amplikona nastalih umnožavanjem DNK željenog mikroorganizma. Kao rezultat toga, ako se u reakcionu smjesu uz test uzorak doda DNK „unutrašnje kontrole“, tada će, bez obzira na prisustvo mikroorganizma u biološkom uzorku, „unutrašnja kontrola“ uzrokovati stvaranje specifičnih amplikona, ali znatno duži (teži) od amplikona mikroorganizma. Prisustvo teških amplikona u reakcijskoj smjesi ukazuje na normalan napredak reakcije amplifikacije i odsustvo inhibitora. Ukoliko se ne formiraju amplikoni potrebne veličine i „interne kontrole“, možemo zaključiti da u analiziranom uzorku postoje nepoželjne nečistoće koje treba eliminisati, ali ne i o odsustvu željene DNK.

Uprkos svoj atraktivnosti ovog pristupa, on ima značajnu manu. Dakle, ako je željena DNK prisutna u reakcionoj smjesi, tada se efikasnost njenog umnožavanja naglo smanjuje zbog konkurencije s "unutrašnjom kontrolom" za prajmere. Ovo je fundamentalno važno pri niskim koncentracijama DNK u uzorku testa i može dovesti do lažno negativnih rezultata. Ipak, pod uslovom da se reši problem konkurencije za prajmere, ova metoda praćenja efikasnosti amplifikacije će svakako biti veoma korisna.

Slika 3 Drugi ciklus amplifikacije DNK

. Detekcija produkata pojačanja

). Metoda horizontalne elektroforeze

Jedna od metoda za vizualizaciju rezultata amplifikacije je metoda elektroforeze, zasnovana na razdvajanju molekula DNK po veličini. U većini metoda, u ovoj fazi, mješavina produkata amplifikacije dobivena u 2. fazi se odvaja horizontalnom elektroforezom u agaroznom gelu. Prije elektroforetskog odvajanja, u mješavinu za amplifikaciju dodaje se otopina etidijum bromida, koja formira jaka intersticijska jedinjenja sa dvolančanim DNK fragmentima. Ova jedinjenja su sposobna da fluoresciraju pod UV zračenjem, što se beleži u obliku svetlećih traka nakon elektroforetskog odvajanja mešavine amplifikacije u agaroznom gelu. Svjetlina traka proizvoda za pojačanje može varirati. Stoga je u PCR laboratorijama često uobičajeno da se rezultat procjenjuje pomoću sistema od tri, četiri ili pet tačaka. Međutim, ne može se povezati s početnom količinom ciljne DNK u uzorku. Često je smanjenje svjetline traka povezano sa smanjenjem efikasnosti amplifikacije pod utjecajem inhibitora ili drugih faktora.

Slika 4. Detekcija produkata amplifikacije horizontalnom elektroforezom

). Metoda vertikalne elektroforeze

Metoda vertikalne elektroforeze u osnovi je slična horizontalnoj elektroforezi. Njihova razlika je u tome što se u ovom slučaju umjesto agaroze koristi poliakrilamid. Izvodi se u posebnoj komori za vertikalnu elektroforezu. Elektroforeza na poliakrilamidnom gelu ima veću rezoluciju u odnosu na elektroforezu agaroze i omogućava razlikovanje molekula DNK različitih veličina sa tačnošću od jednog nukleotida. Priprema poliakrilamidnog gela je nešto složenija od agaroznog gela. Osim toga, akrilamid je toksična supstanca. Budući da se rijetko javlja potreba za određivanjem veličine proizvoda amplifikacije s točnošću od 1 nukleotida, ova metoda se ne koristi u rutinskom radu.

3). Metoda hibridizacijske sonde

Kao alternativa metodi elektroforetske detekcije, koja ima neke nedostatke: subjektivnost u očitavanju rezultata, ograničenja u određivanju DNK različitih mikroorganizama u jednoj reakciji, mogu se predložiti šeme hibridizacijske detekcije. U ovim shemama, fragment DNK formiran kao rezultat amplifikacije hibridizira (formira dvolančane komplekse - "hibride") sa specifičnom oligonukleotidnom sondom. Registracija takvih kompleksa može se izvršiti kolorimetrijski ili fluorimetrijski.

3. PCR METODA U REALNOM VREMENU (PCR u realnom vremenu)

PCR metoda u realnom vremenu omogućava otkrivanje produkata amplifikacije tokom reakcije i praćenje kinetike akumulacije amplikona. Za detekciju PCR proizvoda koriste se fluorescentne boje koje daju fluorescenciju direktno proporcionalnu količini PCR proizvoda - reporter fluorescencije. Mehanizmi za njegovo stvaranje variraju u zavisnosti od specifičnog tipa PCR u realnom vremenu.

Kinetička kriva u koordinatama “Nivo reporterske fluorescencije - ciklus pojačanja” ima S-oblik.

Može se podijeliti u tri faze:

1.Faza inicijacije (kada PCR proizvodi još nisu otkriveni fluorescentnom oznakom).

2.Eksponencijalna faza (u kojoj postoji eksponencijalna zavisnost količine fluorescencije o PCR ciklusu).

.Plato (faza zasićenja).

Slika 5 Grafikon kinetičke krive fluorescencije korišćenjem PCR u realnom vremenu

Registracija fluorescentnog signala se vrši tokom procesa amplifikacije na posebnom uređaju – termičkom ciklusu za PCR u realnom vremenu. Na osnovu povećanja intenziteta fluorescentnog signala, izračunava se koncentracija početnog DNK šablona pomoću softvera isporučenog uz pojačalo.

Prednosti PCR metode u realnom vremenu

n sposobnost detekcije akumulacije produkata amplifikacije direktno tokom amplifikacije;

n osnovna prednost je mogućnost detekcije nakupljanja amplikona bez otvaranja epruvete, što minimizira rizik od lažno pozitivnih rezultata zbog kontaminacije uzoraka i reagensa produktima amplifikacije;

n značajno smanjenje broja manipulacija testnim uzorkom skraćuje vrijeme, pojednostavljuje analizu i smanjuje vjerojatnost grešaka;

n Ovaj pristup omogućava eliminaciju faze elektroforeze, što dovodi do oštrog smanjenja vjerojatnosti kontaminacije ispitnih uzoraka produktima amplifikacije;

n smanjenje zahtjeva za PCR laboratorije;

n povećanje objektivnosti interpretacije rezultata PCR studije, budući da se obrada provodi pomoću softvera uređaja;

n Ukupno vreme istraživanja je značajno, skoro prepolovljeno, što omogućava da se rezultati dobiju u roku od 1,5 - 2 sata nakon što klinički materijal stigne u laboratoriju;

n Ova metoda omogućava po prvi put kvantifikaciju sadržaja DNK mikroorganizma u kliničkom uzorku;

n upotreba hibridizacionih sondi zajedno sa prajmerima povećava specifičnost analize;

n mogućnost nezavisne simultane registracije fluorescentnog signala iz nekoliko hibridizacionih DNK sondi omogućava identifikaciju u jednoj studiji nekoliko različitih regiona iste ili različite DNK mete.

. PREDNOSTI PCR METODE

n Direktna identifikacija uzročnika zaraznih bolesti

PCR metoda daje direktnu indikaciju prisutnosti specifičnog fragmenta DNK patogena u materijalu uzetom od pacijenta.

n Visoka specifičnost PCR-a

PCR metodom u materijalu koji se proučava izoluje se fragment DNK koji je jedinstven za određeni patogen - bakteriju ili virus. Ovaj dio DNK je jedinstven i nije tipičan za bilo koju infekciju na zemlji. Specifičnost je određena nukleotidnom sekvencom prajmera, što eliminiše mogućnost dobijanja lažnih rezultata, za razliku od metode enzimskog imunosorbentnog testa, gde su greške usled unakrsne reakcije antigena česte.

n PCR visoke osjetljivosti

PCR metoda vam omogućava da otkrijete čak i pojedinačne ćelije bakterija ili virusa. PCR dijagnostika otkriva prisustvo uzročnika zaraznih bolesti u slučajevima kada to nije moguće uraditi drugim metodama (imunološkim, bakteriološkim, mikroskopskim). Osetljivost PCR analize je 10-1000 ćelija po uzorku (osetljivost imunoloških i mikroskopskih testova je 103-105 ćelija).

n Svestranost PCR-a

Budući da se patogen može nalaziti u bilo kojem biološkom sekretu i tkivu, PCR istraživanje može koristiti gotovo sve materijale, uključujući i one nepristupačne za istraživanje drugim metodama - sluz, urin, krv, serum, sputum, ejakulat, struganje epitelnih stanica.

n Velika brzina dobijanja rezultata PCR analize

PCR analiza ne zahtijeva izolaciju i uzgoj kulture patogena, što zahtijeva dosta vremena. Jedinstvena metoda za obradu biomaterijala i detekciju produkta reakcije, kao i automatizacija procesa amplifikacije omogućavaju provođenje kompletne analize za 4-4,5 sata.

n Sposobnost dijagnosticiranja bilo koje vrste infekcije

Visoka osjetljivost PCR metode omogućava dijagnosticiranje infekcije ne samo u akutnoj fazi bolesti, već i kroničnih infekcija, pa čak i prisutnosti pojedinačnih bakterija ili virusa.

Trenutno je prednost PCR analize u odnosu na kulturološki metod za otkrivanje mikroorganizama u sljedećem:

Veća učestalost detekcije mikroba, koja premašuje isti indikator pri korištenju metode kulture za 6-7%. Ove razlike se objašnjavaju mogućom smrću mikroba tokom skladištenja i transporta, dok je PCR sposoban da otkrije neodržive oblike mikroorganizma.

Vrijeme potrebno za otkrivanje patogena metodom kulture je oko 4 dana, dok upotreba PCR-a omogućava detekciju mikroba za 4-5 sati.

Upotreba PCR tehnologije omogućava otkrivanje patogena, kao što je klamidija, u uzorcima uzetim neinvazivno, kao što je urin.

PCR metoda je posebno efikasna za dijagnosticiranje teško kultiviranih, nekulturnih i perzistentnih oblika mikroorganizama, koji se često susreću kod latentnih i kroničnih infekcija, jer se ovom metodom izbjegavaju poteškoće vezane za uzgoj takvih mikroorganizama u laboratorijskim uslovima.

n Mogućnost izvođenja praćenje i evaluacija efikasnosti terapije, posebno kod virusnih bolesti.

n Mogućnost detekcije pojedinačni podtipovi i sojevi virusa i bakterija.

n Mogućnost definicije nekoliko vrsta patogena (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) iz jedne epruvete sa biološkim materijalom.

Ova metoda je po intenzitetu rada uporediva sa klasičnim metodama (enzimski imunoesej, imunofluorescencija, itd.), ali daje pouzdanije dijagnostičke informacije, omogućavajući direktnu detekciju DNK ili RNK infektivnog agensa u kliničkom materijalu. Stoga je PCR metoda, zajedno s metodom kulture, prepoznata kao „zlatni standard“ za dijagnosticiranje zaraznih bolesti.

5. OGRANIČENJA PCR METODE

· Tokom reakcije, DNK živih i mrtvih mikroorganizama se pojačava

· Mogućnost unakrsne reakcije

Izbor prajmera zasniva se na postojećim saznanjima o genomu datog i sličnih mikroorganizama. Teoretski, postoji mogućnost da je isti fragment prisutan i u drugim mikroorganizmima čiji genom trenutno nije dešifrovan i koji nisu testirani na mogućnost unakrsne reakcije. Prisustvo takvih mikroorganizama u uzorku može dovesti do lažno pozitivnog rezultata testa.

· Varijabilnost mikroorganizama

Iako se pri konstruisanju testnog sistema fragment genoma koji se koristi za amplifikaciju bira iz visoko očuvane regije, varijabilnost mikroorganizama može dovesti do činjenice da neki genotipovi ili sojevi patogena koji se proučavaju mogu dobiti mutacije u amplificiranom području genoma. , i tako postaju nedostižni za ovaj test -sistem.

Posljednje dvije tačke su važne za programere PCR dijagnostičkih kompleta. Sada su razvijeni standardi koji regulišu količinu testiranja (uključujući testiranje na unakrsne reakcije, kao i testiranje poznatih sojeva patogena koji se otkriva) kojima testni sistem mora proći prije nego što stigne na tržište.

6. PRIMJENA PCR METODE

polimerazna dijagnostika infektivnih bolesti

PCR se koristi u mnogim područjima za analize i naučne eksperimente:

1. forenzika

PCR se koristi za poređenje takozvanih "genetskih otisaka prstiju". Neophodan je uzorak genetskog materijala sa mesta zločina - krv, pljuvačka, sperma, kosa itd. Ovo se poredi sa genetskim materijalom osumnjičenog. Dovoljna je vrlo mala količina DNK, teoretski jedna kopija. DNK se razbija na fragmente, a zatim umnožava pomoću PCR-a. Fragmenti se odvajaju pomoću DNK elektroforeze. Rezultirajući obrazac rasporeda DNK traka naziva se genetski otisak prsta.

2. utvrđivanje očinstva

Analizom rezultata elektroforeze DNK fragmenata amplificiranih PCR-om otac-dijete-majka, otkriveno je da će dijete naslijediti neke karakteristike genetskog otiska oba roditelja, što daje jedinstveni otisak. Iako su genetski otisci prstiju jedinstveni (osim u slučaju jednojajčanih blizanaca), porodični odnosi se ipak mogu uspostaviti uzimanjem nekoliko otisaka prstiju. Ista metoda se može primijeniti, malo modificirana, da se uspostavi evolucijska srodnost među organizmima.

3. medicinska dijagnostika

PCR omogućava značajno ubrzanje i olakšavanje dijagnoze nasljednih i virusnih bolesti. Gen od interesa je amplificiran PCR-om koristeći odgovarajuće prajmere, a zatim sekvenciran da bi se identificirale mutacije. Virusne infekcije mogu se otkriti odmah nakon infekcije, nekoliko sedmica ili mjeseci prije pojave simptoma.

4. kloniranje gena

Kloniranje gena je proces izolacije gena i, kao rezultat manipulacija genetskim inženjeringom, dobivanje velike količine proizvoda datog gena. PCR se koristi za amplificiranje gena, koji se zatim ubacuje u vektor - dio DNK koji prenosi strani gen u isti ili drugi organizam pogodan za uzgoj. Na primjer, plazmidi ili virusna DNK se koriste kao vektori. Umetanje gena u strani organizam obično se koristi za proizvodnju proizvoda tog gena - RNK ili, najčešće, proteina. Na ovaj način se dobijaju mnogi proteini u industrijskim količinama za upotrebu u poljoprivredi, medicini itd.

5. DNK sekvenciranje

U metodi sekvenciranja pomoću dideoksinukleotida označenih fluorescentnom oznakom ili radioaktivnim izotopom, PCR je sastavni dio, jer se tokom polimerizacije derivati ​​nukleotida označenih fluorescentnom ili radioaktivnom oznakom ubacuju u lanac DNK. Ovo zaustavlja reakciju, omogućavajući određivanje položaja specifičnih nukleotida nakon što se sintetizirani lanci razdvoje u gelu.

6. mutageneza

Trenutno je PCR postao glavna metoda za provođenje mutageneze (izmjena nukleotidne sekvence DNK). Upotreba PCR-a omogućila je pojednostavljenje i ubrzanje postupka mutageneze, kao i njegovu pouzdanost i reproduktivnost.

7. dijagnostika zaraznih bolesti

Upotreba PCR metode za dijagnosticiranje zaraznih bolesti kako bakterijske tako i virusne prirode je od ogromnog značaja za rješavanje mnogih problema mikrobiologije i epidemiologije. Upotreba ove metode doprinosi i razvoju osnovnih istraživanja u oblasti proučavanja hroničnih i slabo poznatih zaraznih bolesti.

8. dijagnostika virusnih bolesti

Najsveobuhvatnije prednosti PCR-a u dijagnosticiranju virusnih bolesti mogu se pokazati razmatranjem infektivnog procesa uzrokovanog virusom hepatitisa C (HCV). PCR je od posebne dijagnostičke vrijednosti za otkrivanje ovog virusa iz sljedećih razloga:

) nedostatak metode za uzgoj HCV; 2) kompleti za dijagnostiku antigena ne postoje; 3) reakcija stvaranja antitela na HCV je toliko spora da se dijagnoza u akutnoj fazi infekcije, po pravilu, ne može postaviti.

Stoga je primjena PCR tehnologije za dijagnostiku, kontrolu kvaliteta liječenja i epidemiološke analize morbiditeta uzrokovanog HCV-om danas opšte prihvaćena.

Istovremeno, samo PCR tehnologija omogućava rešavanje sledećih problema: 1) dijagnostikovanje akutne infekcije sa kasnim otkrivanjem antitela na HCV; 2) vrši etiološku dijagnostiku hroničnog hepatitisa C kod imunosupresivnih pacijenata; 3) proceni efikasnost antivirusne terapije; 4) otkrivanje viremije kod davalaca krvi sa normalnim nivoom aminotransferaza; 5) utvrdi moguću kontaminaciju krvnih proizvoda; 6) procijeniti prevalenciju HCV-a.

9. primjena PCR-a u pulmologiji i ftiziologiji

Uobičajeni uzrok atipične pneumonije i rekurentnog kroničnog bronhitisa su mikoplazme i klamidija. Dijagnoza ovih patogena tradicionalnim metodama mikroskopije i bakterijske kulture je neučinkovita. PCR omogućava ne samo dijagnosticiranje klamidije i mikoplazmoze, već i identifikaciju vrste patogena (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Upotreba PCR metode može značajno poboljšati ranu dijagnozu tuberkuloze. Trenutno su razvijeni i pojavili se na tržištu PCR setovi za određivanje rezistencije mikobakterija na antibiotike.

10. Primjena PCR-a u praksi krvnih službi

Ispitivanje donorske krvi na hepatitis, sifilis, HIV serološkim metodama ne isključuje opasnost od upotrebe inficirane krvi zbog prisustva određenog seronegativnog perioda za ove bolesti, koji može trajati i do nekoliko sedmica od trenutka pojave patogena u organizmu. krv. Najefikasnija metoda testiranja krvi na prisustvo ovih patogena je PCR metoda.

11. primjena PCR-a u neonatologiji

Brojni mikroorganizmi mogu zaraziti fetus tokom trudnoće. To su citomegalovirus, toksoplazma, herpes virus, virus rubeole, mikoplazma, klamidija itd. Upotreba seroloških testova za utvrđivanje ovih infekcija kod novorođenčadi je neefikasna, budući da se formiranje imunološkog sistema djeteta odvija tokom nekoliko mjeseci, a prisustvo uzročnik infekcije ne može biti praćen proizvodnjom specifičnih antitijela. S druge strane, majčina antitijela klase IgG mogu biti prisutna u krvi novorođenčeta dugo vremena, sposobna prodrijeti kroz placentnu barijeru. Dakle, prisustvo specifičnih IgG kod djeteta u prvim mjesecima života ne ukazuje na prisustvo patogena. Upotreba PCR analize značajno povećava mogućnosti dijagnosticiranja neonatalnih infekcija, uključujući i intrauterinu fazu.

12. primjena PCR-a u uroginekološkoj praksi

Među infektivnim uzročnicima koji zahvaćaju urogenitalni trakt, u posljednje vrijeme se velika pažnja poklanja uzročnicima latentnih i kroničnih infekcija - klamidiji i mikoplazmi. Bolesti uzrokovane ovim uzročnicima karakteriziraju zamagljeni klinički simptomi i kronični tok, koji često dovodi do oštećenja reproduktivnih funkcija – pobačaja, neplodnosti. Brojne studije koje su ispitivale upotrebu PCR metode za otkrivanje Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, sprovedene u velikim klinikama u različitim zemljama, pokazale su visoku efikasnost ove metode. Prepoznato je da je u smislu osjetljivosti i efikasnosti PCR superioran u odnosu na metodu kulture, prihvaćenu kao „zlatni standard“.

ZAKLJUČAK

Dakle, PCR tehnologija je moćan alat koji pruža mogućnost proučavanja i dijagnosticiranja kroničnih infektivnih procesa i ekologije patogena zaraznih bolesti. PCR dijagnostička metoda dopunjuje postojeće metode mikrobiološke dijagnostike i kvalitativno mijenja metodologiju rješavanja primijenjenih problema medicinske mikrobiologije i epidemiologije.

Uzimajući u obzir gore navedeno, formulisaćemo oblasti istraživanja infektivne patologije, u kojima PCR počinje da igra vodeću ulogu.

Dijagnoza kroničnih infektivnih stanja uzrokovanih perzistencijom bakterija ili virusa. Ovo je najočitija primjena PCR-a u dijagnostičke svrhe.

PCR je najefikasnija metoda za identifikaciju i proučavanje patogena koji, u "nekultivisanom" stanju, mogu tamo opstati, preživljavajući nepovoljne vanjske uslove.

PCR omogućava određivanje rezistencije na antibiotike kod spororastućih i teško kultiviranih bakterija.

Obećavajuća područja za praktičnu upotrebu PCR dijagnostike su:

· dijagnostika onkoloških bolesti;

· dijagnoza leukemije i limfoma;

· dijagnoza raka dojke;

· dijagnostika drugih malignih bolesti;

DNK dijagnostika benignih i malignih neoplazmi ograničena je malom, ali rastućom količinom informacija o genima povezanim s ovim bolestima;

· dijagnostika genetskih bolesti.

Dijagnoza genetskih bolesti može se razviti samo nakon opsežnog naučnog istraživanja ljudskog genoma. Međutim, medicinska zajednica je već prepoznala važnost proučavanja genetske osnove bolesti, kao i mogućnosti dijagnosticiranja i liječenja bolesti prije nego se pojave simptomi;

· lična identifikacija: sudska medicina, kriminologija; transplantacija organa i tkiva; utvrđivanje očinstva. Stručnjaci ocjenjuju ovo područje tržišta DNK dijagnostike kao jedno od najvećih i najbrže rastućih;

Često se koristi kao brza metoda za indikaciju i identifikaciju virusa.

Ovu metodu je prvi razvio K. Mullis (SAD) 1983. godine. Zbog svoje visoke osjetljivosti, specifičnosti i lakoće primjene, ima široku primjenu u genetici, sudskoj medicini, dijagnostici i drugim oblastima.

Suština metode je amplifikacija, odnosno povećanje broja kopija strogo određenih fragmenata molekula DNK in vitro. Ova metoda koristi matrični mehanizam i princip komplementarnosti. Dva jednostruka polinukleotidna lanca (nukleinske kiseline) mogu se povezati vodoničnim vezama u jedan dvolančani lanac ako se nukleotidni nizovi jednog točno podudaraju s nukleotidnom sekvencom drugog tako da njihove dušične baze mogu formirati adenin-timin i gvanin-citozin parovi.

PCR se zasniva na amplifikaciji DNK pomoću termostabilne DNK polimeraze, koja sintetiše međusobno komplementarne DNK lance, počevši od dva prajmera. Prajmer je fragment DNK koji se sastoji od 20-30 nukleotida. Ovi prajmeri su komplementarni suprotnim lancima DNK. Tokom sinteze DNK, prajmeri se ubacuju u lanac novosintetizovanih molekula DNK.

Obično se PCR izvodi u 25-40 ciklusa. Svaki ciklus uključuje tri faze: prvi je denaturacija na 92-95 °C. U ovom slučaju, dva lanca DNK se razilaze; drugi je žarenje ili dodavanje prajmera na 50-65 ° C; treći je elongacija, odnosno polimerizacija na 68-72°C, dok DNK polimeraza vrši komplementarno dovršavanje lanaca DNK šablona koristeći četiri vrste nukleotida. Kao rezultat jednog ciklusa, željeni genetski materijal se udvostručuje. Lanci DNK formirani u prvom ciklusu služe kao šabloni za drugi ciklus, itd. Nakon prvog ciklusa, samo fragment između dva prajmera se umnožava. Tako se broj kopija amplificiranog regiona udvostručuje, što omogućava sintetizaciju miliona (2 n) fragmenata DNK u 25-40 ciklusa - količina dovoljna za njihovu indikaciju različitim metodama (metoda hibridizacijskih sondi koje sadrže određene etiketa, elektroforeza, itd.) . Češće se u tu svrhu koristi elektroforeza u agaroznom gelu sa bojenjem etidij bromidom.

U PCR-u iz DNK dijelova patogena koriste se prajmeri koji imaju jedinstveni niz nukleotida karakterističnih samo za određeni patogen.

Procedura za izvođenje PCR-a svodi se na sljedeće: DNK matrica se izoluje iz materijala koji se proučava; u epruveti, izolovana DNK se kombinuje sa mešavinom za amplifikaciju, koja uključuje DNK polimerazu, sva 4 tipa nukleotida, 2 vrste prajmera, MgCl, pufer, dejonizovanu vodu i mineralno ulje. Zatim se epruvete stavljaju u ciklusni uređaj, a amplifikacija se vrši automatski prema datom programu koji odgovara vrsti patogena. Rezultati se češće bilježe elektroforezom u 1-2% agaroznom gelu u prisustvu etidijum bromida, koji se kombinuje sa fragmentima DNK i otkriva se u obliku svetlećih traka kada se gel ozrači UV zrakama na transiluminatoru. Sve PCR procedure traju 1-2 radna dana.

Kako bi se povećala specifičnost i osjetljivost PCR-a, koriste se različite opcije: ugniježđeni PCR; PCR sa "vrućim startom" pomoću parafinskog sloja ili blokiranjem aktivnih centara polimeraze monoklonskim antitijelima. Osim toga, neke kompanije proizvode liofilizirane komplete reagensa za amplifikaciju DNK, koji ubrzavaju PCR proces i smanjuju mogućnost lažno pozitivnih rezultata.

Trenutno se uvodi nova tehnologija, Real-Time PCR. Njegova osnovna karakteristika je praćenje i kvantitativna analiza akumulacije proizvoda lančane reakcije polimeraze i automatska registracija i interpretacija dobijenih rezultata. Ova metoda ne zahtijeva korak elektroforeze, što smanjuje laboratorijske zahtjeve za PCR. PCR u realnom vremenu koristi fluorescentno obilježene oligonukleotidne sonde za otkrivanje DNK dok se umnožava. PCR u realnom vremenu omogućava potpunu analizu uzorka u roku od 20-60 minuta i teoretski je način da se detektuje čak i jedan DNK ili RNK molekul u uzorku.

Sistem detekcije proizvoda u lančanoj reakciji polimeraze u realnom vremenu (PCR monitoring) omogućava vam da pratite akumulaciju amplificirane DNK ciklus po ciklus. Sistem takođe uključuje oligonukleotidnu sondu koja je sposobna da se veže (hibridizuje) za unutrašnji segment ciljne DNK. Sonda je na kraju 5′ označena fluorescentnom reporterskom bojom, a na kraju 3′ bloker bojom (boja za gašenje). Kako se PCR proizvod akumulira, sonda se hibridizira s njim, ali ne dolazi do luminescencije zbog blizine između reportera i blokatora. Kao rezultat kopiranja sekvence, polimeraza stiže do 5′ kraja sonde. 5'-3' egzonukleazna aktivnost polimeraze odvaja fluorescentnu oznaku od 3' kraja sonde, čime se oslobađa fluorescentni reporter od njegove veze sa blokatorom signala, što dovodi do povećanja fluorescencije. Nivo fluorescencije je stoga proporcionalan količini specifičnog produkta reakcije. Važno je da se PCR rezultati bilježe prisustvom fluorescencije u zatvorenim epruvetama i time je riješen još jedan od glavnih problema ove metode - problem kontaminacije amplikonima.

Prednosti PCR-a: brzina analize; visoka osjetljivost i specifičnost; minimalna količina ispitnog materijala; jednostavnost izvođenja i mogućnost potpune automatizacije.

Zbog činjenice da osjetljivost PCR-a može doseći i do detekcije jedne kopije DNK šablona, ​​postoji visok stepen opasnosti od dobijanja lažno pozitivnih rezultata. Stoga, prilikom obavljanja PCR testiranja, genetička dijagnostička laboratorija mora striktno poštovati posebne zahtjeve za raspored i način rada.

PCR je jedna od komplementarnih metoda u virološkoj dijagnostici. Ova reakcija je vrlo važna za dijagnozu virusnih infekcija kada se virusni antigeni ili virus specifična antitijela ne mogu otkriti i kada prisustvo virusne nukleinske kiseline može biti jedini dokaz infekcije, posebno kod latentnih i mješovitih infekcija.

Ako pronađete grešku, označite dio teksta i kliknite Ctrl+Enter.

Lančana reakcija polimeraze poznata je već 30 godina. Široko se koristi u mnogim poljima, od arheologije do genetike.

Upravo PCR metoda pomaže u utvrđivanju očinstva, ali se najčešće koristi za identifikaciju različitih zaraznih bolesti u ljudskom tijelu.

Kako se radi PCR analiza i šta je to? Pokušat ćemo detaljno odgovoriti na ova pitanja.

PCR analiza - šta je to?

Polimerazna lančana reakcija (PCR) je visokoprecizna metoda molekularne genetičke dijagnostike koja vam omogućava da identifikujete različite zarazne i nasljedne bolesti kod ljudi, kako u akutnoj tako i u kroničnoj fazi, i mnogo prije nego što se bolest može manifestirati.

PCR metoda je apsolutno specifična i, ako se pravilno izvede, ne može dati lažno pozitivan rezultat. Odnosno, ako nema infekcije, onda analiza nikada neće pokazati da ona postoji. Stoga, sada vrlo često, da bi potvrdili dijagnozu, dodatno rade PCR test kako bi se utvrdio patogen i njegova priroda.

Lančanu reakciju polimeraze (PCR) razvio je Kary Mullis (SAD) 1983. godine, za koju je 1993. godine dobio Nobelovu nagradu za hemiju.

Koja je prednost ove metode?

Dijagnostika ovom metodom omogućava vam da pronađete patogen direktno u genu koji je sadržan u materijalima koji se proučavaju. Ovo je najprecizniji test za spolno prenosive infekcije, skrivene infekcije i razne spolno prenosive bolesti.

Razlike između PCR dijagnostike i drugih laboratorijskih metoda istraživanja su kako slijedi:

• metoda je usmjerena na identifikaciju samog patogena;
• Dijagnostika pomoću PCR metode odlikuje se svojom svestranošću: za otkrivanje nekoliko patogena;
• bolesti dovoljan je samo jedan biološki uzorak pacijenta;
• metoda je vrlo osjetljiva i nije praćena drugim unakrsnim reakcijama.

Osim toga, prednost PCR dijagnostike je u tome što je za analizu pogodan bilo koji biološki materijal pacijenta: krv, genitalni sekret, urin, sperma.

Koje infekcije može otkriti PCR bris?

U tijelu može biti prisutan veliki broj infektivnih agenasa, uključujući i „skrivene“ koji se dugo vremena ne manifestiraju.

PCR analiza razmaza omogućava vam da otkrijete takve infekcije:

• ureplazmoza genitalnih organa;
• kandidijaza();
• herpes;
• prisustvo ćelija raka;
• procijeniti hormonski status;

Testni materijal za PCR je obično sputum, pljuvačka, urin i krv. Prije izvođenja analize, morate se pažljivo pripremiti za nju tako što ćete se prvo posavjetovati s liječnikom.

Krv za PCR se obično daje na prazan želudac. Dobre rezultate pokazuje analiza kada se materijal za istraživanje uzima iz cervikalnog kanala ili uretre. U tom slučaju je najbolje provesti PCR dijagnostiku najkasnije jedan dan nakon spolnog odnosa.

Vrste PCR

PCR se koristi u mnogim područjima za testiranje i naučne eksperimente. Postoje različite metode analize:

1. PCR reverzne transkripcije(Reverzna transkripcija PCR, RT-PCR) - koristi se za amplifikaciju, izolaciju ili identifikaciju poznate sekvence iz RNK biblioteke.
2. Invertirani PCR(Inverzni PCR) - koristi se kada je poznat samo mali region unutar željene sekvence. Ova metoda je posebno korisna kada je u pitanju određivanje susjednih sekvenci nakon što je DNK umetnuta u genom.
3. Nested PCR se koristi za smanjenje broja nusproizvoda reakcije. Koriste se dva para prajmera i provode se dve uzastopne reakcije.
4. Asimetrični PCR(eng. Asymmetric PCR) - sprovodi se kada je potrebno amplifikovati pretežno jedan od lanaca originalne DNK. Koristi se u nekim tehnikama analize sekvenciranja i hibridizacije.
5. Kvantitativni PCR(Kvantitativni PCR, Q-PCR (engleski)) ili PCR u realnom vremenu - koristi se za direktno praćenje mjerenja količine određenog PCR proizvoda u svakom ciklusu reakcije.
6. Korak po korak PCR (Touchdown PCR) - korištenjem ovog pristupa smanjuje se utjecaj nespecifičnog vezivanja prajmera.
7. Grupno specifičan PCR(eng. group-specific PCR) - PCR za srodne sekvence unutar iste ili između različitih vrsta, koristeći konzervativne prajmere za ove sekvence.

Ako je nukleotidna sekvenca šablona djelimično poznata ili je uopće nepoznata, mogu se koristiti degenerirani prajmeri, čija sekvenca sadrži degenerirane pozicije u kojima se može nalaziti bilo koja baza. Na primjer, sekvenca prajmera može biti: ...ATH..., gdje je H A, T ili C.

Koji biološki materijali se proučavaju?

Različiti biološki mediji i ljudske tekućine mogu poslužiti kao materijal za PCR istraživanja, u kojima se može otkriti strana bakterijska DNK ili virusna DNK ili RNK:

1. Urin. Može se koristiti za infekcije genitourinarnog trakta kod muškaraca i mokraćnih organa kod žena (kod muškaraca upotreba urina kao materijala zamjenjuje struganje epitela).
2. Sputum. Koristi se za dijagnosticiranje tuberkuloze i, rjeđe, za dijagnosticiranje respiratornih oblika klamidije i mikoplazmoze. Sputum u količini od 15-20 ml sakuplja se u sterilnu (jednokratnu) bočicu.
3. Biološke tečnosti. Prema indikacijama se prikupljaju sok prostate, pleuralna, spinalna, amnionska tečnost, zglobna tečnost, bronhoalveolarno ispiranje, pljuvačka.
4. Epitelni strugoti sa sluzokože. Obično se koristi za dijagnosticiranje spolno prenosivih bolesti (STD), kao što su gonoreja, klamidija, mikoplazmoza, ureaplazmoza, trihomonijaza, gardnereloza, herpes i druge infekcije koje pogađaju sluznicu.
5. Biopsije. Najčešće se za otkrivanje infekcije Helicobacter pylori koriste biopsije želuca i duodenuma.
6. Krv, plazma, serum. Koristi se za PCR analizu hepatitisa B, C, D, G, herpesa, CMV, HIV virusa i istraživanja ljudskih gena.

Kako se pripremiti za test?

Pouzdanost rezultata PCR-a direktno zavisi od ispravnog podnošenja materijala na ispitivanje. Materijal ne smije biti kontaminiran, inače rezultat studije neće biti objektivan. Najvažnije preporuke prije polaganja PCR testa uključuju sljedeće zahtjeve:

1. Urin se sakuplja ujutro u sterilnu posudu.
2. Test krvi na infekcije se mora uzeti ujutru na prazan želudac.
3. Ne biste trebali biti seksualno aktivni dan prije testa.

Rezultat analize će biti gotov 1,5-2 dana nakon predmetne procedure. Postoje situacije kada se rezultat može pripremiti istog dana.

Dekodiranje OPC analize

Proces interpretacije prikazanog istraživanja odlikuje se jednostavnošću. Rezultati PCR analize mogu se dobiti 1,5-2 dana nakon predaje materijala. U nekim slučajevima, rezultat je spreman već prvog dana, a evo šta oni mogu značiti:

• Negativan rezultat pokazuje da dijagnostički materijal ne sadrži željeni infektivni agens.
• PCR pozitivan znači da je DNK ili RNK patogena prisutna u ljudskom tijelu.

U nekim slučajevima, mikroorganizmi se kvantificiraju. To se posebno odnosi na bolesti uzrokovane oportunističkim mikroorganizmima. Budući da ove bakterije ispoljavaju svoje negativno djelovanje samo u prevelikim količinama.

Takođe, kvantitativna PCR analiza je važna za odabir terapijske taktike i u svrhu praćenja liječenja virusnih infekcija kao što su virusi HIV-a i hepatitisa.

Koliko je tačna PCR dijagnoza infekcija?

PCR metodu karakterizira visoka preciznost, specifičnost i osjetljivost. To znači da ova analiza može:

• precizno utvrditi prisutnost ili odsustvo infekcije;
• navesti o kojoj se vrsti infekcije tačno radi (specifičnost);
• otkriti infekciju čak i s vrlo niskim sadržajem mikrobne DNK u biološkom materijalu,
• koji je testiran (osetljivost).

PCR analiza: cijena i vrijeme

Cijena određenog testa ovisit će o tome na koju infekciju ćete se testirati. Okvirne cijene i termini:

1. STI: 300-500 rubalja, termini – 1 dan;
2. Epstein-Barr virus, humani papiloma virus, herpes, citomegalovirus: 300-500 rubalja, termini - 1 dan;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: kvalitativna analiza 650 rubalja, kvantitativna analiza 2000 rubalja. Termini – do 5 dana;
4. Antitijela na virus hepatitisa C, ukupno (Anti-HCV) – 420 rubalja;
5. Antitijela na virus hepatitisa C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 rubalja;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubalja, termini – 1 dan;
7. HIV (antitela i antigeni) – 380 rubalja;
8. HIV RNK, visokog kvaliteta – 3.500 rubalja;
9. HIV RNK, kvantitativno - 11.000 rubalja.

Da biste uštedjeli novac, možete odabrati fiksni paket analize. Ovu uslugu pruža većina klinika u kojima se možete testirati PRC metodom (invitro, onclinic, itd.).

Provođenje PCR analize (PCR dijagnostike) počinje prikupljanjem materijala za pregled kod ginekologa, urologa ili dermatovenerologa. Kvalitetu i pouzdanost naknadno dobijenih rezultata osiguravaju najviša kvalifikacija i ogromno iskustvo ljekara medicinskog centra Euromedprestige, koji poštuju sva potrebna pravila za provođenje PCR analize: potpuna sterilnost, korištenje samo materijala za jednokratnu upotrebu.

Sakupljeni materijal iz četke stavlja se u posudu sa slanom otopinom. Nakon prikupljanja, uzorke treba što prije dostaviti u PCR laboratoriju.

PCR analiza se izvodi u laboratoriji u tri faze:

1. Ekstrakcija DNK
2. Amplifikacija fragmenata DNK
3. Detekcija produkata amplifikacije DNK

Ekstrakcija DNK je početna faza PCR dijagnostike, čija je suština sljedeća: liječnik uzima materijal za istraživanje od pacijenta i podvrgava ga posebnoj obradi. Tokom obrade, dvostruka spirala DNK se dijeli na pojedinačne niti. Materijalu pacijenta dodaje se posebna tekućina koja otapa organske tvari koje ometaju "čistoću" reakcije. Ovo uklanja lipide, aminokiseline, peptide, ugljikohidrate, proteine ​​i polisaharide. Kao rezultat, formira se DNK ili RNK.

Princip PCR metode je "konstrukcija" novih DNK ili RNK infekcija. To se ne može učiniti bez uklanjanja ćelijskog materijala.

Količina vremena utrošenog na ekstrakciju DNK ovisi o uzročniku infekcije i o vrsti materijala koji se koristi za PCR istraživanje. Na primjer, potrebno je 1,5-2 sata da se krv pripremi za sljedeću fazu.

0Niz ( => Analize) Niz ( => 2) Niz ( =>.html) 2

DNK amplifikacija

Da bi izvršili sljedeću fazu DNK dijagnostike – amplifikaciju DNK – liječnici koriste takozvane DNK matrice – DNK molekule infekcija, na koje će naknadno doći do „kloniranja“ DNK. Već je spomenuto da nije potrebno prisustvo kompletne DNK infekcije, za izvođenje ove faze dovoljan je mali komadić DNK molekula, koji je karakterističan samo za dati mikrob (infekciju).

Osnova amplifikacije DNK i, shodno tome, osnova cjelokupnog principa PCR reakcije je prirodni proces kompletiranja DNK za sva živa bića – replikacija DNK, koja se provodi udvostručavanjem jednog lanca DNK.

Počevši od jednog jedinog fragmenta DNK, laboratorijski doktor ga kopira i povećava broj kopija u režimu lančane reakcije: nakon prvog ciklusa već imate 2 fragmenta, nakon drugog ciklusa - 4, nakon trećeg - 8, nakon četvrti - 16, pa 32, 64, 128, 256... Sa svakim ciklusom se broj kopija udvostručuje, a nakon dvadeset ciklusa broj se već kreće u milione, a nakon trideset - u milijarde. Ciklus traje nekoliko minuta i svodi se na određenu promjenu temperature u vrlo malom hemijskom reaktoru. Ovdje, u otopini, sve potrebne komponente sinteze su prisutne u dovoljnim količinama, prije svega, nukleotidi A, G, T i C, a također se provode delikatne pripremne kemijske operacije tako da se odmah uzima tačna kopija iz svakog gotov segment DNK, zatim iz ove kopije - opet kopija, ovo je razgranata lančana reakcija.

Pričvršćivanjem prajmera na lanac DNK – umjetno sintetiziranih “komadića” DNK (parova nukleotida) sličnih DNK mikroba (infekcija) – formiraju se dvije kratke spirale koje se sastoje od dva lanca DNK sekcija, koje su neophodne za sintezu budućih DNK.

Sinteza novog lanca odvija se dovršavanjem svakog od dva lanca DNK. Proces amplifikacije odvija se uz pomoć specifične regije - DNK polimeraze, koja daje naziv laboratorijskoj metodi. Polimeraza djeluje kao katalizator reakcije i prati sekvencijalno vezivanje nukleotidnih baza na rastući novi lanac DNK.

Dakle, amplifikacija DNK je višestruko povećanje broja kopija DNK koje su specifične, odnosno svojstvene samo određenom organizmu. Nema potrebe da se kompletira ceo lanac DNK da bi se video infektivni agens. Potrebno je samo područje koje je karakteristično za datu bakteriju kao individuu.

5360 rub. Cijena sveobuhvatnog programa sa gastroenterologom

POPUST 25% NA KARDIOLOGU

- 25%primarni
Poseta lekaru
terapeut vikendom

5.160 RUB umjesto 5.420 rub. Skrining muškaraca na urološke infekcije

ALLERGOLOGY 5.120 RUB umjesto 5.590 rub.

Svi koraci pojačanja koji se jako ponavljaju javljaju se na različitim temperaturama. Za obavljanje PCR analize koristi se posebno programabilna oprema - PCR - termostat ili pojačalo, koji automatski mijenja temperature. Amplifikacija se provodi prema datom programu koji odgovara vrsti infekcije koja se otkriva. U zavisnosti od programa i vrste infekcije koja se otkriva, automatizovani PCR proces traje od 2 do 3 sata.

Kvalifikacije laboratorijskog doktora koji obavlja analizu igra važnu ulogu u PCR dijagnostici, od kojeg ovise ispravna podešavanja PCR opreme i interpretacija rezultata. Lekari Medicinskog centra Euromedprestige imaju veliko iskustvo u sprovođenju DNK dijagnostike, što obezbeđuje pouzdanost rezultata istraživanja i garantuje pozitivan uspeh u lečenju zaraznih bolesti. Da uradite PCR testove i izvršite kompletnu dijagnostiku i lečenje zaraznih bolesti u našem medicinskom centru Euromedprestige.

Tokom detekcije produkata amplifikacije, dobijena mješavina produkata amplifikacije se odvaja. Smjesi se dodaju specijalne otopine, koje fragmentima DNK daju sposobnost fluorescencije – reflektiraju se u narandžasto-crvenim svjetlećim prugama. Rezultirajući sjaj ukazuje na prisustvo DNK virusa, mikroba ili bakterija u materijalu uzetom od pacijenta za PCR analizu.