Полимерна верижна реакция. Вижте какво е „PCR“ в други речници

GOU VPO "Красноярска държавна медицинска академия"

на името на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие Ясенецки »

Катедра по медицинска генетика и клинична неврофизиология IPO

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за студенти от 3-4 курс

по специалностите обща медицина (060101) и

Красноярск - 2007г

Шнайдер, Н. А., Бутянов, Р. А. Основни принципи на метода на полимеразна верижна реакция. Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курс по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103). – Красноярск: Издателство на Държавната образователна институция за висше професионално образование KrasSMA, 2007. – 42 с.

Ръководството за обучение напълно отговаря на изискванията на Държавния стандарт (2000 г.) и отразява основните аспекти на съвременния метод за диагностика на наследствени заболявания на човека - метода на полимеразна верижна реакция, учебният материал е адаптиран към образователните технологии, като се вземат предвид спецификите на обучение в 3-4 години медицински и педиатрични факултети.

Рецензенти:Ръководител на катедрата по медицинска генетика, Държавно учебно заведение за висше професионално образование

"Новосибирски държавен медицински университет на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие", доктор на медицинските науки, професор;

репликация на ДНК

Обектът на изследване на този метод е дезоксирибонуклеиновата киселина (ДНК). ДНК е универсалният носител на генетична информация във всички организми, съществуващи на Земята (с изключение на РНК-съдържащите микроорганизми). ДНК е двойна верига, усукана в спирала. Всяка верига се състои от нуклеотиди, свързани в последователност. ДНК веригите имат противоположни посоки: 5" края на едната верига съответства на 3" края на втората верига. Уникално свойство на ДНК е способността й да се удвоява. Този процес се нарича репликация. Репликацията на ДНК молекулата се извършва по време на синтетичния период на интерфазата. Всяка от двете вериги на „майчината” молекула служи като шаблон за „дъщерната”. След репликация, новосинтезираната ДНК молекула съдържа една верига „майка“, а втората е новосинтезирана „дъщерна“ верига (полуконсервативен метод). За шаблонен синтез на нова ДНК молекула е необходимо старата молекула да бъде деспирирана и удължена. Репликацията започва на няколко места в молекулата на ДНК. Участъкът на ДНК молекула от началната точка на една репликация до началната точка на друга се нарича репликон.

Стартът на репликацията е активиран грундове(праймери), състоящи се от 100-200 нуклеотидни двойки. Ензимът ДНК хеликаза се развива и разделя майчината спирала на ДНК на две вериги, върху които, съгласно принципа на комплементарност, с участието на ензима ДНК полимераза, се сглобяват „дъщерни“ ДНК вериги. За да може ензимът да започне своята работа, е необходимо наличието на стартов блок - малък начален двуверижен фрагмент. Началният блок се формира от взаимодействието на праймера с комплементарния регион на съответната верига на родителската ДНК. Във всеки репликон ДНК полимеразата може да се движи по протежение на „майчината” верига само в една посока (5`=>3`).

На водещата верига, докато репликонът се развива, "дъщерна" верига постепенно нараства непрекъснато. На изоставащата верига дъщерната верига също синтезира в посока (5`=>3`), но на отделни фрагменти, докато репликонът се развива.

По този начин добавянето на комплементарни нуклеотиди на "дъщерните" вериги става в противоположни посоки (антипаралелно). Репликацията във всички репликони се извършва едновременно. Фрагменти и части от "дъщерни" вериги, синтезирани в различни репликони, се зашиват в една верига от ензима лигаза. Репликацията се характеризира с полуконсервативност, антипаралелизъм и прекъсване. Целият геном на една клетка се репликира веднъж за период от време, съответстващ на един митотичен цикъл. В резултат на процеса на репликация от една ДНК молекула се образуват две ДНК молекули, в които едната верига е от майчината ДНК молекула, а втората, дъщерната, е новосинтезирана (фиг. 1).

Ориз. 1. Схема на репликация на ДНК молекула.

По този начин цикълът на репликация на ДНК включва три основни етапа:

1. размотаване на спиралата на ДНК и разминаване на веригите (денатурация);

2. закрепване на грундове;

3. завършване на веригата на дъщерната нишка.

Принцип на PCR метода

Репликацията на ДНК е тази, която формира основата на PCR. При PCR горните процеси се извършват в епруветка в цикличен режим. Преходът от един етап на реакция към друг се постига чрез промяна на температурата на инкубационната смес. Когато разтворът се нагрее до 93-95°C, настъпва денатурация на ДНК. За да се премине към следващия етап - добавяне или "отгряване" на праймери - инкубационната смес се охлажда до 50-65°C. След това сместа се нагрява до 70-72°C - оптималната за taq-ДНК полимераза - на този етап се осъществява изграждането на нова ДНК верига. След това цикълът се повтаря отново. С други думи PCR методът е многократно увеличаване на броя на копията (усилване) специфичен участък от ДНК, катализиран от ензима ДНК полимераза.

Растежът на дъщерните ДНК вериги трябва да се случи едновременно и на двете вериги на майчината ДНК, така че репликацията на втората верига също изисква свой собствен праймер. По този начин към реакционната смес се добавят два праймера: един за веригата "+", вторият за веригата "-". Прикрепени към противоположните вериги на ДНК молекулата, праймерите се ограничават до частта от нея, която впоследствие ще бъде дублирана или амплифицирана многократно. Дължината на такъв фрагмент, наречен ампликон, обикновено е няколко стотин нуклеотида.

Етапи на PCR

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия (фиг. 2).

· Етап 1:денатурация на ДНК . Настъпва при 93-95° за 30-40 секунди.

· Етап 2:грунд отгряване . Прикрепването на праймери се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфичен регион. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Време за отгряване 20-60 сек.

· Етап 3:завършване на ДНК веригите Допълнителното завършване на ДНК веригите става от 5" края до 3" края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на свързване на праймера. Материалът за синтеза на нови ДНК вериги са дезоксирибонуклеозид трифосфати, добавени към разтвора. Процесът на синтез се катализира от ензима taq полимераза и протича при температура 70-72°C. Времето за синтез е 20-40 секунди.

Новите ДНК вериги, образувани в първия цикъл на амплификация, служат като шаблони за втория цикъл на амплификация, в който се образува специфичен фрагмент на ДНК ампликон (фиг. 3). В следващите цикли на амплификация ампликоните служат като шаблон за синтеза на нови вериги.

По този начин натрупването на ампликони в разтвора става съгласно формулата 2", където n е броят на циклите на амплификация. Следователно, дори ако първоначалният разтвор първоначално съдържа само една двойноверижна ДНК молекула, след това в 30-40 цикъла около В разтвора се натрупват 108 ампликонови молекули, което е достатъчно за надеждно визуално откриване на този фрагмент чрез електрофореза в агарозен гел.

Процесът на усилване се извършва в специален програмируем термостат ( термоциклер), който по зададена програма автоматично променя температурите според броя на циклите на усилване.

За да се извърши усилване, са необходими следните компоненти:

· ДНК матрица(ДНК или част от нея, съдържаща желания специфичен фрагмент);

· Грундове(синтетични олигонуклеотиди (20-30 нуклеотидни двойки), комплементарни на ДНК последователностите в границите на специфичния фрагмент, който се определя). Изборът на специфичен фрагмент и подборът на праймери играе критична роля за специфичността на амплификацията, което влияе върху качеството на анализа.

· Смес от дезоксинуклеотид трифосфати (dNTPs)(смес от четири dNTPs, които са материалът за синтеза на нови комплементарни ДНК вериги в еквивалентни концентрации от 200-500 µM)

· ЕнзимTaq- полимераза(термостабилна ДНК полимераза, която катализира удължаването на праймерните вериги чрез последователно добавяне на нуклеотидни бази към нарастващата верига от синтезирана ДНК, 2-3 тМ).

· Буферен разтвор(реакционна среда, съдържаща Mg2+ йони, необходими за поддържане на ензимната активност, pH 6,8-7,8).

За да се идентифицират специфични региони на генома на РНК вируси, първо се получава ДНК копие от РНК шаблон, като се използва реакция на обратна транскрипция (RT), катализирана от ензима ревертаза (обратна транскриптаза).

Ориз. 2. Усилване (1-ви цикъл).

Ориз. 3. Усилване (2-ри цикъл).

Основни приложения на PCR

· клинична медицина:

o диагностика на инфекции,

o идентифициране на мутации, включително диагностика на наследствени заболявания,

o генотипизиране, включително HLA генотипиране,

o клетъчни технологии

· екология (като начин за наблюдение на състоянието и качеството на обектите на околната среда и хранителните продукти)

· определяне на трансгенни организми (ГМО)

Лична идентификация, установяване на бащинство, криминалистика

· обща и специфична биология,

Основни принципи

организиране на диагностични лаборатории

Работата в PCR лабораторията се извършва в съответствие с „Правилата за проектиране, предпазни мерки, промишлена санитария, противоепидемичен режим и лична хигиена при работа в лаборатории (отдели, отдели) на санитарни и епидемиологични институции на системата на здравеопазването.

Замърсяване на ДНК проби

Провеждането на PCR диагностика е свързано с проблем поради високата чувствителност на метода – възможността замърсяване. Влизането на следи от положителна ДНК в реакционната епруветка (специфични продукти за амплификация на ДНК - ампликони; ДНК стандарт, използван като положителна контрола; положителна ДНК от клинична проба) води до амплификация на специфичен ДНК фрагмент по време на PCR и в резултат на това , до появата на фалшиви положителни резултати.

В процеса на работа може да срещнете два вида замърсяване:

1. кръстосано замърсяванеот проба на проба (по време на обработка на клинични проби или при разтваряне на реакционната смес), което води до спорадични фалшиво положителни резултати;

2. замърсяване с продукти за усилване(ампликони), което е от голямо значение, тъй като по време на PCR процеса ампликоните се натрупват в огромни количества и са идеални продукти за реамплификация.

Замърсяването на стъклария, автоматични пипети и лабораторно оборудване, повърхността на лабораторните маси или дори повърхността на кожата на лабораторните работници със следи от ампликони води до систематични фалшиво положителни резултати. Определянето на източника на замърсяване може да бъде много трудно и изисква значителна инвестиция на време и пари. Натрупаният досега опит в лаборатории, използващи метода PCR за диагностика, ни позволява да формулираме основните изисквания за организацията на такива лаборатории и провеждането на самите анализи. Спазването на тези изисквания елиминира възможността от замърсяване и фалшиво положителни резултати.

Етапи на PCR анализ

Те са географски разделени чрез поставянето им в отделни помещения (фиг. 4, 5):

· Предварителна PCR стая,където се обработват клинични проби, изолира се ДНК, приготвя се реакционна смес за PCR и се извършва PCR (при наличие на условия се препоръчва и последните два етапа да се извършват в допълнително отделно помещение). В тези помещения е забранено извършването на всякакви други видове работа с тестови агенти, чиято PCR диагностика се извършва в тази лаборатория.

· Стая за пост-PCR,където се извършва откриване на продукти на амплификация. В тази стая могат да се използват други методи за откриване. Препоръчително е помещението за откриване на продукта на амплификация да се разположи възможно най-далеч от стаите за пред-PCR.

Работните помещения са оборудвани с ултравиолетови лампи с максимална радиация от порядъка на 260 nm (тип DB-60) при разход 2,5 W на 1 m3. Лампите са разположени така, че повърхностите на работните маси, оборудването и материалите, с които операторът има контакт по време на PCR анализ, са изложени на директно облъчване. Облъчването се извършва в рамките на 1 час преди започване на работа и в рамките на 1 час след приключване на работа.

Лаборантите работят в специално лабораторно облекло, което се сменя при преминаване от една стая в друга и в ръкавици за еднократна употреба. Дрехите от различни стаи се обработват отделно. Различни служители работят на различни етапи от PCR анализа.

За работа се използват отделни комплекти дозатори, пластмасови и стъклени съдове, лабораторно оборудване, престилки и ръкавици, предназначени за различни етапи на анализ и непреносими от една стая в друга. Оборудването, материалите и консумативите във всяка стая са надлежно маркирани.

Всички етапи на работа се извършват само с консумативи за еднократна употреба: накрайници за автоматични пипети, епруветки, ръкавици и др. Не забравяйте да смените накрайниците, когато преминавате от проба на проба. Необходимо е да се използват накрайници с филтър - аерозолна бариера, за да се предотврати навлизането на микрокапки от разтвора в пипетата. Използваните туби и накрайници се изхвърлят в специални контейнери или контейнери, съдържащи дезинфекционен разтвор. Клиничните проби се съхраняват отделно от реагентите.

За обработка и почистване на работното място всяка стая е оборудвана с памучно-марлеви тампони (кърпички), пинсети, дезинфектанти и дезактивиращи разтвори.

Лабораторията за PCR диагностика изключва работа, свързана с производството (клониране) и изолирането на рекомбинантни плазмиди, съдържащи ДНК последователности или генни фрагменти на патогени, които се диагностицират в тази лаборатория.

Събиране на клиничен материал

Материалът, който се изследва за PCR, може да бъде изстъргване на епителни клетки, кръв, плазма, серум, плеврална и цереброспинална течност, урина, храчка, слуз и други биологични секрети, биопсии.

Материалът се събира в лечебна зала с подходящ профил. След вземането пробите трябва да бъдат доставени в PCR диагностичната лаборатория възможно най-скоро.

Пробите трябва да се вземат със стерилни, за предпочитане инструменти за еднократна употреба, само в стерилни пластмасови или стъклени епруветки за еднократна употреба, предварително обработени за един час с хромна смес, старателно измити с дестилирана вода и калцинирани в сушилен шкаф при температура 150°C за 1 час.

Зона на детекция (друг етаж или друга сграда).

Ориз. 4. PCR лабораторен апарат с детекция чрез електрофореза.

Зона на детекция (друг етаж или друга сграда)

Ориз. 5. PCR лабораторен апарат с флуоресцентна детекция (количествен анализ).

Ориз. 6. Стая за екстракция на ДНК.Показана е настолна кутия с бактерицидна лампа.

Ориз. 7. Стая за усилване.

Ориз. 8. Стая за откриване.

Ориз. 9. Кръвни проби за ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Съхранение и транспортиране на проби

За диагностициране на наследствени заболявания кръвните проби се съхраняват на специални хартиени форми или в епиндорфи (пластмасови епруветки) в замразено състояние за дълго време (фиг. 9).

За диагностициране на инфекциозни заболявания пробите се държат при стайна температура за не повече от 2 часа. Ако е необходимо по-продължително съхранение, пробите могат да се поставят в хладилник при температура 2-8°C за период не повече от един ден. Допустимо е по-продължително съхранение (до 2 седмици) замразено във фризер при температура минус 20°C. Не се допуска повторно замразяване и размразяване на проби.

Ако диагностичната лаборатория за PCR и процедурната зала за вземане на проби са географски разделени, тогава транспортирането на проби трябва да се извършва в термоси или термоконтейнери в съответствие с правилата за съхранение на проби и правилата за транспортиране на инфекциозни материали.

Екстракция на ДНК от проби

Методът на сорбция в твърда фаза стана широко разпространен, който се състои в добавяне на лизиращ агент, съдържащ разтвор на гуанидин, сорбция на ДНК върху сорбент, многократно промиване и резорбция на ДНК с буферен разтвор. При обработката на серум, плазма или цяла кръв обикновено се използва методът за екстракция с фенол. Методът включва депротеинизация с фенол/хлороформ, последвана от утаяване на ДНК (или РНК) с етанол или изопропанол. Обработката се извършва в микроцентрофужни епруветки Eppendor P с обем 1,5 ml. Времето за обработка е 1,5-2 часа (фиг. 10).

Ориз. 10. Екстракция на ДНК.

Провеждане на PCR

Определено количество проба от обработената клинична проба се прехвърля в специална микроцентрофужна епруветка тип Eppendorf с обем 0,2 или 0,5 ml, към която се добавя смес за амплификация, състояща се от вода, PCR буфер, dNTP разтвор, праймерен разтвор и разтвор. същата епруветка Taq полимераза (добавена към сместа последна). Обикновено обемът на реакционната смес е 25 µl. След това се добавя една капка минерално масло към всяка епруветка, за да се предотврати изпаряването на реакционната смес по време на процеса на амплификация. тръбите се прехвърлят в програмируем термостат (усилвател), където усилването се извършва автоматично по зададена програма (фиг. 11).

Ориз. единадесет. усилвател " Термоциклер ».

Времето за реакция в зависимост от зададената програма е 2-3 часа. Паралелно с експерименталните проби се поставят и контролни проби: положителната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо материала на клиничната проба се добавя контролен ДНК препарат на изследвания ген. Отрицателната контрола включва всички компоненти на реакцията, но вместо клиничен материал или ДНК препарат се добавя подходящо количество дейонизирана вода или екстракт, който не съдържа изследваната ДНК. Необходима е отрицателна контрола, за да се проверят реакционните компоненти за отсъствие на ДНК поради замърсяване и за изключване на фалшиво положителни резултати.

Регистрация на резултатите

Амплифицираният специфичен ДНК фрагмент се открива чрез електрофореза в агарозен гел в присъствието на етидиев бромид. Етидиевият бромид образува стабилно интерстициално съединение с ДНК фрагменти, което се появява под формата на светещи ленти, когато гелът се облъчи с UV лъчение с дължина на вълната 290-330 nm. В зависимост от размера на ампликоните, образувани в резултат на PCR, се използва гел със съдържание на агароза от 1,5% до 2,5%. За да се приготви агарозен гел, смес от агароза, буфер и вода се разтопява в микровълнова фурна или на водна баня и се добавя разтвор на етидиев бромид. Охладената до 50-60°С смес се изсипва във формата на слой с дебелина 4-6 мм и със специални гребени в гела се правят джобове за нанасяне на пробата. Гребените се монтират по такъв начин, че между дъното на ямките и основата на гела да остане слой агароза с дебелина 0,5-1 mm. След като гелът се втвърди, усилвателят се нанася върху джобовете в количество от 5-15 μl. Препоръчително е да се извърши електрофореза на смес от маркери за дължина на ДНК фрагменти успоредно с контролни и експериментални проби. Обикновено такава смес съдържа десет ДНК фрагмента с дължина 100, 200, 300 и т.н. базови двойки.

Използването на такъв тест дава възможност да се провери дължината на ампликоните в контролни и експериментални проби. Гелът с нанесената проба се прехвърля в камера за електрофореза, пълна с буфер, камерата се свързва към източник на захранване и се извършва електрофоретично разделяне на продуктите на амплификацията за 30-45 минути при напрегнатост на електрическото поле 10-15 V/ см. В този случай предната част на багрилото, включено в реакционната смес, трябва да измине най-малко 3 cm.

След като електрофорезата приключи, гелът се прехвърля в стъклен трансилюминатор и се гледа под ултравиолетова светлина. За документиране гелът се снима на филм Micrat 300 или се записва с помощта на видео система, свързана с компютър.

На първо място се оценяват контролни проби. Трябва да има оранжева светеща лента в електрофоретичната следа, съответстваща на положителната контрола. Неговата електрофоретична подвижност трябва да съответства на дължината на ампликона, посочена в инструкциите.

В електрофоретичната следа, съответстваща на отрицателната контрола, такава лента трябва да отсъства. Наличието на такава лента в отрицателната контрола показва замърсяване - замърсяване на реагентите, използвани с тест ДНК или ампликон. Тестовите проби се оценяват по наличието на лента в съответната писта, която е разположена на същото ниво като лентата в положителната контролна проба. Интензитетът на лентата съответства на количеството ДНК, което се тества в пробата, което позволява полуколичествена оценка на PCR. Обикновено положителните резултати се оценяват по четиристепенна скала. Ако светенето на лентата в тестовата проба е много слабо, тогава такава проба трябва да бъде пренаредена (фиг. 12).

Ориз. 12. Електрофореза в агарозен гел.

Приложения на PCR задиагностика на точкови мутации и генни полиморфизми

Една от водещите области на приложение на PCR в практическото здравеопазване е диагностиката на точкови мутации и генни полиморфизми . Има директни и косвени методи за ДНК диагностика. В ситуации, когато е известен ген, увреждането на което води до развитие на наследствено заболяване, това увреждане може да бъде открито чрез молекулярно-генетични методи. Такива методи се наричат ​​директни. Чрез директни методи се откриват нередности в първичната нуклеотидна последователност на ДНК (мутации и техните видове). Директните методи се характеризират с точност, достигаща почти 100%.

На практика обаче тези методи могат да се използват при определени условия:

· с известна цитогенетична локализация на гена, отговорен за развитието на наследствено заболяване;

· генът на заболяването трябва да бъде клониран и неговата нуклеотидна последователност да е известна.

Целта на директната ДНК диагностика е да се идентифицират мутантни алели.

По този начин, в ситуации, когато е известно какъв вид увреждане на ДНК води до наследствено заболяване, ДНК фрагментът, съдържащ увреждането, се изследва директно, т.е. използва се методът за директна ДНК диагностика.

Към днешна дата обаче гените на много заболявания не са картографирани, тяхната екзон-интронна организация е неизвестна и много наследствени заболявания се характеризират с изразена генетична хетерогенност, което не позволява пълното използване на директни методи за ДНК диагностика. Ето защо в случаите, когато локализацията на увреждането е неизвестна, се използва друг подход, свързан с изследване на близостта на гена, отговорен за генното заболяване, в комбинация с фамилен анализ, т.е. индиректни методи за молекулярно-генетична диагностика на се използват наследствени заболявания.

Могат да се използват различни методи за откриване на точкови мутации и малки делеции, но всички те разчитат на PCR метода. Тази реакция ви позволява да умножите многократно нуклеотидната последователност на ДНК и след това да търсите мутации. Методите за търсене на ДНК фрагменти, носещи мутации, се основават на сравнителен анализ на мутантни и нормални ДНК нуклеотидни последователности.

Анализ на PCR продукти

в процеса на директна ДНК диагностика

Включва изследване на специфични характеристики на амплифицираната генна област. По този начин, при заболявания, причинени от експанзия на тринуклеотидни повторения, продуктите на амплификация се различават по дължината си (отразяваща различния брой триплети в изследваната генна област) и, като следствие, по скоростта им на движение в гела. Благодарение на това се постига ясно електрофоретично разделяне на нормални и мутантни алели и точно определяне на патологично удължен фрагмент, т.е. ДНК диагностика на заболяването (фиг. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Ориз. 14. Диагностика на изтриване GAG в ген DYT 1 при пациенти с допа-независима дистония (електрофореза с полиакриламиден гел). Пътища 2,3,6 – болни; писти 1,4,5 – управление. Тънката стрелка показва нормалния алел, дебелата стрелка показва мутантния по-къс алел (делеция на три нуклеотида).

Ако цялата изследвана ДНК област е част от разширена делеция, тогава PCR амплификацията на ДНК от този изтрит алел няма да бъде извършена поради липсата на места за праймерна хибридизация. В този случай хомозиготна делеция ще бъде диагностицирана въз основа на пълното отсъствие на продукт от PCR реакция (синтезът на ДНК е невъзможен и от двете копия на гена). С хетерозиготна делеция е възможно да се открие PCR продукт, синтезиран от нормален (задържан) алел; обаче, за да се диагностицира надеждно такава мутация, е необходимо да се използват по-сложни методи за изобразяване на ДНК, които позволяват да се оцени дозата на крайната PCR продукт.

За идентифициране на точкови мутации (най-често нуклеотидни замествания) в определени места се използва PCR методът в комбинация с други методи за молекулярно-генетичен анализ. Ако местоположението и природата на предполагаемата точкова мутация са точно известни, тогава рестрикционни ендонуклеази (рестрикционни ензими) са специални клетъчни ензими, изолирани от различни щамове бактерии.

Тези ензими разпознават специфични нуклеотидни последователности с дължина от четири до десет нуклеотида. След това се извършва рестрикция (лат. (разрязване)) на тези последователности като част от двуверижна ДНК молекула.Всеки рестриктазен ензим разпознава и отрязва на фиксирано място строго определена, специфична нуклеотидна последователност - рестрикционно място (место за разпознаване).

В случаите, когато точкова мутация променя естественото място на разпознаване за определен рестрикционен ензим, този ензим няма да може да разцепи мутантния PCR-амплифициран фрагмент. В някои случаи мутацията води до появата на ново място за разпознаване за конкретен рестрикционен ензим, който обикновено отсъства.

И в двете ситуации мутантните и нормалните PCR продукти, третирани с избрания рестрикционен ензим, ще произведат рестрикционни фрагменти с различни дължини, които могат лесно да бъдат открити чрез електрофореза (фиг. 15).

По този начин, ако е необходимо бързо да се открие някаква специфична точкова мутация, задачата се свежда до търсене на съответния рестрикционен ензим, чието място за разпознаване е локализирано на мястото на нарушената нуклеотидна последователност. Третирането на PCR продукти с такъв рестрикционен ензим ще направи възможно лесното разграничаване на нормалните и мутантните алели. Рестрикционният анализ значително опростява откриването на известни точкови мутации и сега се използва широко за директна ДНК диагностика на наследствени заболявания.

Крайният етап молекулярно-генетичен анализ на мутациие да се определи нуклеотидната последователност на изследвания ДНК фрагмент (секвениране), която се сравнява с нормата и се формулира окончателна генетична диагноза. Благодарение на успехите на молекулярната генетика сега са разработени методи за ДНК диагностика на повече от 400 наследствени заболявания.

Ориз. 15. Откриване на точкова мутация чрез рестрикционен анализ: A – амплифицирана генна област, съдържаща рестрикционно мястоAGCTза рестрикционна ендонуклеазаАлу аз. МутацияЖ→ Апроменя тази нуклеотидна последователност, което води до рестрикционен ензимАлуИблокиран; B – електроферограма на рестрикционни продукти: писта 1 – хомозиготност за нормалния алел; писта 2 – хомозиготност за мутация; път 3 – хетерозиготно състояние (нормален алел + мутация).

Диагностиката на наследствени заболявания, основана на директно изследване на мутантни алели при пациенти, членове на техните семейства или съмнения за хетерозиготни носители на патологични мутации, е подходяща за пресимптоматична и пренатална диагностика, която може да се прилага в най-ранните етапи от развитието на плода, преди поява на някакви клинични или биохимични симптоми на заболяване.

Независимо от метода за откриване на мутации, точните молекулярни характеристики на всяка мутация могат да бъдат получени само чрез директно секвениране. За автоматизиране на този процес през последните години широко се използват специални устройства - секвенатори, които позволяват значително да се ускори процесът на четене на ДНК информация.

Пътят към по-широко използване на молекулярно-биологични изследвания в клинични диагностични лаборатории се отваря чрез ускоряване на аналитичния процес чрез извършване на всички процедури в един континуум, без трансфер на проба, създаване на условия за предотвратяване на замърсяване по време на паралелно тестване на редица аналити и чрез обективно записване на резултати във всеки цикъл.

Основни модификации на PCR метода

Използва се за бързо сканиране и търсене на известни генни мутации.

Мултиплексна (мултипраймерна) PCR

Този метод се основава на едновременната амплификация на няколко екзона на изследвания ген в една реакция. Това позволява рентабилен бърз скрининг на най-честите мутации. Например, за бързо диагностициране на носителството на делеции в гена за дистрофин при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, се извършва едновременна амплификация на набор от най-често мутиралите екзони на този ген. Тъй като тези заболявания се унаследяват по Х-свързан рецесивен начин и са свързани с увреждане на единствената Х хромозома при момчетата, в случай на разширена делеция, електрофорезата на реакционните продукти ще разкрие липсата на един или повече ДНК фрагменти (екзони). ), което може да служи като молекулярно потвърждение на диагнозата. В допълнение, чрез избиране на специфични генни секции за PCR амплификация е възможна сравнително точна оценка на общата дължина на делецията и точките на прекъсване на гена (до екзона).

Комбинираното използване на няколко мултиплексни реакции прави възможно диагностицирането на до 98% от всички делеции, възникващи при пациенти с прогресивна мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер. Това представлява приблизително 60% от общия брой известни мутации в гена за дистрофин и показва много високата ефективност на този метод за скрининг за ДНК диагностика на дистрофинопатии (фиг. 16).

Ориз. 16. Директна ДНК диагностика на мускулна дистрофия на Дюшен чрез мултиплексна PCR (електрофореза в агарозен гел). Във всеки от изследваните индивиди четири екзона на дистрофиновия ген са амплифицирани едновременно (екзони 17, 19, 44 и 45; стрелките показват съответните продукти на амплификация). Ивица 1 – контрола, ленти 2-5 – пациенти с мускулна дистрофия на Дюшен с различни делеции на гена за дистрофин (ленти 2 и 5 – делеция на екзон 45, пътека 3 – делеция на екзон 44, пътека 4 – делеция на екзони 17 и 19 ).

Алел-специфична амплификация

Методът се основава на използването на две независими двойки праймери за специфичен генен регион: един праймер и в двете двойки е общ, а вторият праймер във всяка двойка има различна структура и е комплементарна към нормална или мутантна ДНК последователност. В резултат на такава реакция в разтвор могат да се синтезират едновременно два вида PCR продукти - нормални и мутантни. Освен това дизайнът на използваните праймери прави възможно ясното разграничаване на нормалните и мутантните продукти на амплификация по техния молекулен размер. Този метод е много визуален и ви позволява да проверите както хомо-, така и хетерозиготно носителство на мутантния алел.

Метод за сайт-насочена модификация на амплифицирана ДНК

Методът се основава на използването на т. нар. mismatch праймер в PCR (не напълно комплементарен на шаблона), който се различава от шаблонната ДНК последователност с един нуклеотид. В резултат на включването на посочения праймер в мутантния PCR продукт, в него се образува изкуствено създадено рестрикционно място за една от рестрикционните ендонуклеази, което позволява директна ДНК диагностика на определена известна мутация чрез рестрикционен анализ. Създаването на такова изкуствено рестрикционно място е необходимо, ако търсенето не разкри съществуването на известен и достъпен ензим, чието „естествено“ рестрикционно място е засегнато в резултат на появата на изследваната мутация в ДНК молекулата .

PCR метод с обратна транскриптаза (RT- PCR)

Този метод се използва в случаите, когато е по-удобно да се използва не геномна ДНК като обект на изследване, а по-компактна и богата на информация сДНК, получена след подходяща обработка на тъканни проби, например биопсичен материал или клетъчни линии от лимфоцити, фибробласти и др. Важно условие тук е експресията (поне минимална) на желания ген в изследваната тъкан.

На първия етап се извършва обратна транскрипция на иРНК и получените cDNA молекули служат като шаблон за PCR. Впоследствие, критичната област на сДНК, амплифицирана в достатъчно количество, се подлага на секвениране и други методи за мутационен скрининг, директно електрофоретично изследване (откриване на делеции, инсерции и т.н.) или интегриране в експресионна система, за да се получи протеинов продукт и нейния директен анализ.

Този метод е особено ефективен за откриване на мутации, водещи до синтеза на "пресечен" протеин (безсмислени мутации, сплайсинг мутации, големи делеции) - така нареченият PTT анализ (Protein Truncation Test). PTT анализът обикновено се използва при изследване на дълги гени с множество екзони, като мускулна дистрофия на Дюшен/Бекер, атаксия-телеангиектазия или неврофиброматоза тип 1.

PCR в реално време(PCR в реално време, английски)

Всяка година PCR в реално време става все по-популярен диагностичен метод в практическото здравеопазване. Основната му характеристика е мониторингът и количественият анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматичното регистриране и интерпретация на получените резултати. Този метод не изисква етап на електрофореза, което намалява изискванията за PCR лаборатория. Благодарение на спестяването на производствено пространство, намаляването на броя на персонала и търсенето на количествено определяне на ДНК/РНК, този метод се използва успешно през последните години в най-големите санитарно-епидемиологични, диагностични и изследователски центрове в развитите страни по света, заменяйки PCR в сегашния („класически“) формат.

PCR в реално време използва флуоресцентно белязани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК, докато се усилва. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и теоретично може да открие дори една ДНК или РНК молекула в проба.

Ориз. 17. PCR в реално време.

PCR в реално време използва система TaqMan, която контролира кинетиката на PCR директно по време на амплификация, използвайки резонансно флуоресцентно потушаване. За откриване се използва сонда, която носи флуорофор и гасител, допълващи средната част на амплифицирания фрагмент. Когато флуорофорът и гасителят са свързани с олигонуклеотидната проба, се наблюдава само малка флуоресцентна емисия. По време на процеса на амплификация, поради 5" екзонуклеазната активност на Taq полимеразата, флуоресцентният етикет преминава в разтвор, освободен от близостта си до гасителя, и генерира флуоресцентен сигнал, който се увеличава в реално време пропорционално на натрупването на усилвателя ( Фиг. 17).

Основните предимства на PCR в реално време пред PCR с гел електрофореза:

· Целият метод се извършва в една епруветка;

· Методът отнема 1 час;

· Достатъчни са 1-2 работни стаи;

· Наред с качествената оценка на резултата има възможност за количествена оценка (например при предписване на антивирусна терапия за СПИН или вирусен хепатит е необходимо да се знае вирусният товар, т.е. количеството вирус на единица, което се предоставя чрез PCR в реално време);

· Рискът от замърсяване е рязко намален.

Заключение

PCR методът е един от най-разпространените методи за молекулярно-биологични изследвания. Този метод трябва да се използва интелигентно от клиницистите и лекарят, който реши да използва PCR в работата си, трябва да има определени познания за характеристиките и възможностите на този метод. Второ, трябва да има тясна обратна връзка между клинициста и PCR лабораторията, която е необходима за анализиране на сложни случаи и разработване на правилната диагностична стратегия. Трето, PCR анализът не е панацея в диагностиката (предимно инфекциозни заболявания) и не замества съществуващите методи на изследване, а само ги допълва. И най-важното е, че PCR не може да замени интуицията и аналитичното мислене, които трябва да притежава лекарят, който очаква успех.

П . С . Молекулярно-биологични изследвания - променящи се насоки за диагностика и лечение. Използването на молекулярно-биологични методи е свързано с перспективата за радикална промяна на акцентите в лабораторната диагностика. Може да не става въпрос само за навременна информация, а за получаването й предварително. Ако сега лабораторните тестове в повечето случаи се извършват вече, когато заболяването се е развило и лечението е започнало, тогава се очаква информацията от молекулярно-биологичната лаборатория да позволи да се идентифицира склонността на дадено лице към определени видове патология и степента на чувствителност към определени лекарства. , което ще оправдае предсказващия, превантивен и персонализиран характер на бъдещата медицина.

ПРОМЯНА НА ДИАГНОЗАТА И ОРИЕНТАЦИИТЕ НА ЛЕЧЕНИЕТО

НАСЛЕДСТВЕНИ БОЛЕСТИ

Днес В бъдещето

Диагноза Генетичен паспорт

8. Колко работни помещения са необходими за работа на PCR лаборатория с флуоресцентно откриване (количествен анализ, PCR в реално време)?

9. Какво е откриване?

10. Какви методи за ДНК диагностика има?

11. Работата на кой ензим е в основата на PCR?

12. Защо зоната на детекция трябва да бъде премахната от другите работни зони?

13. Какво е сайт за ограничаване?

14. Какви са разликите между директните и индиректните методи за ДНК диагностика?

15. Какво е секвениране?

16. Какво е мултиплексна PCR?

17. Какви видове мутации се определят чрез PCR?

18. Какво е замърсяване?

19. Каква е същността на метода за алел-специфична амплификация?

20. Условия за съхранение на PCR материал?

21. В какво устройство се извършва усилване?

22. Какво представлява методът PCR с обратна транскриптаза (RT-PCR)?

23. Какво служи като материал за PCR диагностика?

24. Избройте видовете замърсяване?

Тестове за самоподготовка

1. Ендонуклеазни рестрикционни ензими:

а) ензими, които "разбиват" ДНК на строго определени места;

б) ензими, които съединяват разкъсванията в молекулата на ДНК;

в) ензими, които осигуряват съединения, които извършват възстановяване на ДНК.

2. Генна амплификация:

3. Кой метод на молекулярна генетика се използва за диагностициране на заболявания, причинени от мутантен ген с известна последователност?

а) използване на специфичен рестрикционен ензим;

б) директно откриване с помощта на специфични молекулярни проби;

в) фамилен анализ на разпределението на нормалните полиморфизми на дължината на рестрикционните фрагменти.

4. ДНК секвениране:

а) идентифициране на базовата последователност на ДНК;

б) многократни повторения на всяка ДНК секция;

в) изолиране на ДНК фрагмент, съдържащ изследвания ген.

5. За получаване на ДНК проби можете да използвате :

б) хорионни въси;

в) амниотична течност;

г) клетки от амниотична течност;

д) биопсични проби от кожа, мускули, черен дроб,

д) всичко е правилно с изключение на точка "в",

g) всичко е правилно с изключение на точка „d“,

з) всичко по-горе е вярно.

6. За да се диагностицира кои мутации се използва PCR методът:

а) геномни;

б) хромозомни;

в) ген (точка).

7. Грундът е:

а) комплементарна секция на ДНК;

b) белязана (радиоактивно или флуоресцентно) последователност със синтетичен олигонуклеотид, комплементарна на мутантен или нормален ген;

в) олигонуклеотид, който действа като "праймер" и инициира синтеза на полинуклеотидна верига върху ДНК или РНК матрица.

8. Кой е разработил принципа на PCR метода?

б) К. Мълис

9. Методът PCR използва ли се за диагностициране на експанзия на тринуклеотидни повторения (динамичен тип мутация)?

10. В какви области се използва PCR?

а) клинична медицина;

б) определяне на трансгенни организми (ГМО)

в) лична идентификация, установяване на бащинство, криминалистика

г) всичко по-горе,

д) нито едно от горните..

Примерни отговори: 1 – а; 2 – б; 3 – б; 4 – а; 5 – д; 6 – в; 7 – в; 8 – б; 9 – а, 10 – ж.

Основен

1.Бочков генетика. Москва. ГЕОТАР, 2002.

Допълнителен

1. , Бахарев и лечение на вродени и наследствени заболявания при деца. – Москва, 2004 г.

2. ДНК диагностика и медико-генетично консултиране. – Москва, 2004 г.

3. Генетика на Гинтер. – Москва, 2003 г.

4. Горбунов основи на медицинската генетика. – Санкт Петербург: Интермедика, 1999.

5. Дж. Макгий. Молекулярна клинична диагностика. – Свят, 1999г.

6. Меншиков - биологични изследвания в клиничната лабораторна диагностика: възможности на проблема (лекции). Клинична лабораторна диагностика, № 3, 2006 г.

7. Работата на Корниенко в PCR лабораторията по време на вградения анализ на биологичен материал. Клинична лабораторна диагностика, бр.10, 2006г.

8. Организация на работата на PCR лабораторията. Методически указания. MU 1.3.1794-03. Главен санитарен лекар на Руската федерация, 2003 г.

9. Ерлих Х. А. PCR технология. – Пърчин-Елмър Сетус, 1993 г.

10. Heid C. A., Stevens J. Количествен PCR в реално време. Genome Res. – бр.6, 1996г.

ОСНОВНИ ПРИНЦИПИ НА МЕТОДА

ПОЛИМЕРАЗНА ВЕРИЖНА РЕАКЦИЯ

Методическо ръководство за извънаудиторна работа на студенти от 3-4 курс по специалностите обща медицина (060101) и педиатрия (060103).

GOU VPO "Красноярска държавна медицинска академия на Федералната агенция за здравеопазване и социално развитие"

Русия, Красноярск,

Принципи на PCR диагностика

РЕЗЮМЕ

раздели, 34 стр., 5 фигури, 5 препратки

Целта на тази работа е кратко обобщение на основните принципи и технологични характеристики на метода PCR, неговото научно и практическо приложение в диагностиката на инфекциозни заболявания.

СПИСЪК НА КОНВЕНЦИОНАЛНИТЕ СЪКРАЩЕНИЯ

HCV - вирус на хепатит С

dATP - дезоксиаденозин трифосфат

dGTP - деоксигуанозин трифосфат

dNTP - дезоксинуклеотид трифосфат

dTTP - дезокситимидин трифосфат

dCTP - дезоксицитозин трифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеинова киселина

PCR - полимеразна верижна реакция

РНК - рибонуклеинова киселина - имуноглобулин клас GTime PCR - PCR метод в реално време

ВЪВЕДЕНИЕ

ПРИНЦИП НА МЕТОДА PCR

ЕТАПИ НА PCR АНАЛИЗ

PCR МЕТОД В РЕАЛНО ВРЕМЕ

ПРЕДИМСТВА НА МЕТОДА PCR

ОГРАНИЧЕНИЯ НА МЕТОДА PCR

ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА PCR

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

ВЪВЕДЕНИЕ

Откриването на метода на полимеразна верижна реакция (PCR) се превърна в едно от най-забележителните развития в областта на молекулярната биология през последните десетилетия. Това направи възможно издигането на медицинската диагностика на качествено ново ниво. Принципът на метода на полимеразна верижна реакция е разработен от Carrie Mullis през 1983 г. За разработването на PCR анализ, К. Мълис е удостоен с Нобелова награда за химия през 1993 г.

След откриването на PCR, той много бързо беше въведен в практиката. Методът стана толкова популярен, че днес е трудно да си представим работа в областта на молекулярната биология без използването му. PCR методът получи особено бързо развитие благодарение на международната програма за човешкия геном. Създадени са съвременни технологии за лазерно секвениране (декодиране на ДНК нуклеотидни последователности). Ако в близкото минало дешифрирането на ДНК последователност от 250 нуклеотидни двойки (bp) отнемаше една седмица, съвременните лазерни секвенатори могат да определят до 5000 bp. в един ден. Това от своя страна допринася за значителното нарастване на информационните бази данни, съдържащи ДНК последователности. Понастоящем са предложени различни модификации на PCR, показана е възможността за създаване на тестови системи за откриване на микроорганизми и идентифициране на точкови мутации и са описани десетки възможни приложения на метода.

Появата на PCR метода се дължи на някои постижения в областта на молекулярната генетика, главно на декодирането на нуклеотидната последователност на геномите на редица микроорганизми. Трябва да се отбележи, че това откритие беше придружено от развитието на определени технологии. По-специално, появата на устройства, които правят възможно автоматичното синтезиране на едноверижни ДНК фрагменти (олигонуклеотиди). През същия период са открити уникални микроорганизми, живеещи в гейзери. Тяхната ензимна система, по-специално ДНК полимераза, издържа на високите температури на горещите извори и запазва своята биологична активност до 95 ° C, което е необходимо условие за провеждане на полимеразната верижна реакция.

Полимеразната верижна реакция в момента е най-модерният диагностичен метод на молекулярната биология, молекулярната генетика и клиничната лабораторна диагностика, позволяващ идентифицирането на отделни клетки от патогени на много инфекциозни заболявания в тъканите и биологичните течности на тялото.

PCR методът се основава на комплементарното завършване на участък от геномна ДНК или РНК на патогена, проведено in vitro с помощта на ензима термостабилна ДНК полимераза. Спецификата на метода се определя от уникалността на генетичния материал на откритите инфекциозни агенти, към който се подбират олигонуклеотидните праймери, участващи в процеса на амплификация.

Диагностика на инфекциозни заболявания, включително причинени от трудни за култивиране агенти, генотипиране на микроорганизми, оценка на тяхната вирулентност, определяне на устойчивостта на микрофлората към антибиотици, пренатална диагностика, биологичен мониторинг на кръвни продукти - това е непълен списък от области на медицината използвайки PCR. Днес PCR анализът остава най-разпространената и динамично развиваща се технология. Всяка година на пазара се появяват десетки нови тестови системи за PCR анализ, предназначени както за идентифициране на нуклеотидните последователности на различни микроорганизми, причиняващи заболявания, така и за изследване на човешки гени. Цената на PCR анализа непрекъснато намалява, което допринася за все по-широкото използване на метода в медицински и диагностични институции. Броят на PCR лабораториите в страните от ОНД нараства експоненциално и очевидно в близко бъдеще PCR анализът ще се превърне в един от най-разпространените методи за лабораторна диагностика.

1. ПРИНЦИП НА МЕТОДА PCR

Полимеразната верижна реакция е метод, който имитира естествената репликация на ДНК и позволява откриването на една специфична ДНК молекула в присъствието на милиони други молекули.

Същността на метода е многократно копиране (усилване) на определени участъци от ДНК в епруветка по време на повтарящи се температурни цикли. При всеки цикъл на амплификация предварително синтезираните фрагменти се копират отново от ДНК полимераза. Поради това има многократно увеличение на броя на специфичните ДНК фрагменти, което значително опростява по-нататъшния анализ.

PCR методът се основава на естествен процес - комплементарно допълване на ДНК матрицата, осъществявано с помощта на ензима ДНК полимераза. Тази реакция се нарича репликация на ДНК.

Естествената репликация на ДНК включва няколко етапа:

) денатурация на ДНК (развиване на двойната спирала, разминаване на ДНК вериги);

) Образуване на къси двойноверижни ДНК участъци (праймери, необходими за иницииране на ДНК синтеза);

) Синтез на нова ДНК верига (комплементарно завършване на двете вериги).

Този процес може да се използва за получаване на копия на къси участъци от ДНК, които са специфични за конкретни микроорганизми, т.е. извършват целенасочено търсене на такива специфични области, което е целта на генната диагностика за идентифициране на патогени на инфекциозни заболявания.

Откриване на термостабилна ДНК полимераза (Taq полимераза) от термофилни бактерии Thermisaquaticus, чийто оптимум е от порядъка на 70-72°C, направи възможно да се направи процесът на репликация на ДНК цикличен и да се използва за работа in vitro. Създаването на програмируеми термостати (усилватели), които извършват циклични температурни промени по зададена програма, създаде предпоставки за широкото въвеждане на PCR метода в практиката на лабораторната клинична диагностика. При многократни повторения на циклите на синтез се получава експоненциално увеличаване на броя на копията на специфичен ДНК фрагмент, което прави възможно получаването на достатъчен брой ДНК копия за тяхната идентификация от малко количество анализиран материал, който може да съдържа единични клетки на микроорганизми.

Комплементарното завършване на веригата не започва в която и да е точка на ДНК последователността, а само в определени начални блокове - къси двойноверижни участъци. Чрез прикрепването на такива блокове към определени участъци от ДНК е възможно да се насочи процесът на синтез на нова верига само в този участък, а не по цялата дължина на ДНК веригата. За създаване на начални блокове в дадени ДНК участъци се използват два олигонуклеотидни праймера (20 нуклеотидни двойки), наречени праймери. Праймерите са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че завършването на нова ДНК верига става само между тях.

По този начин PCR е многократно увеличаване на броя на копията (амплификация) на специфична ДНК област, катализирана от ензима ДНК полимераза.

. ЕТАПИ НА PCR АНАЛИЗ

Процедурата за анализ с помощта на метода PCR включва три етапа:

1. Изолиране на ДНК (РНК) от клинична проба;

2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти;

. Откриване на продукти на амплификация.

. Изолиране на ДНК (РНК).

На този етап от анализа клиничната проба се подлага на специална обработка, в резултат на която клетъчният материал се лизира, протеиновите и полизахаридните фракции се отстраняват и се получава разтвор на ДНК или РНК, свободен от инхибитори и готов за употреба. допълнително усилване. Изборът на техника за екстракция на ДНК (РНК) се определя главно от естеството на клиничния материал, който се обработва.

2. Амплификация на специфични ДНК фрагменти

На този етап се натрупват къси специфични ДНК фрагменти в количеството, необходимо за тяхното по-нататъшно откриване.

За провеждане на полимеразна верижна реакция в реакционната смес трябва да присъстват редица компоненти:

· Грундове- изкуствено синтезирани олигонуклеотиди, обикновено вариращи по размер от 15 до 30 bp, идентични на съответните участъци от целевата ДНК. Те играят ключова роля в образуването на продукти от реакцията на амплификация. Правилно подбраните праймери гарантират специфичността и чувствителността на тестовата система.

· Taq полимераза- термостабилен ензим, който осигурява завършване на 3 - краят на втората верига на ДНК според принципа на комплементарността.

· Смес от дезоксинуклеотид трифосфати (dNTPs)- дезоксиаденозин трифосфат (dATP), деоксигуанозин трифосфат (dGTP), дезоксицитозин трифосфат (dCTP) и дезокситимидин трифосфат (dTTP) - „строителният материал“, използван от Taq полимеразата за синтезиране на втората верига на ДНК.

· буфер -смес от катиони и аниони в определена концентрация, осигуряваща оптимални условия за реакцията, както и стабилна стойност на pH.

· Анализирана проба- препарат, приготвен за добавяне към реакционната смес, който може да съдържа желаната ДНК, например ДНК на микроорганизми, която служи като мишена за последващо многократно копиране.

Фиг.1 Компоненти на реакционната смес

Всеки цикъл на усилване включва 3 етапа, протичащи при различни температурни условия:

Етап 1:Денатурация на ДНК (разплитане на двойната спирала). Настъпва при 93-95°C за 30-40 секунди.

Една от веригите (+) се използва като основна матрица. Краищата на петте ленти са фиксирани от ензима ДНК полимераза, който осигурява изграждането на втора ДНК верига, комплементарна на първата, от отделни нуклеотиди. Същото нещо, само в обратна посока, се случва на втората верига на ДНК, но тъй като размотаването на ДНК молекулата протича в обратен ред, новата верига се изгражда на малки фрагменти, които след това се зашиват заедно. За да може ензимът ДНК полимераза да започне своята работа, е необходимо наличието на семе или праймер - малък едноверижен ДНК фрагмент, който, когато се свърже с комплементарния участък на една от родителските ДНК вериги, образува начален блок за отглеждане на дъщерната нишка.

Етап 2:Прикрепване на грундове (отгряване). Прикрепването на праймери се извършва комплементарно на съответните последователности на противоположни ДНК вериги в границите на специфичен регион. Всяка двойка праймери има собствена температура на отгряване, чиито стойности са в диапазона 50-65°C. Прецизно изчислената и експериментално проверена температура на отгряване на праймера е една от характеристиките, които определят специфичността на реакцията, изключвайки прикрепването на праймерите към непълно комплементарни последователности.

Тъй като растежът на дъщерни ДНК вериги може да се случи едновременно и на двете вериги на майчината ДНК, ДНК полимеразата на втората верига също изисква свой собствен праймер. Така към реакционната смес се добавят два праймера. Всъщност праймерите, прикрепени към противоположните вериги на ДНК молекулата, ограничават частта от нея, която впоследствие ще бъде дублирана или амплифицирана многократно. Такива ДНК фрагменти се наричат ​​ампликони. Дължината на един ампликон може да бъде няколко стотин нуклеотида. Чрез промяна на двойка праймери можем да преминем от анализиране на един патоген към анализиране на друг.

Време за отгряване -20-60 сек.

Етап 3:Завършване на ДНК веригите (удължаване).

Механизмът на копиране е такъв, че комплементарното добавяне на вериги не може да започне в която и да е точка на ДНК последователността, а само в определени начални блокове (къси двойноверижни секции). За създаване на начални блокове в дадени участъци от ДНК се използват праймери, които са олигонуклеотиди с дължина около 20 bp, наричани още праймери. Те са комплементарни на ДНК последователностите на лявата и дясната граница на специфичен фрагмент и са ориентирани по такъв начин, че ДНК синтезата, извършвана от ДНК полимераза, се извършва само между тях.

Комплементарното завършване на ДНК веригите протича от 5'-края към 3'-края на веригата в противоположни посоки, като се започне от местата на свързване на праймера. Материалът за синтеза на нови вериги на ДНК е въведеният дезоксирибонуклеотид фосфат. Този процес се катализира от ензима Tag полимераза. Новата ДНК, образувана в първия цикъл на синтеза, служи като изходен материал за втория цикъл, в който се образува желаният специфичен ДНК фрагмент (ампликон) и т.н.

Фиг.2 Принцип на амплификация на ДНК

В момента се използват няколко метода за приготвяне на проба за PCR. Процедурата за подготовка на пробата включва микробен лизис и екстракция на нуклеинова киселина. За унищожаване на микробната клетка се използва обикновено кипене, замразяване-размразяване в присъствието на лизозим, както и специални лизиращи буфери, съдържащи детергенти и протеиназа. Изборът на метод обикновено се диктува от естеството на микроба, по-точно естеството на неговата клетъчна стена. Методът за получаване на чист ДНК препарат, описан от B.R. Marmionetal, се счита за стандартен и вече е станал класически. (1993). Включва ензимна протеолиза, последвана от депротеинизация и утаяване на ДНК с алкохол. Този метод ви позволява да получите чист ДНК препарат, но е доста трудоемък и включва работа с такива агресивни и силно миришещи вещества като фенол и хлороформ.

Един от най-популярните е методът за екстракция на ДНК, предложен от R.Boometal. (1990), базиран на използването на силен лизиращ агент - гуанидин тиоцианат (GuSCN) за клетъчен лизис и последваща сорбция на ДНК върху носител (стъклени перли, диатомит, стъклено „мляко“ и др.). След промиване ДНК остава в пробата, сорбирана върху носителя, от който лесно се отстранява с помощта на елуиращ буфер. Методът е удобен, технологичен и подходящ за подготовка на проба за амплификация. Възможна е обаче загуба на ДНК поради необратима сорбция върху носителя, както и по време на многобройни измивания. Това е особено важно при работа с малки количества ДНК в проба. В допълнение, дори следи от GuSCN могат да инхибират PCR, така че при използването на този метод правилният избор на сорбент и внимателното спазване на технологичните нюанси са много важни. Трябва да се отбележи, че поради големия брой стъпки на добавяне и отстраняване на разтвори, е необходимо внимание при работа с пробата, тъй като е възможно кръстосано замърсяване между пробите и получения ДНК аерозол.

С класическата процедура за екстракция на ДНК с фенол-хлороформ се постига добро пречистване на ДНК, предимно от Tag полимеразни инхибитори, но големи загуби на нуклеинова киселина са неизбежни, особено забележими при работа с малки проби с ниска концентрация на инфекциозния агент.

Друга група методи за подготовка на проби се основава на използването на йонообменници като Chilex (САЩ), които, за разлика от стъклото, сорбират не ДНК, а примеси, които пречат на реакцията. По правило тази технология включва два етапа: кипене на пробата и сорбция на примеси върху йонообменник. Методът е изключително атрактивен поради своята простота на изпълнение. В повечето случаи е подходящ за работа с клиничен материал. За съжаление, понякога има проби с примеси, които не могат да бъдат отстранени с помощта на йонообменници. Освен това някои микроорганизми не могат да бъдат унищожени чрез обикновено кипене. В тези случаи е необходимо въвеждането на допълнителни етапи на обработка на пробите.

По време на масовия скрининг, когато е важно да се получат статистически данни, е възможно да се използват прости методи, като се използват детергенти или обработка на биологичен материал с основи и след това неутрализиране. В същото време използването на такива методи за клинична диагностика може да доведе до фалшиво отрицателни резултати поради използването на нискокачествен ДНК препарат в реакционната смес. По този начин изборът на метод за подготовка на пробата трябва да се вземе предвид с разбирането на целите на планирания анализ.

По време на следващата процедура - амплификация - проба, съдържаща ДНК на патогена, се въвежда в малка епруветка с компоненти, които осигуряват полимеразната реакция, два вида праймери, два ензима (Tag полимераза и N-урацил гликолаза) и четири вида нуклеотид A, G, Ts, U. За провеждане на полимеразната реакция се използва специално устройство (термоциклер или ДНК усилвател), което ви позволява автоматично да променяте температурата на реакционната смес според определена програма. В първия кръг на PCR, пробата се нагрява до температура от 94°C, за да се разделят двете комплементарни ДНК вериги. След това температурата пада до 40-60°C, в този момент праймерите се прикрепват към единична верига на ДНК, след което температурата отново се повишава до 72°C, когато полимеразната активност е най-изразена. Целият цикъл с температурни промени продължава по-малко от 3 минути.

За да оцените правилно резултатите от PCR, е важно да разберете, че този метод не е количествен. Теоретично продуктите на амплификация на единични целеви ДНК молекули могат да бъдат открити с помощта на електрофореза след 30-35 цикъла. На практика обаче това се прави само в случаите, когато реакцията протича при условия, близки до идеалните, което е рядкост. Особено голямо влияние върху ефективността на амплификацията има степента на чистота на ДНК препарата, т.е. наличието в реакционната смес на определени инхибитори, от които в някои случаи може да бъде изключително трудно да се отървете. Понякога, поради тяхното присъствие, дори десетки хиляди целеви ДНК молекули не могат да бъдат амплифицирани. По този начин често няма пряка връзка между първоначалното количество целева ДНК и крайното количество продукти на амплификация.

Използват се различни методи за визуализиране на резултатите от усилването. Най-често срещаната днес е електрофорезата, базирана на разделянето на ДНК молекулите по размер. За да направите това, пригответе плоча от агарозен гел, който е агароза, втвърдена след разтопяване в буфер за електрофореза при концентрация от 1,5-2,5% с добавяне на специално ДНК багрило, например етидиев бромид. Втвърдената агароза образува пространствена решетка. При изливане с гребени в гела се образуват специални ямки, в които впоследствие се добавят продукти за усилване. Гелната плоча се поставя в хоризонтален апарат за гел електрофореза и се свързва източник на постоянно напрежение. Отрицателно заредената ДНК започва да се движи в гела от минус към плюс. В този случай по-късите ДНК молекули се движат по-бързо от по-дългите. Скоростта на движение на ДНК в гела се влияе от концентрацията на агароза, силата на електрическото поле, температурата, състава на буфера за електрофореза и, в по-малка степен, състава на ДНК. Всички молекули с еднакъв размер се движат с еднаква скорост. Багрилото е включено (интеркалирано) от равнинни групи в ДНК молекули. След приключване на електрофорезата, която продължава от 10 минути до 1 час, гелът се поставя върху трансилюминаторен филтър, който излъчва светлина в ултравиолетовия диапазон (254 - 310 nm). Ултравиолетовата енергия, абсорбирана от ДНК при 260 nm, се прехвърля към багрилото, което го кара да флуоресцира в оранжево-червената област на видимия спектър (590 nm).

ДНК стандартът на желания микроорганизъм се използва като „положителна контрола“. Размерът на неспецифичните ампликони може да бъде по-голям или по-малък в сравнение с „положителната контрола“. В най-лошия случай тези размери могат да съвпаднат и се отчитат като положителни при електрофореза.

„Положителна контрола“ ви позволява да се уверите, че всички компоненти, включени в реакционната смес, осигуряват нормално протичане на реакцията. В същото време, ДНК препарат, приготвен за PCR от биологичен материал, може да съдържа примеси от инхибитори, които значително намаляват ефективността на реакцията и в някои случаи водят до липса на специфични ампликони дори в присъствието на желания патоген. Необходимо е да се следи хода на амплификацията във всяка епруветка с реакционната смес, за което се използва допълнителен т. нар. „вътрешен контрол“, който е всеки ДНК стандарт, който е различен от ДНК на желания микроорганизъм.

За инфекциозни тестови системи понякога се използва например генът p-globin, към краищата на който с помощта на манипулации на генното инженерство се пришиват ДНК участъци, хомоложни на праймерите, включени в тестовата система. Ако към реакционната смес се добави „вътрешен контрол“, той ще стане същата мишена за отгряване на праймера като хромозомната ДНК на желания инфекциозен агент. Размерът на вътрешния контролен продукт на амплификация е избран така, че да е 2 или повече пъти по-голям от ампликоните, образувани от амплификацията на желаната ДНК на микроорганизъм. В резултат на това, ако към реакционната смес заедно с тестовата проба се добави ДНК „вътрешен контрол“, тогава, независимо от наличието на микроорганизъм в биологичната проба, „вътрешният контрол“ ще предизвика образуването на специфични ампликони, но значително по-дълъг (по-тежък) от ампликона на микроорганизма. Наличието на тежки ампликони в реакционната смес показва нормалния ход на реакцията на амплификация и отсъствието на инхибитори. Ако не се образуват ампликони с необходимия размер и „вътрешен контрол“, можем да заключим, че в анализираната проба има нежелани примеси, които трябва да бъдат елиминирани, но не и за липсата на желаната ДНК.

Въпреки цялата привлекателност на този подход, той има значителен недостатък. По този начин, ако желаната ДНК присъства в реакционната смес, тогава ефективността на нейното усилване рязко намалява поради конкуренцията с „вътрешния контрол“ за праймери. Това е фундаментално важно при ниски концентрации на ДНК в тестовата проба и може да доведе до фалшиво отрицателни резултати. Въпреки това, при условие че проблемът с конкуренцията за праймери е решен, този метод за наблюдение на ефективността на усилване със сигурност ще бъде много полезен.

Фиг. 3 Втори цикъл на амплификация на ДНК

. Откриване на продукти на амплификация

). Метод на хоризонтална електрофореза

Един от методите за визуализиране на резултатите от амплификацията е методът на електрофорезата, базиран на разделянето на ДНК молекулите по размер. В повечето методи на този етап сместа от продукти на амплификация, получена на 2-ри етап, се разделя чрез хоризонтална електрофореза в агарозен гел. Преди електрофоретично разделяне, разтвор на етидиев бромид се добавя към амплификационната смес, която образува силни интерстициални съединения с двойноверижни ДНК фрагменти. Тези съединения са способни да флуоресцират при UV облъчване, което се записва под формата на светещи ленти след електрофоретично разделяне на амплификационната смес в агарозен гел. Яркостта на лентите на продукта за усилване може да варира. Поради това често е обичайно в PCR лабораториите да се оценява резултатът с помощта на три-, четири- или пет-точкова система. Въпреки това, той не може да бъде свързан с първоначалното количество на целевата ДНК в пробата. Често намаляването на яркостта на лентите е свързано с намаляване на ефективността на усилване под въздействието на инхибитори или други фактори.

Фиг.4 Откриване на продукти на амплификация чрез хоризонтална електрофореза

). Метод на вертикална електрофореза

Методът на вертикалната електрофореза е фундаментално подобен на хоризонталната електрофореза. Тяхната разлика е, че в този случай вместо агароза се използва полиакриламид. Извършва се в специална камера за вертикална електрофореза. Електрофорезата с полиакриламиден гел има по-голяма разделителна способност в сравнение с агарозната електрофореза и позволява разграничаване на ДНК молекули с различни размери с точност до един нуклеотид. Приготвянето на полиакриламиден гел е малко по-сложно от агарозния гел. Освен това акриламидът е токсично вещество. Тъй като рядко възниква необходимостта от определяне на размера на продукта на амплификация с точност до 1 нуклеотид, този метод не се използва в рутинна работа.

3). Хибридизационен пробен метод

Като алтернатива на метода за електрофоретично откриване, който има някои недостатъци: субективизъм при разчитане на резултатите, ограничения при определяне на ДНК на различни микроорганизми в една реакция, могат да бъдат предложени схеми за откриване на хибридизация. В тези схеми ДНК фрагментът, образуван в резултат на амплификация, се хибридизира (образува 2-верижни комплекси - "хибриди") със специфична олигонуклеотидна сонда. Регистрирането на такива комплекси може да се извърши колориметрично или флуориметрично.

3. МЕТОД ЗА PCR В РЕАЛНО ВРЕМЕ (PCR в реално време)

Методът PCR в реално време дава възможност да се открият продуктите на амплификация по време на реакцията и да се наблюдава кинетиката на натрупване на ампликони. За откриване на PCR продукт се използват флуоресцентни багрила, които осигуряват флуоресценция, правопропорционална на количеството на PCR продукта - репортерна флуоресценция. Механизмите за неговото генериране варират в зависимост от конкретния тип PCR в реално време.

Кинетичната крива в координатите „Ниво на репортерна флуоресценция – цикъл на усилване” има S-образна форма.

Може да се раздели на три етапа:

1.Начален етап (когато PCR продуктите все още не са открити от флуоресцентен етикет).

2.Експоненциален етап (при който има експоненциална зависимост на количеството флуоресценция от PCR цикъла).

.Плато (етап на насищане).

Фиг.5 Графика на кинетична крива на флуоресценция с помощта на PCR в реално време

Регистрацията на флуоресцентния сигнал се извършва по време на процеса на амплификация на специално устройство - термоциклер за Real-Time PCR. Въз основа на увеличаването на интензитета на флуоресцентния сигнал, концентрацията на първоначалния ДНК шаблон се изчислява с помощта на софтуера, доставен с усилвателя.

Предимства на метода PCR в реално време

н способността за откриване на натрупване на продукти на амплификация директно по време на амплификация;

н основното предимство е възможността за откриване на натрупване на ампликони без отваряне на епруветката, което минимизира риска от фалшиво положителни резултати поради замърсяване на проби и реагенти с продукти на амплификация;

н значително намаляване на броя на манипулациите с тестовата проба намалява времето, опростява анализа и намалява вероятността от грешки;

н Този подход позволява да се елиминира етапът на електрофореза, което води до рязко намаляване на вероятността от замърсяване на тестовите проби с продукти на амплификация;

н намаляване на изискванията за PCR лаборатории;

н повишаване на обективността на интерпретацията на резултатите от PCR изследване, тъй като обработката се извършва с помощта на софтуера на устройството;

н Общото време за изследване е значително, почти наполовина, което позволява резултатите да се получат в рамките на 1,5 - 2 часа след пристигането на клиничния материал в лабораторията;

н Този метод позволява за първи път да се определи количествено съдържанието на ДНК на микроорганизъм в клинична проба;

н използването на хибридизационни проби заедно с праймери повишава специфичността на анализа;

н възможността за независима едновременна регистрация на флуоресцентния сигнал от няколко хибридизационни ДНК сонди позволява идентифицирането в едно изследване на няколко различни региона на една и съща или различни ДНК цели.

. ПРЕДИМСТВА НА МЕТОДА PCR

н Директно идентифициране на патогени на инфекциозни заболявания

PCR методът дава директна индикация за наличието на специфичен ДНК фрагмент на патогена в материала, взет от пациента.

н Висока специфичност на PCR

С помощта на PCR метода в изследвания материал се изолира ДНК фрагмент, който е уникален за определен патоген - бактерия или вирус. Този участък от ДНК е уникален и не е типичен за никоя инфекция на земята. Специфичността се определя от нуклеотидната последователност на праймерите, което елиминира възможността за получаване на фалшиви резултати, за разлика от метода на ензимно-свързания имуносорбентен анализ, където често се срещат грешки, дължащи се на кръстосано реагиращи антигени.

н PCR с висока чувствителност

PCR методът ви позволява да откриете дори единични клетки от бактерии или вируси. PCR диагностиката открива наличието на патогени на инфекциозни заболявания в случаите, когато това не може да се направи с други методи (имунологични, бактериологични, микроскопски). Чувствителността на PCR анализа е 10-1000 клетки на проба (чувствителността на имунологичните и микроскопските тестове е 103-105 клетки).

н Универсалността на PCR

Тъй като патогенът може да се съдържа във всякакви биологични секрети и тъкани, PCR изследванията могат да използват почти всякакви материали, включително тези, които са недостъпни за изследване с други методи - слуз, урина, кръв, серум, храчки, еякулат, изстъргвания от епителни клетки.

н Висока скорост на получаване на резултати от PCR анализ

PCR анализът не изисква изолиране и отглеждане на култура на патогена, което отнема много време. Унифициран метод за обработка на биоматериал и откриване на реакционни продукти и автоматизация на процеса на амплификация позволява провеждането на пълен анализ за 4-4,5 часа.

н Възможност за диагностициране на всякакъв вид инфекция

Високата чувствителност на PCR метода позволява да се диагностицира инфекция не само в острия стадий на заболяването, но и хронични инфекции и дори наличието на отделни бактерии или вируси.

Понастоящем предимството на PCR анализа пред културния метод за откриване на микроорганизми е следното:

По-висока честота на откриване на микроба, надвишаваща същия показател при използване на метода на култура с 6-7%. Тези разлики се обясняват с възможната смърт на микроба по време на съхранение и транспортиране, докато PCR е в състояние да открие нежизнеспособни форми на микроорганизма.

Времето, необходимо за откриване на патоген чрез метода на културата, е около 4 дни, докато използването на PCR позволява откриване на микроба за 4-5 часа.

Използването на PCR технология позволява откриването на патогени, като хламидия, в проби, взети неинвазивно, като урина.

PCR методът е особено ефективен за диагностика на трудни за култивиране, некултивирани и персистиращи форми на микроорганизми, които често се срещат при латентни и хронични инфекции, тъй като този метод избягва трудностите, свързани с отглеждането на такива микроорганизми в лабораторни условия.

н Възможност за изнасяне наблюдение и оценка на ефективността на терапията, особено при вирусни заболявания.

н Възможност за откриване отделни подвидове и щамове на вируси и бактерии.

н Възможност за дефиниране няколко вида патогени (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) от една епруветка с биологичен материал.

Този метод е сравним по трудоемкост с класическите методи (ензимен имуноанализ, имунофлуоресценция и др.), Но предоставя по-надеждна диагностична информация, позволяваща директно откриване на ДНК или РНК на инфекциозен агент в клиничен материал. Следователно методът PCR, заедно с метода на културата, е признат за „златен стандарт“ за диагностициране на инфекциозни заболявания.

5. ОГРАНИЧЕНИЯ НА МЕТОДА PCR

· По време на реакцията се усилва ДНК както на живи, така и на мъртви микроорганизми

· Възможност за кръстосана реакция

Изборът на праймери се основава на съществуващите познания за генома на даден и подобни микроорганизми. Теоретично съществува възможност същият фрагмент да присъства в други микроорганизми, чийто геном в момента не е дешифриран и които не са тествани за възможност за кръстосана реакция. Наличието на такива микроорганизми в пробата може да доведе до фалшиво положителен резултат от теста.

· Изменчивост на микроорганизмите

Въпреки че при конструирането на тестова система фрагментът на генома, използван за амплификация, е избран от силно консервативна област, променливостта на микроорганизмите може да доведе до факта, че някои генотипове или щамове на изследвания патоген могат да придобият мутации в амплифицираната област на генома и по този начин стават неуловими за тази тестова система.

Последните две точки са важни за разработчиците на PCR диагностични комплекти. Сега са разработени стандарти за регулиране на количеството тестване (включително тестване за кръстосани реакции, както и тестване на известни щамове на патогена, който се открива), на които трябва да бъде подложена тестовата система, преди да достигне до пазара.

6. ПРИЛОЖЕНИЕ НА МЕТОДА PCR

полимеразна диагностика на инфекциозни заболявания

PCR се използва в много области за анализ и научни експерименти:

1. криминалистика

PCR се използва за сравняване на така наречените „генетични пръстови отпечатъци“. Необходима е проба от генетичен материал от местопрестъплението - кръв, слюнка, сперма, коса и др. Това се сравнява с генетичния материал на заподозрения. Достатъчно е много малко количество ДНК, теоретично едно копие. ДНК се разгражда на фрагменти и след това се амплифицира с помощта на PCR. Фрагментите се разделят с помощта на ДНК електрофореза. Полученият модел на подреждането на ДНК лентите се нарича генетичен пръстов отпечатък.

2. установяване на бащинство

При анализ на резултатите от електрофореза на ДНК фрагменти, амплифицирани с помощта на PCR баща-дете-майка, се открива, че детето ще наследи някои характеристики на генетичния отпечатък на двамата родители, което дава уникален отпечатък. Въпреки че генетичните пръстови отпечатъци са уникални (освен в случай на еднояйчни близнаци), семейните връзки все още могат да бъдат установени чрез вземане на няколко пръстови отпечатъка. Същият метод може да се приложи, леко модифициран, за установяване на еволюционна връзка между организмите.

3. медицинска диагностика

PCR позволява значително да се ускори и улесни диагностицирането на наследствени и вирусни заболявания. Интересуващият ген се амплифицира чрез PCR с помощта на подходящи праймери и след това се секвенира за идентифициране на мутации. Вирусните инфекции могат да бъдат открити веднага след заразяването, седмици или месеци преди появата на симптомите.

4. генно клониране

Генното клониране е процес на изолиране на гени и в резултат на генно инженерни манипулации получаване на голямо количество от продукта на даден ген. PCR се използва за амплифициране на ген, който след това се вмъква във вектор - част от ДНК, която прехвърля чужд ген в същия или друг удобен за отглеждане организъм. Например плазмиди или вирусна ДНК се използват като вектори. Вмъкването на гени в чужд организъм обикновено се използва за получаване на продукта от този ген – РНК или най-често протеин. По този начин се получават много протеини в индустриални количества за използване в селското стопанство, медицината и т.н.

5. ДНК секвениране

В метода за секвениране, използващ дидезоксинуклеотиди, маркирани с флуоресцентен етикет или радиоактивен изотоп, PCR е неразделна част, тъй като по време на полимеризацията производните на нуклеотиди, маркирани с флуоресцентен или радиоактивен етикет, се вмъкват в ДНК веригата. Това спира реакцията, позволявайки да се определят позициите на специфични нуклеотиди, след като синтезираните вериги са разделени в гела.

6. мутагенеза

В момента PCR се превърна в основен метод за извършване на мутагенеза (промяна на нуклеотидната последователност на ДНК). Използването на PCR направи възможно да се опрости и ускори процедурата на мутагенеза, както и да я направи по-надеждна и възпроизводима.

7. диагностика на инфекциозни заболявания

Използването на PCR метода за диагностициране на инфекциозни заболявания от бактериална и вирусна природа е от огромно значение за решаването на много проблеми на микробиологията и епидемиологията. Използването на този метод също допринася за развитието на фундаментални изследвания в областта на изучаването на хронични и слабо разбрани инфекциозни заболявания.

8. диагностика на вирусни заболявания

Най-изчерпателните ползи от PCR при диагностицирането на вирусни заболявания могат да бъдат демонстрирани чрез разглеждане на инфекциозния процес, причинен от вируса на хепатит С (HCV). PCR е от особена диагностична стойност за откриване на този вирус поради следните причини:

) липса на метод за култивиране на HCV; 2) не съществуват комплекти за диагностика на антигени; 3) реакцията на образуване на антитела срещу HCV е толкова бавна, че диагнозата по време на острата фаза на инфекцията по правило не може да бъде направена.

Следователно използването на PCR технология за диагностика, контрол на качеството на лечението и епидемиологичен анализ на заболеваемостта, причинена от HCV, вече става общоприето.

В същото време само PCR технологията позволява решаването на следните проблеми: 1) диагностициране на остра инфекция с късно откриване на антитела срещу HCV; 2) извършва етиологична диагностика на хроничен хепатит С при имуносупресирани пациенти; 3) оценка на ефективността на антивирусната терапия; 4) откриване на виремия при кръводарители с нормални нива на аминотрансфераза; 5) определяне на възможно замърсяване на кръвни продукти; 6) оценка на разпространението на HCV.

9. приложение на PCR в пулмологията и фтизиатрията

Честа причина за атипична пневмония и рецидивиращ хроничен бронхит са микоплазмите и хламидиите. Диагностиката на тези патогени с помощта на традиционните методи на микроскопия и бактериална култура е неефективна. PCR позволява не само да се диагностицира хламидия и микоплазмоза, но и да се извърши видова идентификация на патогена (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Използването на PCR метода може значително да подобри ранната диагностика на туберкулозата. В момента са разработени и се появиха на пазара PCR комплекти за определяне на резистентността на микобактериите към антибиотици.

10. Приложение на PCR в кръвната служба

Изследването на донорска кръв за хепатит, сифилис, ХИВ чрез серологични методи не изключва опасността от използване на заразена кръв поради наличието на определен серонегативен период за тези заболявания, който може да бъде до няколко седмици от момента на появата на патогена в кръв. Най-ефективният метод за изследване на кръвта за наличието на тези патогени е PCR методът.

11. приложение на PCR в неонатологията

Редица микроорганизми могат да заразят плода по време на бременност. Това са цитомегаловирус, токсоплазма, херпес вирус, вирус на рубеола, микоплазма, хламидия и др. Използването на серологични тестове за определяне на тези инфекции при новородени е неефективно, тъй като формирането на имунната система на детето се извършва в продължение на няколко месеца и наличието на инфекциозният агент може да не е придружен от производството на специфични антитела. От друга страна, майчините антитела от клас IgG могат да присъстват в кръвта на новороденото дълго време, способни да проникнат през плацентарната бариера. По този начин наличието на специфичен IgG при дете през първите месеци от живота не показва наличието на патоген. Използването на PCR анализ значително увеличава възможностите за диагностициране на неонатални инфекции, включително на вътрематочен етап.

12. приложение на PCR в урогинекологичната практика

Сред инфекциозните агенти, засягащи урогениталния тракт, напоследък голямо внимание се обръща на причинителите на латентни и хронични инфекции - хламидия и микоплазма. Заболяванията, причинени от тези патогени, се характеризират със замъглени клинични симптоми и хроничен ход, често водещи до увреждане на репродуктивните функции - спонтанен аборт, безплодие. Многобройни проучвания, изследващи използването на PCR метода за откриване на Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, проведени в големи клиники в различни страни, показват високата ефективност на този метод. Признато е, че по чувствителност и ефективност PCR превъзхожда метода на културата, приет като „златен стандарт“.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

По този начин PCR технологията е мощен инструмент, който осигурява възможност за изследване и диагностика на хронични инфекциозни процеси и екологията на патогените на инфекциозни заболявания. PCR диагностичният метод допълва съществуващите методи за микробиологична диагностика и качествено променя методологията за решаване на приложни проблеми на медицинската микробиология и епидемиология.

Като вземем предвид горното, ще формулираме области на изследване в инфекциозната патология, в които PCR започва да играе водеща роля.

Диагностика на хронични инфекциозни състояния, причинени от персистирането на бактерии или вируси. Това е най-очевидното приложение на PCR за диагностични цели.

PCR е най-ефективният метод за идентифициране и изследване на патогени, които, намирайки се в „некултивирано“ състояние, могат да се задържат там, оцелявайки при неблагоприятни външни условия.

PCR позволява определяне на антибиотична резистентност при бавнорастящи и трудни за култивиране бактерии.

Обещаващи области за практическо използване на PCR диагностиката са:

· диагностика на онкологични заболявания;

· диагностика на левкемия и лимфоми;

· диагностика на рак на гърдата;

· диагностика на други злокачествени заболявания;

ДНК диагностиката на доброкачествени и злокачествени неоплазми е ограничена от малко, но нарастващо количество информация за гените, свързани с тези заболявания;

· диагностика на генетични заболявания.

Диагнозата на генетичните заболявания може да се развие само след задълбочени научни изследвания на човешкия геном. Въпреки това, медицинската общност вече е признала значението на изучаването на генетичната основа на заболяванията, както и възможността за диагностициране и лечение на заболяване, преди симптомите му да се появят;

· персонална идентификация: съдебна медицина, криминология; трансплантация на органи и тъкани; определяне на бащинство. Експертите оценяват тази област на пазара на ДНК диагностика като една от най-големите и най-бързо развиващите се;

Често се използва като бърз метод за индикация и идентифициране на вируси.

Този метод е разработен за първи път от K. Mullis (САЩ) през 1983 г. Поради високата си чувствителност, специфичност и лекота на прилагане, той намира широко приложение в генетиката, съдебната медицина, диагностиката и други области.

Същността на метода е амплификация, т.е. увеличаване на броя на копията на строго определени фрагменти от ДНК молекула in vitro. Този метод използва матричен механизъм и принципа на комплементарността. Две единични полинуклеотидни вериги (нуклеинови киселини) могат да бъдат свързани чрез водородни връзки в една двойноверижна верига, ако нуклеотидните последователности на едната съвпадат точно с нуклеотидната последователност на другата, така че техните азотни бази да могат да образуват аденин-тимин и гуанин-цитозин двойки.

PCR се основава на ДНК амплификация с помощта на термостабилна ДНК полимераза, която синтезира взаимно допълващи се ДНК вериги, започвайки с два праймера. Праймерът е ДНК фрагмент, състоящ се от 20-30 нуклеотида. Тези праймери са комплементарни на противоположните ДНК вериги. По време на синтеза на ДНК праймерите се вмъкват във веригата от новосинтезирани ДНК молекули.

Обикновено PCR се извършва в 25-40 цикъла. Всеки цикъл включва три етапа: първият е денатурация при 92-95 °C. В този случай двете ДНК вериги се разминават; второто е отгряване или добавяне на праймери при 50-65 ° C; третото е удължаване или полимеризация при 68-72 ° C, докато ДНК полимеразата извършва допълнително завършване на веригите на ДНК шаблона, използвайки четири вида нуклеотиди. В резултат на един цикъл желаният генетичен материал се удвоява. ДНК веригите, образувани в първия цикъл, служат като шаблони за втория цикъл и т.н. След първия цикъл се амплифицира само фрагментът между двата праймера. По този начин броят на копията на амплифицираната област се удвоява, което прави възможно синтезирането на милиони (2 n) ДНК фрагменти в 25-40 цикъла - количество, достатъчно за тяхното индикиране чрез различни методи (методът на хибридизационните проби, съдържащи определен етикет, електрофореза и др.). По-често за тази цел се използва електрофореза в агарозен гел с оцветяване с етидиев бромид.

При PCR от ДНК участъци на патоген се използват праймери, които имат уникална последователност от нуклеотиди, характерни само за определен патоген.

Процедурата за извършване на PCR се свежда до следното: от изследвания материал се изолира ДНК матрица; в епруветка изолираната ДНК се комбинира със смес за амплификация, която включва ДНК полимераза, всичките 4 вида нуклеотиди, 2 вида праймери, MgCl, буфер, дейонизирана вода и минерално масло. След това епруветките се поставят в циклер и амплификацията се извършва автоматично по зададена програма, съответстваща на вида на патогена. Резултатите се записват по-често чрез електрофореза в 1-2% агарозен гел в присъствието на етидиев бромид, който се свързва с ДНК фрагменти и се разкрива под формата на светещи ивици, когато гелът се облъчва с UV лъчи на трансилюминатор. Всички PCR процедури отнемат 1-2 работни дни.

За повишаване на специфичността и чувствителността на PCR се използват различни варианти: вложена PCR; PCR с "горещ старт" с помощта на парафинов слой или блокиране на активните центрове на полимеразата с моноклонални антитела. В допълнение, някои компании произвеждат комплекти лиофилизирани реагенти за амплификация на ДНК, които ускоряват PCR процеса и намаляват възможността за фалшиво положителни резултати.

В момента се въвежда нова технология - PCR в реално време. Основната му характеристика е мониторинг и количествен анализ на натрупването на продукти от полимеразна верижна реакция и автоматично регистриране и интерпретиране на получените резултати. Този метод не изисква етап на електрофореза, което намалява лабораторните изисквания за PCR. PCR в реално време използва флуоресцентно белязани олигонуклеотидни сонди за откриване на ДНК, докато се усилва. PCR в реално време позволява пълен анализ на проба в рамките на 20-60 минути и теоретично е начин за откриване дори на една ДНК или РНК молекула в проба.

Системата за откриване на продукта в полимеразна верижна реакция в реално време (PCR мониторинг) ви позволява да наблюдавате натрупването на амплифицирана ДНК цикъл по цикъл. Системата също така включва олигонуклеотидна проба, която е способна да се прикрепи (хибридизира) към вътрешния сегмент на целевата ДНК. Сондата е белязана в 5' края с флуоресцентно репортерно багрило и в 3' края с блокиращо багрило (гасително багрило). Тъй като PCR продуктът се натрупва, сондата се хибридизира с него, но не се появява луминисценция поради близостта между репортера и блокера. В резултат на копиране на последователността, полимеразата достига 5' края на сондата. 5'-3' екзонуклеазната активност на полимеразата отделя флуоресцентния етикет от 3' края на сондата, като по този начин освобождава флуоресцентния репортер от връзката му със сигналния блокер, което води до увеличаване на флуоресценцията. Следователно нивото на флуоресценция е пропорционално на количеството на специфичния реакционен продукт. Важно е резултатите от PCR да се записват чрез наличие на флуоресценция в затворени епруветки и по този начин се решава друг от основните проблеми на този метод - проблемът с контаминацията с ампликони.

Предимства на PCR: скорост на анализ; висока чувствителност и специфичност; минимално количество тестов материал; простота на изпълнение и възможност за пълна автоматизация.

Поради факта, че чувствителността на PCR може да достигне до откриването на едно копие на ДНК шаблона, съществува висока степен на опасност от получаване на фалшиво положителни резултати. Ето защо, при извършване на PCR изследване, лабораторията за генетична диагностика трябва стриктно да спазва специални изисквания за оформление и режим на работа.

PCR е един от съществуващите допълващи методи във вирусологичната диагностика. Тази реакция е много важна за диагностицирането на вирусни инфекции, когато вирусни антигени или вирус-специфични антитела не могат да бъдат открити и когато наличието на вирусна нуклеинова киселина може да бъде единственото доказателство за инфекция, особено при латентни и смесени инфекции.

Ако намерите грешка, моля, маркирайте част от текста и щракнете Ctrl+Enter.

Полимеразната верижна реакция е известна от 30 години. Той се използва широко в много области, от археология до генетика.

Това е PCR методът, който помага за установяване на бащинство, но най-често се използва за идентифициране на различни инфекциозни заболявания в човешкото тяло.

Как се извършва PCR анализът и какво представлява? Ще се опитаме да отговорим подробно на тези въпроси.

PCR анализ - какво е това?

Полимеразната верижна реакция (PCR) е високоточен молекулярно-генетичен диагностичен метод, който ви позволява да идентифицирате различни инфекциозни и наследствени заболявания при хората, както в остър, така и в хроничен стадий, и много преди болестта да се прояви.

PCR методът е абсолютно специфичен и при правилно изпълнение не може да даде фалшиво положителен резултат. Тоест, ако няма инфекция, тогава анализът никога няма да покаже, че тя съществува. Ето защо сега много често, за да потвърдят диагнозата, те допълнително правят PCR тест, за да определят патогена и неговия характер.

Полимеразната верижна реакция (PCR) е разработена от Кари Мълис (САЩ) през 1983 г., за което той получава Нобелова награда за химия през 1993 г.

Какво е предимството на този метод?

Диагностиката по този метод ви позволява да намерите патогена директно в гена, който се съдържа в изследваните материали. Това е най-точният тест за полово предавани инфекции, скрити инфекции и различни полово предавани болести.

Разлики между PCR диагностика и други лабораторни методи за изследванеса както следва:

• методът е насочен към идентифициране на самия патоген;
• Диагностиката с помощта на PCR метода се отличава със своята гъвкавост: за откриване на няколко патогена;
• заболявания, достатъчна е само една биологична проба от пациента;
• методът е силно чувствителен и не е придружен от други кръстосани реакции.

В допълнение, предимството на PCR диагностиката е, че всеки биологичен материал на пациента е подходящ за анализ: кръв, генитални секрети, урина, сперма.

Какви инфекции може да открие PCR цитонамазка?

В тялото могат да присъстват голям брой инфекциозни агенти, включително „скрити“, които не се проявяват дълго време.

PCR анализ на цитонамазка ви позволява да откриете такива инфекции:

• уреплазмоза на гениталните органи;
• кандидоза ();
• херпес;
• наличие на ракови клетки;
• оценка на хормоналния статус;

Тестовият материал за PCR обикновено е храчка, слюнка, урина и кръв. Преди да извършите анализа, трябва внимателно да се подготвите за него, като първо се консултирате с лекар.

Кръвта за PCR обикновено се дарява на празен стомах. Добри резултати се показват при анализ, когато материалът за изследване се взема от цервикалния канал или уретрата. В този случай е най-добре да се извърши PCR диагностика не по-късно от един ден след полов акт.

Видове PCR

PCR се използва в много области за тестване и научни експерименти. Има различни методи за анализ:

1. PCR с обратна транскрипция(PCR с обратна транскрипция, RT-PCR) – използва се за амплифициране, изолиране или идентифициране на известна последователност от РНК библиотека.
2. Обърнат PCR(Инверсна PCR) - използва се, когато е известен само малък регион в желаната последователност. Този метод е особено полезен, когато става въпрос за определяне на съседни последователности след вмъкване на ДНК в генома.
3. Вложената PCR се използва за намаляване на броя на страничните продукти на реакцията. Използват се две двойки праймери и се провеждат две последователни реакции.
4. Асиметричен PCR(англ. Asymmetric PCR) - провежда се, когато е необходимо да се амплифицира предимно една от веригите на оригиналната ДНК. Използва се в някои техники за секвениране и хибридизационен анализ.
5. Количествен PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (на английски)) или PCR в реално време - използва се за директно наблюдение на измерването на количеството на специфичен PCR продукт във всеки реакционен цикъл.
6. Стъпка по стъпка PCR (Touchdown PCR) - с помощта на този подход се намалява влиянието на неспецифичното праймерно свързване.
7. Групово-специфична PCR(англ. group-specific PCR) - PCR за свързани последователности в рамките на същия или между различни видове, като се използват консервативни праймери за тези последователности.

Ако нуклеотидната последователност на матрицата е частично известна или изобщо неизвестна, могат да се използват изродени праймери, чиято последователност съдържа изродени позиции, в които може да бъде разположена всяка база. Например последователността на праймера може да бъде: ...ATH..., където H е A, T или C.

Какви биологични материали се изследват?

Различни биологични среди и човешки течности могат да служат като материал за PCR изследване, в което може да се открие чужда бактериална ДНК или вирусна ДНК или РНК:

1. Урина. Може да се използва при инфекции на пикочно-половата система при мъжете и пикочните органи при жените (при мъжете използването на урина като материал замества остъргването на епитела).
2. храчки. Използва се за диагностициране на туберкулоза и по-рядко за диагностициране на респираторни форми на хламидия и микоплазмоза. Храчките в количество от 15-20 ml се събират в стерилна бутилка (за еднократна употреба).
3. Биологични течности. Простатен сок, плеврална, спинална, амниотична течност, ставна течност, бронхоалвеоларен лаваж, слюнка се събират според показанията.
4. Епителни изстъргвания от лигавиците. Обикновено се използва за диагностициране на полово предавани болести (ППБ), като гонорея, хламидия, микоплазмоза, уреаплазмоза, трихомониаза, гарднерелоза, херпес и други инфекции, които засягат лигавиците.
5. Биопсии. Най-често се използват биопсии на стомаха и дванадесетопръстника за откриване на инфекция с Helicobacter pylori.
6. Кръв, плазма, серум. Използва се за PCR анализ на хепатит B, C, D, G, херпес, CMV, HIV вируси и изследване на човешки гени.

Как да се подготвим за теста?

Надеждността на резултата от PCR директно зависи от правилното подаване на материала за изследване. Материалът не трябва да бъде замърсен, в противен случай резултатът от изследването няма да бъде обективен. Най-важните препоръки преди провеждане на PCR тест включват следните изисквания:

1. Урината се събира сутрин в стерилен съд.
2. Кръвният тест за инфекции трябва да се вземе сутрин на празен стомах.
3. Не трябва да сте сексуално активни в деня преди теста.

Резултатът от анализа ще бъде готов 1,5-2 дни след въпросната процедура. Има ситуации, когато резултатът може да бъде подготвен в същия ден.

Декодиране на OPC анализа

Процесът на интерпретиране на представеното изследване се отличава със своята простота. Резултатите от PCR анализа могат да бъдат получени 1,5-2 дни след предаването на материала. В някои случаи резултатът е готов на първия ден, а ето какво могат да означават:

• Отрицателен резултатпоказва, че диагностичният материал не съдържа желания инфекциозен агент.
• PCR положителенозначава, че ДНК или РНК на патогена присъства в човешкото тяло.

В някои случаи микроорганизмите се определят количествено. Това важи особено за заболявания, причинени от опортюнистични микроорганизми. Тъй като тези бактерии проявяват своите отрицателни ефекти само в излишни количества.

Също така, количественият PCR анализ е важен за избора на терапевтични тактики и за целите на наблюдението на лечението на вирусни инфекции като ХИВ и вируси на хепатит.

Колко точна е PCR диагностиката на инфекциите?

PCR методът се характеризира с висока точност, специфичност и чувствителност. Това означава, че този анализ може да:

• точно определяне на наличието или отсъствието на инфекция;
• посочете точно за какъв вид инфекция става въпрос (специфичност);
• откриване на инфекция дори при много ниско съдържание на микробна ДНК в биологичен материал,
• който е тестван (чувствителност).

PCR анализ: цена и условия

Цената на конкретен тест ще зависи от това за каква инфекция ще бъдете тествани. Ориентировъчни цени и срокове:

1. STI: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
2. Вирус на Epstein-Barr, човешки папиломен вирус, херпес, цитомегаловирус: 300-500 рубли, срокове - 1 ден;
3. Хепатит A, B, C, D, G: качествен анализ 650 рубли, количествен анализ 2000 рубли. Срокове – до 5 дни;
4. Антитела срещу вируса на хепатит С, общи (Anti-HCV) - 420 рубли;
5. Антитела срещу вируса на хепатит С, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 рубли;
6. Helicobacter pylori: 300-400 рубли, срокове - 1 ден;
7. ХИВ (антитела и антигени) – 380 рубли;
8. ХИВ РНК, високо качество – 3500 рубли;
9. ХИВ РНК, количествено - 11 000 рубли.

За да спестите пари, можете да изберете фиксиран пакет за анализ. Тази услуга се предоставя от повечето клиники, където можете да се изследвате по метода PRC (инвитро, онклиника и др.).

Извършването на PCR анализ (PCR диагностика) започва с вземането на материал за изследване от гинеколог, уролог или дерматовенеролог. Качеството и надеждността на получените впоследствие резултати се осигуряват от най-високата квалификация и богатия опит на лекарите от медицински център Euromedprestige, които спазват всички необходими правила за провеждане на PCR анализ: пълна стерилност, използване само на материали за еднократна употреба.

Събраният материал от четката се поставя в съд с физиологичен разтвор. След вземането пробите трябва да бъдат доставени в PCR лабораторията възможно най-скоро.

PCR анализът се извършва в лабораторията на три етапа:

1. Екстракция на ДНК
2. Амплификация на ДНК фрагменти
3. Откриване на продукти на ДНК амплификация

Извличането на ДНК е началният етап на PCR диагностиката, чиято същност е следната: лекарят взема материал за изследване от пациента и го подлага на специална обработка. По време на обработката двойната спирала на ДНК се разделя на отделни нишки. Към материала на пациента се добавя специална течност, която разтваря органични вещества, които пречат на "чистотата" на реакцията. Това премахва липидите, аминокиселините, пептидите, въглехидратите, протеините и полизахаридите. В резултат на това се образува ДНК или РНК.

Принципът на PCR метода е „конструирането“ на нови ДНК или РНК инфекции. Това не може да стане без отстраняване на клетъчния материал.

Времето, необходимо за извличане на ДНК, зависи от причинителя на инфекцията и от вида на материала, използван за PCR изследване. Например, подготовката на кръвта за следващия етап отнема 1,5-2 часа.

0Масив ( => Анализи) Масив ( => 2) Масив ( =>.html) 2

ДНК амплификация

За да извършат следващия етап от ДНК диагностиката - ДНК амплификация - лекарите използват така наречените ДНК матрици - ДНК молекули на инфекции, върху които впоследствие ще се извърши "клониране" на ДНК. Вече беше споменато, че не е необходимо наличието на пълната ДНК на инфекцията, за осъществяването на този етап е достатъчно малко парче от ДНК молекулата, което е характерно само за даден микроб (инфекция).

Основата на амплификацията на ДНК и съответно основата на целия принцип на PCR реакцията е естественият процес на завършване на ДНК за всички живи същества - репликация на ДНК, която се осъществява чрез удвояване на една единствена ДНК верига.

Започвайки с един единствен фрагмент от ДНК, лабораторният лекар го копира и увеличава броя на копията в режим на верижна реакция: след първия цикъл вече имате 2 фрагмента, след втория цикъл - 4, след третия - 8, след четвърти - 16, след това 32, 64, 128, 256... С всеки цикъл броят на копията се удвоява и след двадесет цикъла броят вече отива в милиони, а след тридесет - в милиарди. Цикълът продължава няколко минути и се свежда до определена промяна в температурата в много малък химически реактор. Тук, в разтвора, всички необходими компоненти на синтеза присъстват в достатъчни количества, на първо място, нуклеотиди A, G, T и C, а също така се извършват деликатни подготвителни химични операции, така че веднага да се вземе точно копие от всеки завършен ДНК сегмент, след това от това копие - отново копие, това е разклонената верижна реакция.

Чрез прикрепване на праймери към ДНК веригата - изкуствено синтезирани "парчета" ДНК (нуклеотидни двойки), подобни на ДНК на микроби (инфекции) - се образуват две къси спирали, състоящи се от две вериги на ДНК участъци, които са необходими за синтеза на бъдещи ДНК.

Синтезът на нова верига възниква чрез завършване на всяка от двете ДНК вериги. Процесът на амплификация се осъществява с помощта на специфична област - ДНК полимераза, която дава името на лабораторния метод. Полимеразата действа като катализатор за реакцията и наблюдава последователното прикрепване на нуклеотидни бази към растящата нова ДНК верига.

По този начин амплификацията на ДНК е многократно увеличаване на броя на ДНК копията, които са специфични, т.е. присъщи само на определен организъм. Не е необходимо да се завърши цялата ДНК верига, за да се види инфекциозният агент. Необходима е само зоната, която е характерна за дадена бактерия като индивид.

5360 рубли. Цената на цялостна програма с гастроентеролог

ОТСТЪПКА 25% НА ЗАПИСВАНЕ НА ЧАС ПРИ КАРДИОЛОГ

- 25%първичен
Посещение на лекар
терапевт през почивните дни

5160 рубли вместо 5420 rub. Скрининг на мъжете за урологични инфекции

АЛЕРГОЛОГИЯ 5120 рубли вместо 5590 rub.

Всички силно повтарящи се етапи на усилване се случват при различни температури. За извършване на PCR анализ се използва специално програмируемо оборудване - PCR - термостат или усилвател, който автоматично променя температурите. Амплификацията се извършва по зададена програма, съответстваща на вида на откритата инфекция. В зависимост от програмата и вида на откритата инфекция, автоматизираният PCR процес отнема от 2 до 3 часа.

Важна роля в PCR диагностиката играе квалификацията на лабораторния лекар, който извършва анализа, от него зависят правилните настройки на PCR оборудването и интерпретацията на резултатите. Лекарите в медицински център Euromedprestige имат богат опит в провеждането на ДНК диагностика, което гарантира надеждността на резултатите от изследванията и гарантира положителен успех при лечението на инфекциозни заболявания. Да вземете PCR тестове и да извършите пълна диагностика и лечение на инфекциозни заболявания в нашия медицински център Euromedprestige.

По време на откриването на продуктите на амплификация, получената смес от продукти на амплификация се отделя. Към сместа се добавят специални разтвори, които дават способността на ДНК фрагментите да флуоресцират – отразявайки се в оранжево-червени светещи ивици. Полученото сияние показва наличието на ДНК на вируси, микроби или бактерии в материала, взет от пациента за PCR анализ.