Тест системи за ензимен имуноанализ „ds-ifa-hbeAg“ и „ds-ifa-anti-hbe“. Тест за HIV инфекция

30.06.2020

Цена при запитване

Можете да добавите артикул в количката си, като посочите количеството

Производител: Диагностични системи

Държава Русия

Мерна единица Измерване: комплект

Вид опаковка: картонена кутия

Артикул: L-1823

Описание

Имуноензимен тест система за откриване на антитела от класове G, M и A срещу Treponema pallidum (T. pallidum) в човешки кръвен серум (плазма) и гръбначно-мозъчна течност за целите на диагностика на сифилис, пълен набор от реактиви за 96x2 определяния, подходящи за ръчни методи и автоматични тестови анализатори. Методът се основава на принципа на "капана", който се състои в това, че специфични антитрепонемни антитела от всички класове, присъстващи в пробата, се свързват едновременно с рекомбинантни антигени - аналози на имунодоминантни протеини на T. pallidum, фиксирани в ямките на плаката, и към същите антигени, белязани с пероксидаза хрян, при съвместно инкубиране на проби от човешки кръвен серум (плазма) или цереброспинална течност и конюгат. Промяна в цвета на субстратно-хромогенната смес, съдържаща TMB, когато се добави към ямките на плаката, показва наличието на специфични антитела срещу Treponema pallidum в тестовите проби

Функционално предназначение

Откриването на антитела срещу Treponema pallidum играе важна роля в диагностиката на сифилис, тъй като T. pallidum не може да бъде изолиран от клетъчна култура, а пробите за директно определяне на патогена често не са налични в латентни и късни стадии на заболяването. При серодиагностиката на сифилис се използват нетрепонемни (RMP, RPR, VDRL) и трепонемни (RPGA, RIF, ELISA) тестове. Имуноензимните тестове за определяне на общите антитела се използват за масов скрининг на донорска кръв и за диагностициране на сифилис като част от комплекс от серологични тестове. След успешна терапия реактивността на трепонемните тестове в повечето случаи остава

Спецификации

Съдържание на комплекта:
1. Полистиролова 96-ямкова сгъваема плака - 2 бр.,
2. Конюгатът е прозрачна жълта течност,
3. Положителна контрола - прозрачна червена течност,
4. Отрицателна контрола - прозрачна зелена течност,
5. Промивен разтвор, концентрат, pH от 6,9 до 7,6,
6. TMB е прозрачна безцветна течност,
7. Субстратен разтвор - прозрачна безцветна течност, pH ~4.2.
8. Стоп реагент (0,2M),
9. Указания за употреба и сертификат за качество.
Условия за съхранение: при температура от +2...8°C замразяването е недопустимо.
Срокът на годност е 15 месеца от датата на производство, посочена върху етикета на комплекта.
Съответствие с изискванията на TU 9398-182-05941003-2010.
Регистриран в Roszdravnadzor.

С.Н. ИГОЛКИНА, В.Ф. ПУЗИРЕВ, Л.Г. ЗИНИНА, Н.М. ДЕНИСОВА, А.Н. БУРКОВ,

А.П. RITE, T.I. УЛАНОВА
ООО "Научно-производствено обединение "Диагностични системи",

Нижни Новгород
ELISA ИМУНОТЕСТ СИСТЕМИ “DS-ELISA-HBeAg” и “DS-ELISA-anti-HBe” ЗА СПЕЦИФИЧНА ДИАГНОСТИКА И ПРОГНОЗА НА РЕЗУЛТАТИТЕ НА ОСТЪР И ХРОНИЧЕН ХЕПАТИТ B
Хепатит B е вирусно инфекциозно заболяване, характеризиращо се с тежко

възпалително увреждане на черния дроб. Около 1% от смъртните случаи се случват в

остър период на заболяването, в 4-10% от случаите има трансформация в хронична

процес с възможно образуване на последваща цироза на черния дроб и първична

хепатокарциноми.

Въпреки тенденцията към намаляване на заболеваемостта от остър хепатит В, продължава да се формира епидемиологично опасна група пациенти, които за първи път са диагностицирани с хроничен вирусен хепатит, както и група носители на причинителя на заболяването. . Остава неблагоприятна прогноза поради високата честота на хепатит В сред населението в репродуктивна възраст, както и сред юношите.

Ето защо въпросите за лечението, профилактиката и диагностиката на хепатит В са особено актуални сега.Понастоящем методите за ензимно-свързан имуносорбентен анализ се използват широко за откриване на маркери на тази инфекция. Най-важните серологични маркери на HBV включват е-антиген (HBeAg) и антитела срещу е-антиген (anti-HBe). HBeAg се свързва с високо замърсяване на кръвта, което показва активна репликация на вируса на хепатит B (HBV). Установено е, че високите титри на HBeAg съответстват на висока активност на ДНК полимераза и винаги са съчетани с откриване на пълни частици на Дейн. Когато серум, съдържащ HBeAg, навлезе в кръвта на здрав човек, рискът от инфекция е много порядък по-висок, отколкото след настъпване на сероконверсия.

При остър хепатит В, HBeAg се открива в кръвта в ранните стадии на инфекциозния процес, още при първите клинични прояви на заболяването, като изостава от появата на HBsAg с една седмица. Острият хепатит В (AHB) с цикличен курс се характеризира с краткотрайна циркулация на HBeAg. Скоро, на 2-3 седмица от иктеричния период, се появява анти-HBe, което позволява да се предвиди благоприятен изход от заболяването.

Anti-HBe циркулира в кръвта в продължение на 2-5 години, по-рядко в продължение на няколко месеца.

Началото на HBeAg-antiHBe сероконверсия бележи рязко намаляване на активността

инфекциозен процес. Откриването на HBeAg в кръвта на пациенти след 2 месеца от заболяването показва хронифициране на патологичния процес. В този случай анти-HBe може да се образува много години след появата на антитела срещу HBcAg или изобщо да не се открие.

Появата на анти-HBe може да има неблагоприятна прогностична стойност при

остър период на HBV в тежки форми, което съответства на мутация в предядрената зона с

образуване на HBV “е-” щам.

Целта на тази работа беше да се разработи високо чувствителен и специфичен

имуноензимни тест системи за откриване на HBeAg и anti-HBe и оценка на основните им характеристики.

Материали и методи.

1. Ензимна имуносорбентна тест система “DS-ELISA-HBeAg”. Валиден старт на теста

са поликлонални кози антитела към рекомбинантен HBeAg, произведени от NPO Diagnostic Systems, Нижни Новгород, адсорбирани върху твърдата фаза, и конюгат, който е поликлонални кози антитела към рекомбинантен HBeAg, белязани с пероксидаза от хрян, произведени от NPO Diagnostic Systems, Нижни Новгород. Схемата на анализа е едноетапна “сандвич” Общото време за реакция е 1,5 часа. Серумната проба се анализира неразредена.

2. Ензимна имуносорбентна тест система “DS-ELISA-anti-HBe”. Основата на теста е

рекомбинантен HBeAg (AHBV 102), произведен от NPO Diagnostic Systems,

Нижни Новгород, сорбиран върху твърдата фаза и анти-IgG конюгат с пероксидаза от хрян, произведен от Сорбент Сервиз, Москва. Реакцията протича на два етапа. Тестовият серум се добавя към имобилизирания антиген в разреждане 1/10 и след инкубиране и отстраняване на несвързаните компоненти се откриват специфични имунокомплекси с помощта на миши моноклонални антитела срещу човешки IgG, белязани с пероксидаза от хрян.

3. За оценка на разработените тест системи са използвани 2178 серумни проби

кръв. От тях 480 са серумни проби от здрави донори. 1680 проби представляват

са проби от кръвен серум, съдържащи различни маркери на вируса на хепатит В.

Осемнадесет проби са получени във времето от пациенти с клинична диагноза остър вирусен хепатит В. Преди това всички проби бяха тествани за наличие на HBsAg, HBeAg, anti-HBe, anti-HBc с помощта на тест системи, произведени от NPO Diagnostic Systems, Нижни Новгород: „ELISA-HBsAg/m“, „DS-ELISA-HBeAg“, „ DS-ELISA-анти-HBe", "ELISA-анти-HBc".

4. Беше извършена сравнителна оценка на разработените тестови системи с помощта на

търговско лекарство "Monolisa HBe", производство на BIO-RAD, Франция;

Резултати и дискусия. НПО "Диагностични системи" разработи 2 нови диагностични комплекта: "DS-ELISA-HBeAg" и "DS-ELISA-anti-HBe". Тест системата “DS-ELISA-HBeAg” е предназначена за откриване на е-антигена на вируса на хепатит В в човешки серум (плазма) с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ и може да се използва за специфична диагностика, определяща активността на инфекциозния процес, предсказващ тежестта и резултата от хепатит B.

Тест системата “DS-ELISA-anti-HBe” е предназначена за откриване на IgG антитела срещу е-антигена на вируса на хепатит B в човешки кръвен серум (плазма) и може да бъде

използвани за прогнозиране на хода на инфекциозния процес и проследяване на терапията за хепатит В.

За да се проучи спецификата на новите тестове, беше оценено разпространението

оптична плътност (OD) на проби от кръвен серум, съдържащи и несъдържащи

HBeAg или анти-HBe. Използвани са проби от кръвен серум от здрави донори и проби от кръвен серум, избрани за различни маркери на вируса на хепатит В.

станции за кръвопреливане. Резултатите от изследването показват значително разделение на двете популации. Стойностите на OD на серумни проби, които не съдържат HBeAg, варират от 0,011 до 0,111, а основният пик на серумни проби, съдържащи HBeAg, варира от 2,186 до 3,186 (Фигура 1а).

Фиг.1а. Разпределение на ОП на серумни проби, съдържащи и несъдържащи HBeAg в тест системата “DS-ELISA-HBeAg”
Пикът, съответстващ на групата серуми с ниска OD (0,3-0,6), вероятно се състои от серумни проби, събрани в ранните етапи на инфекциозния процес.

Още по време на инкубационния период HBsAg и HBeAg естествено се регистрират в кръвта на пациентите, което потвърждава тяхната потенциална епидемиологична опасност.

Диапазон на оптична плътност на серумни проби, несъдържащи анти-HBe

беше в диапазона от 0,002 до 0,122, а основният пик OD на серумни проби, съдържащи анти-HBe, беше в диапазона от 2,431 до 3,231 (Фигура 1b).

Ориз. 1б. Разпределение на OD на серумни проби, съдържащи и несъдържащи анти-HBe в тест системата “DS-ELISA-anti-HBeAg”
Изследвани са особеностите на разпределение на OD на анти-HBe положителни проби

серуми, съдържащи ( н=78) и не съдържа HBsAg ( н=56).

Ориз. 2а. HBe-положителни серумни проби, съдържащи HBsAg в тест системата „DS-ELISA-anti-HBe“.

Фиг.2б. Характеристики на разпределението на OD на анти-HBe-положителни серумни проби, които не съдържат HBsAg в тестовата система "DS-ELISA-anti-HBe".
Оптичните плътности на 87% от анти-HBe-позитивните серумни проби, които не съдържат HBsAg, варират от 0,41 до 0,81 (Фигура 2b). Освен това, само 14% от анти-HBe-позитивните серумни проби, съдържащи HBsAg, имат OD в този диапазон (Фигура 2а). Известно е, че във фазата на късна реконвалесценция, с отрицателна реактивност към HBsAg, има постепенно намаляване на титрите на антителата към HBeAg (Фигура 2b). Следователно е възможно преобладаващата концентрация на анти-HBe-положителни проби да съответства на OD по-малко от 0,8.

Получените данни показват надеждността на разделянето на положителни и

отрицателни проби от кръвен серум, независимо от стадия на заболяването. Чувствителността и специфичността на тест-системите “DS-ELISA-HBeAg” и “DS-ELISA-antiHBe” са изследвани в сравнение с теста “Monolisa HBe” (BIORAD, Франция) (Таблица 1).

маса 1
Сравнителни характеристики на чувствителността и специфичността

тест системи DS-ELISA-HBeAg и DS-ELISA-antiHB

Индекс	Определяне на HBeAg		Определяне на antiHBe
Индекс	NPO "DS", DS-IFA-HBeAg	"БИО-РАД" "Монолиза ХВе"	НПО "ДС" DS-ELISA-antiHBe	"БИО-РАД"
Количество изследвани проби	67	67	32	32
Разкрити положителен проби	47	47	16	16
Разкрити отрицателен проби	20	20	16	16

Данните, представени в таблица 1, показват 100% съответствие между резултатите.

Известно е, че комбинираното показание на HBeAg и anti-HBe, особено тяхната количествена оценка, има допълнително прогностично значение. Бързото повишаване на анти-HBe титъра характеризира активен хуморален имунен отговор и практически елиминира заплахата от хронифициране. Анализирахме промените в съдържанието на HBeAg/anti-HBe в проби от кръвен серум от пациенти с клинична диагноза „остър вирусен хепатит В” (Таблица 2).

таблица 2
Динамика на HBeAg/anti-HBe сероконверсия при пациенти с HBV

Предмет болен	Ден за вземане на кръв*	HBeAg	анти-HBe O.F./O.C.		Анти-HBc	анти- HBc IgM
	1	1,4+	2,1+	+	+	+
	12	0,5-	1,0+	+	+	+
	21	0,3-	1,3+	+	+	+
	1	1,2+	1,2+	+	+	+
	5	0,4-	1,0+	+	+	+
	13	0,2-	2,5+	+	+	+
	1	1,2+	0,6-	+	+	+
	21	0,2-	4,6+	+	+	+
	30	0,2-	9,7+	+	+	+
	1	2,1+	0,5-	+	+	+
	8	0,6-	1,1+	+	+	+
	28	0,3-	2,8+	+	+	+
	1	0,7-	2,2+	+	+	+
	8	0,3-	2,2+	+	+	+
	15	0,3-	2,8+	+	+	+
	38	0,2-	3,0+	+	+	+
6	1	1,1+	4,4+	+	+	+
	14	0,5-	3,8+	+	+	+

* от постъпване в болница
Всички серумни проби са тествани за наличие на серологични маркери

OGV: HBsAg, анти-HBc, анти-HBc IgM. Периодът на наблюдение варира от 13 до 38 дни. При пациенти № 1, № 2 и № 6 анти-HBe се откриват на фона на намаляване на титъра на HBeAg. При пациенти № 3 и № 4 анти-HBe се появяват след изчезване на HBeAg от кръвния серум съответно на 21 и 8 ден. Анализът за откриване на HBeAg в кръвния серум на пациент № 5 при постъпване в болницата показва отрицателен резултат. В същото време, превръщането в анти-HBe е регистрирано още на първия ден от изследването.

Всички субекти показват тенденция към повишаване на титъра на антителата срещу HBeAg в

кръвен серум, което дава възможност да се предвиди благоприятна динамика на клиничните

прояви на остър респираторен синдром и бързо възстановяване.

Изследването на новите тест системи показа тяхната висока диагностична надеждност. Резултатите от сравнението на DS-ELISA-HBeAg и DS-ELISA-antiHBe показаха 100% съответствие с теста Monolisa HBe.

При изследване на серумни проби от пациенти с хепатит В в динамика, тестове

потвърдена висока чувствителност и специфичност.

Краткото време на инкубация на тестовите проби и конюгата (1 час) дава възможност да се определи правилната тактика за провеждане на терапевтични мерки в най-кратки срокове. Създадените тест системи са лесни за използване и икономични (50 μl серум са необходими за определяне на HBeAg и 10 μl серум за определяне на anti-HBe). Висококачествените характеристики на тестовете позволяват успешното им използване при прогнозиране на хода на инфекциозния процес и проследяване на терапията на хепатит В.
ЛИТЕРАТУРА

1.Майер К.П.Хепатит и последствия от хепатит / K.P. Майер – М., GEOTAR, Медицина, 1999.- С.720

2.Онищенко Г.Г.Разпространението на вирусен хепатит като заплаха за националната сигурност / G.G. Онишченко, Л.А. Дементиева // Вестник по микробиология. –2003.-№4.- С.93-99.

3.Соринсън С.Н.Вирусен хепатит / S.N. Sorinson. - Санкт Петербург, Теза, 1997.- 306 с.

4. Баумайстер М.Специфични епитопи за антиген на вируса на хепатит B и ограничения на търговските анти-HВe имуноанализи / M. Baumeister // Journal of Medical Virology.- 2000.-N 60.- R. 256-263.

5.Кейн М.Глобална програма за контрол на инфекцията с хепатит В / М. Кейн // Ваксина. – 1995.-N131(Доп. 1).- Р.47-6. Shunichi SatО. Вирусни щамове на хепатит B с мутации в основния промотор при пациенти с фулминантен хепатит / Shunichi Sato, Kazuyuki Suzuki // Annals of Internal Medicine. – 1995.- N122.- Р.241-248.

7. Оу Дж.-н. Молекулярна биология на антигена на вируса на хепатит В./ J.-N.Ou // Journal of Gastroenterology and Hepatology. – 1997.- № 12 (Доп.1) – Р. 178-187.

8.Тиолез П.Вирусът на хепатит В. / P. Tiollais, C. Pourcel, A. Dejean // Nature. – 1985. – С.317, 489-495
Публикувано: Ж. “Клинична лабораторна диагностика” - 2005 г.-№ 6-С.-34-37

Ключови думи

РАННА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ДЪЛГОСРОЧНА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ДИФЕРЕНЦИАЦИЯ НА РАННА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ПРОДЪЛЖИТЕЛНОСТ НА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ХИВ-1 / РАННА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ДЪЛГОСРОЧНА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ДИФЕРЕНЦИАЦИЯ НА РАННА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ОТДАЛЕЧНОСТ НА ХИВ ИНФЕКЦИЯ / ХИВ-1Резюме на научна статия по фундаментална медицина, автор на научната работа - Юлия Евгениевна Загрядская, Дмитрий Александрович Нешумаев, Юлия Александровна Кокотюха, Елена Маратовна Мейрманова, Игор Алексеевич Олховски

Епидемиологичната ситуация по отношение на ХИВ инфекцията в Руската федерация остава изключително напрегната, което изисква търсене на нови, по-ефективни и рентабилни решения, насочени към противодействие на епидемията. Включването на лабораторни изследвания с помощта на тест система за определяне на продължителността на ХИВ инфекцията в рутинната практика на епидемиологичното наблюдение ще позволи да се определи честотата на ранните случаи на инфекция сред новоидентифицираните ХИВ-позитивни лица. Анализът на този критерий на ниво население ще помогне за обективна оценка на ефективността на превантивните и противоепидемичните мерки, провеждани на конкретна територия. Повишаването на обективността при определяне на времето, изминало от заразяването с ХИВ-1 с помощта на тестовата система DS-ELISA-HIV-AT-SROC, дава възможност за използване на резултатите от епидемиологичните изследвания за по-точно и пълно идентифициране на контактните лица. Определянето на вероятната продължителност на инфекцията може също да се наложи при вземане на решение за предписване на антиретровирусна терапия, като допълнително изследване при проследяване на лекарствената резистентност на HIV. Целта на тази работа беше да се определи ефективността на новата тест система DS-ELISA-HIV-AT-SROC за установяване на вероятното време на HIV-1 инфекция. Бяха изследвани проби от кръвен серум (плазма) на HIV-инфектирани лица с епидемиологично установен период на инфекция (n = 281) и проби от търговски панели за сероконверсия. Резултатите от проучването показват, че вероятността за правилно определяне на продължителността на HIV-1 инфекцията за проби от лица с най-вероятен период на установена инфекция е 95%, за проби от търговски панели за сероконверсия 100%. Получените данни демонстрираха високата ефективност на тестовата система DS-ELISA-HIV-AT-SROC при определяне на вероятния момент на инфекция с вируса на човешката имунна недостатъчност тип 1, което, съчетано със скоростта и простотата на процедурата, ни позволява да препоръчаме за използване в лабораторната практика.

Подобни теми на научна работа по фундаментална медицина, автор на научната работа е Юлия Евгениевна Загрядская, Дмитрий Александрович Нешумаев, Юлия Александровна Кокотюха, Елена Маратовна Мейрманова, Игор Алексеевич Олховски

Диагностични характеристики на високочувствителна имуноензимна тест система за откриване на HIV инфекция
2014 / Трохимчук Т. Ю., Сердюк В. Г., Ганова Л. А., Горлов Ю. И., Михалап Ю. И., Спивак Н. Я.
Съвременни молекулярно-генетични методи за изследване в епидемиологичното наблюдение на HIV инфекцията
2014 / Зайцева Наталия Николаевна, Ефимов Евгений Игоревич, Носов Николай Николаевич, Парфенова Олга Владимировна, Пекшева Олга Юриевна
Съвременни молекулярно-генетични методи за изследване при характеризиране на HIV-1 изолати от инфектирани пациенти в пенитенциарни институции
2015 / Зайцева Наталия Николаевна, Пекшева Олга Юриевна, Парфенова Олга Владимировна, Бутина Татяна Юриевна, Кузнецова Ирина Василиевна
Диагностика на HIV инфекция при деца през първите месеци от живота, родени от HIV-инфектирани майки
2012 / Богословская Елена Владимировна, Шипулин Г. А.
Оценка на безопасността на дарената кръв при прилагане на мерки за предотвратяване на нозокомиално предаване на HIV инфекция по време на кръвопреливания
2017 / Сандирева Т.П., Подымова А.С., Кукаркина В.А., Попкова Н.Г., Ножкина Н.В.
ХИВ инфекцията е предизвикателство за човечеството. Има ли шансове за преодоляване на болестта?
2012 / Уриваев Л.В., Бобкова М.Р., Лаповок И.А.
Характеристики на проявите на HIV инфекция в устната кухина
2017 г. / Полянская Лариса Николаевна
Човешки имунодефицитен вирус и полово предавани инфекции сред уязвимите групи от населението в Казахстан
2015 г. / Трумова Ж.З., Акышбаева Кулбаршин Сабировна, Джумабаева С.М.
Характеристики на ранния невросифилис при HIV-инфектирани пациенти
2018 / Шпрах Владимир Викторович, Костина Уляна Сергеевна
Естествен ход на ХИВ инфекцията при деца, като се вземе предвид пътя на инфекцията
2014 / Денисенко Валентин Борисович, Симованян E.N.

Оценка на нов анализ "DS-EIA-HIV-AB-TERM" за определяне на вероятното време на инфекция с човешкия имунодефицитен вирус-1 (HIV-1)

Епидемиологичната ситуация с ХИВ инфекцията в Русия остава изключително тежка, което изисква търсене на нови, по-ефективни и рентабилни решения, насочени към противодействие на епидемията. Включването на лабораторни изследвания с използване на тестова система за определяне на отдалечеността на ХИВ инфекцията в рутинните практики за наблюдение ще позволи да се определи честотата на поява на ранни случаи на инфекции сред новодиагностицирани ХИВ-позитивни лица. Анализът на този критерий на ниво население ще помогне обективно да се оцени ефективността на превенцията, контролните дейности, извършвани в определена област. Повишаването на обективността при определяне на времето, изминало от момента на заразяване с HIV-1 с помощта на тест системата DSEIA-HIV-Ab-TERM, дава възможност получените резултати да се използват в епидемиологичното изследване с цел по-точна и пълна идентификация на контактните лица. Определянето на вероятния период на инфекция може да се наложи и при решаването на въпроса за предписването на антиретровирусна терапия като допълнително изследване при наблюдението на лекарствената резистентност на HIV. Целта на тази работа беше да се определи ефективността на новата тест система DS-EIAHIV-Ab-TERM за определяне на вероятния момент на HIV-1 инфекция. Изследвани са серумни проби (плазма) от кръв на HIV-инфектирани лица с епидемиологично установено време на инфекция (n = 281) и проби от търговски панели за сероконверсия. Резултатите от проведеното проучване показаха, че вероятността за правилно откриване на отдалечеността на HIV-1 инфекцията за проби от индивиди с най-вероятно време на установен факт на инфекция е 95%, за проби от търговски панели за сероконверсия 100%. Данните демонстрират високата ефикасност на тест системата DS-“EIAHIV-Ab-TERM” при определяне на най-вероятния момент на инфекция с човешки имунодефицитен вирус тип 1, което в комбинация с бързината и простотата на процедурата позволява да се препоръча за използване в лабораторната практика.

Текстът на научната работа по темата „Оценка на новата тестова система ds-ifa-vich-at-srok за определяне на вероятния момент на инфекция с човешкия имунодефицитен вирус тип 1 (HIV-1)“

UDC 616.98:578.828.6]-092:612.017.1.064]-078

Загрядская Ю.Е.1, Нешумаев Д.А.2, Кокотюха Ю.А.2, Мейрманова Е.М.2, Олховски И.А.3, Пузирев В.Ф.1, Бурков АН.1, Уланова Т.И.1

оценка на новата тестова система ds-ifa-vich-at-srok за определяне на вероятния момент на заразяване с човешки имунодефицитен вирус тип 1 (HIV-1)

1OOO NPO Diagnostic Systems, 603093, Нижни Новгород; 2Красноярски регионален център за превенция и контрол на СПИН, 660049, Красноярск; 3FGBU "Център за хематологични изследвания на Министерството на здравеопазването на Русия" (клон Красноярск), Красноярск

Целта на тази работа беше да се определи ефективността на новата тест система DS-ELISA-HIV-AT-SROC за установяване на вероятното време на HIV-1 инфекция.

Изследвани са проби от кръвен серум (плазма) на HIV-инфектирани лица с епидемиологично установен период на инфекция (n = 281) и проби от търговски панели за сероконверсия. Резултатите от изследването показват, че вероятността за правилно определяне на продължителността на HIV-1 инфекцията за проби от лица с най-вероятен период на установена инфекция е 95%, за проби от търговски панели за сероконверсия - 100%. Получените данни демонстрираха високата ефективност на тестовата система DS-ELISA-HIV-AT-SROC при определяне на вероятния момент на инфекция с вируса на човешката имунна недостатъчност тип 1, което, съчетано със скоростта и простотата на процедурата, ни позволява да препоръчаме за използване в лабораторната практика.

Ключови думи: ранна HIV инфекция; дългосрочна HIV инфекция; диференциране на ранна HIV инфекция; продължителност на HIV инфекцията; ХИВ-1.

За цитиране: Епидемиология и инфекциозни болести. 2015 г.; 20 (3): 23-27. Zagryadskaya Yu.E.1, Neshumaev D. A2, Kokotyukha Yu.A.2, Meyrmanova E.M.2, Olkhovskiy I.A.3, Puzyrev V.F.1, Burkov A.N.1, Ulanova T.I."\ ОЦЕНКА НА НОВ "DS-EIA- HIV- AB-TERM" ТЕСТ ЗА ОПРЕДЕЛЯНЕ НА ВЕРОЯТНОТО ВРЕМЕ НА ИНФЕКЦИЯ С ВИРУС НА ЧОВЕШКА ИМУНОДЕФИЦИТНОСТ -1 (HIV-1)

JNPO "Диагностични системи", ул. Яблоневая 22. , Нижни Новгород, Руска федерация, 603093

2 Красноярски регионален център за превенция на СПИН, ул. Карла Маркса 45, Красноярск, Руска федерация, 660049

3 Хематологичен научен център (клон в Красноярск), 50, Академгородок, Красноярск, Руска федерация, 660036

ХИВ инфекцията в рутинните практики за наблюдение ще позволи да се определи честотата на поява на ранни случаи на инфекции сред новодиагностицирани ХИВ-позитивни лица. Анализът на този критерий на ниво население ще помогне обективно да се оцени ефективността на превенцията, контролните дейности, извършвани в определена област. Повишаването на обективността при определяне на времето, изминало от момента на заразяване с ХИВ-1 с помощта на тестовата система DS-EIA-HIV-Ab-TERM, дава възможност за използване на получените резултати в епидемиологичното изследване за целите на за по-точна и пълна идентификация на контактните лица. Определянето на вероятния период на инфекция може да се наложи и при решаването на въпроса за предписването на антиретровирусна терапия като допълнително изследване при наблюдението на лекарствената резистентност на HIV. Целта на тази работа беше да се определи ефективността на новата тестова система DS-EIA-HIV-Ab-TERM за определяне на вероятния момент на заразяване с HIV-1. Изследвани са серумни проби (плазма) от кръв на HIV-инфектирани лица с епидемиологично установено време на инфекция (n = 281) и проби от търговски панели за сероконверсия. Резултатите от проведеното проучване показаха, че вероятността за правилно откриване на отдалечеността на инфекцията с ХИВ-1 за проби от индивиди с най-вероятно време на установен факт на инфекция е 95%, за проби от търговски панели за сероконверсия - 100%. Данните демонстрират високата ефикасност на тест системата DS-"EIA-HIV-Ab-TERM" при определяне на най-вероятния момент на заразяване с човешкия имунодефицитен вирус тип 1, което в комбинация с бързината и простотата на процедурата позволява да го препоръча за използване в лабораторната практика.

Ключови думи: ранна HIV инфекция; дългосрочна HIV инфекция; диференциране на ранна HIV инфекция; отдалеченост на HIV инфекцията; ХИВ-1.

Цитиране: Epidemiologiya i Infektsionnye Bolezni. 2015 г.; 20(3): 23-27. (На руски.)

За кореспонденция: Юлия Евгениевна Загрядская, e-mail: [имейл защитен]

Разпространението на инфекцията, причинена от вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV), остава неотложен проблем в съвременния свят. Системата за епидемиологичен надзор, включваща лабораторна диагностика, лечение и превантивни мерки с широко покритие на населението, е основното средство за борба с ХИВ инфекцията.

Стандартният алгоритъм за диагностициране на HIV инфекцията, приет в Руската федерация, и наличните лабораторни технологии не ни позволяват обективно да определим вероятния период на HIV инфекция. Въпреки това, идентифицирането на истински случаи на ранна ХИВ инфекция може да бъде полезна мярка за допълване на основните епидемиологични параметри като честота или разпространение. Този показател ще ни позволи да оценим скоростта на развитие на епидемията по-точно и бързо в сравнение с общоприетите показатели. Получените данни могат да се разглеждат като критерий за определяне на ефективността на превантивните и противоепидемичните мерки, провеждани на конкретна територия. За да се оцени динамиката на инфекциозния процес, е необходимо да се знае не толкова общият брой на заразените пациенти (или показатели за разпространението на инфекцията и разпространението на населението), а по-скоро броят на новозаразените лица за определен период. период от време. От работата на J. Eaton и T. Hallett е известно, че динамиката на инцидентите не корелира с разпространението на ХИВ инфекцията сред населението.

В допълнение, обективната информация за вероятната продължителност на инфекцията със сигурност може да окаже значителна помощ при епидемиологичното изследване на пътищата на инфекция и навременното идентифициране на максималния брой контактни лица. Доказано е, че половината от всички случаи на ХИВ инфекция възникват от лица в ранен стадий на инфекция, което подкрепя стратегията за ранно използване на антиретровирусна терапия.

Заедно с това, молекулярно-генетичният мониторинг в системата за епидемиологичен надзор, допълнен от изследване на продължителността на инфекцията, може да ни позволи да преминем от нивото на филогенетичен анализ на подтипове и резистентни щамове на ХИВ към нивото на филодинамични изследвания.

През последните няколко години лабораторните служби в чужбина успяха да оценят честотата на новите случаи на инфекция (заболяемост). Тестовете са разработени и продължават да се подобряват за разграничаване на ранна ХИВ инфекция. Създадени са колекции от биологични проби за оценка на такива тестове и тези колекции непрекъснато се разширяват.

Във връзка с гореизложеното, разработването и използването на домашно тестово оборудване в работата на центровете за СПИН

системите, които позволяват диференциране на ранната ХИВ инфекция, ще имат положителен икономически и практически ефект. Използването на разработения тест в клиничната практика може да се превърне в полезен източник на информация и обективен критерий за оценка на ефективността на прилагането на държавни и регионални здравни програми за профилактика, диагностика и лечение на HIV инфекция.

Целта на изследването е да се оцени ефективността на разработената тест система DS-ELISA-HIV-AT-SROC за установяване на вероятния момент на заразяване с HIV-1.

Материали и методи

Работата е извършена в NPO Diagnostic Systems LLC (Нижни Новгород). Проби от кръвен серум (плазма) от HIV-инфектирани лица с епидемиологично установени периоди на инфекция (n = 281; група M, подтип A) бяха предоставени от Красноярския регионален център за превенция и контрол на СПИН (Красноярск). Вероятната продължителност на инфекцията се определя чрез изследване на проби от кръвен серум (плазма) от пациенти, подложени на повторни изследвания с кратък интервал от време (2-4 седмици), според динамиката на лабораторните маркери на HIV инфекцията, като се вземе предвид епидемиологичната история и при HIV-инфектирани пациенти, подложени на клиничен преглед, отчитащи повече от три години.

Успоредно с това бяха изследвани проби от 33 търговски панела за сероконверсия, произведени от Zeptometrix Corp. и SeraCare Life Sciences (САЩ) (група M, подтип B). В допълнение, възможността за изследване на проби от кръвен серум (плазма), съдържащи антитела срещу HIV-1 от различни подтипове, включително HIV-1 група O, беше оценена чрез тестване на проби от следните търговски панели: „Референтен панел от човешки кръвни серуми, съдържащи и несъдържащи антитела срещу HIV тип 1 (подтипове A, B, C) и тип 2" (Медицински център "Авицена", Русия) (с изключение на проба № 24, съдържаща антитела срещу HIV-2); 1-ви международен анти-HIV референтен панел (NIBSC Code: 02/210) (подтипове A, B, C, E) (с изключение на проба № 5, съдържаща антитела срещу HIV-2); Анти-HIV смесен подтипов панел (MSP-HIV-001) (с изключение на проби № 19, 20, съдържащи антитела срещу HIV-2) и проби от кръвен серум (плазма), съдържащи антитела срещу HIV-1 група O (№ 1342, K00175 , K00259; BioMex).

Активният принцип на разработената тест система е: рекомбинантни антигени, подобни на структурните протеини HIV-1 gp160 (env) и gp41 (env) на HIV-1 група O, произведени от NPO Diagnostic Systems LLC, адсорбирани върху ленти от полистиролова сгъваема таблетка ; конюгатите са рекомбинантни антигени HIV-1 gp41 и HIV-1 група O, белязани с биотин, и стрептавидин, белязан с пероксидаза от хрян.По време на разработването на теста бяха избрани HIV-1 антигени, които имат

които имат най-голямо диагностично значение: gp160, който включва имунодоминантния участък на gp41 и gp41 на HIV-1 група O. Схемата за анализ в тестовата система DS-ELISA-HIV-AT-SROC е двуетапен „сандвич“ версия на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с постепенно въвеждане на конюгати. Разработена е система за визуална оценка на въвеждането на всички компоненти и проби. Времето за реакция отнема по-малко от два часа. Резултатите се записват с помощта на спектрофотометър.

Доверителният интервал беше оценен за правилното определяне на периода на инфекция с помощта на тестовата система при доверителна вероятност от 95% с помощта на програмата R. Herbert Confidence Interval Calculator.

Резултати и дискусия

Стратегията, прилагана в тест системата, се основава на промяна на количествения и качествен състав на антителата в пробата в зависимост от продължителността на инфекцията. При изследване на проби от кръвен серум (плазма) с помощта на ELISA се определя оптичната плътност (OD) на естествени и разредени проби, отразяваща нивото на HIV-специфични антитела. Въз основа на промяната в ОП на пробата при разреждане по отношение на ОП на нативната проба се установява или ранна инфекция, или дългосрочна HIV инфекция.

Проведените изследвания показаха висока ефективност на разработената тест система DS-ELISA-HIV-AT-SROC. Имайки чувствителността на тестовете от трето поколение за откриване на антитела срещу HIV-1, DS-ELISA-HIV-AT-SROC правилно определи продължителността на HIV-1 инфекцията за всички проби от търговски панели за сероконверсия (Таблици 1, 2).

Вероятността за правилно определяне на продължителността на HIV-1 инфекцията за проби с епидемиологично установени периоди на инфекция е 95% (виж Таблица 2).

Важно е да се отбележи, че имунният отговор към ХИВ на случаен индивид, избран от популация, може в някои случаи да бъде хипер- или хипер-

маса 1

Резултати от тестване на панели за сероконверсия в DS-ELISA-HIV-AT-SROC

Сероконверсия - Дни от 1-ви Брой положителни проби в панела / общ брой проби в панела Резултат от теста в

панел за вземане на кръвни проби за откриване на антитела срещу HIV-1/2, CE0483 DS-ELISA-HIV-AT-SROC DS-ELISA-HIV-AT-SROC

VV1 RYAV 914 31 5/5 5/5 Ранна HIV-1 инфекция

BB1 РЯВ 916 35 2/6 2/6 Същият

BB1 RYAV 925 49 2/6 2/6 "

BB1 RYAV 929 28 3/7 3/7 "

BB1 RYAV 930 10 2/4 2/4 "

BB1 RYAV 931 42 4/9 4/9 "

BB1 RYAV 933 27 2/3 2/3 "

BB1 RYAV 934 11 3/3 3/3 "

BB1 RYAV 940 29 6/8 6/8 "

BB1 RYAV 941 25 3/6 3/6 "

BB1 RYAV 942 14 0/4 0/4 "

BB1 RYAV 944 16 2/6 2/6 "

BB1 RYAV 947 20 3/4 3/4 "

BB1 RYAV 951 19 1/6 1/6"

BB1 RYAV 952 21 3/6 3/6 "

BB1 RYAV 955 14 2/5 2/5 "

BB1 RYAV 965 21 3/6 3/6 "

BB1 RYAV 966 51 3/10 3/10 "

BB1 RYAV 968 35 4/10 4/10 "

BB1 RYAV 969 77 3/10 3/10 "

ZMS NGU 6243 33 2/10 2/10 "

ZMS NGU 6247 30 1/10 1/10 "

ZMC NSU 9014 31 5/7 5/7 "

ZMC NGU 9017 35 3/6 3/6 "

ZMC NSU 9018 33 2/11 2/11 "

ZMC NSU 9021 57 2/17 2/17 "

ZMC NSU 9022 29 1/9 1/9 "

ZMC HIV 9030 54 1/16 1/16 "

ZMC HIV 9031 157 3/19 3/19 "

ZMC HIV 9032 55 7/14 7/14 "

ZMC HIV 9077 104 15/29 15/29 "

ZMC NSU 9079 95 15/25 15/25 "

ZMC HIV 12008 42 4/13 4/13 "

Общият брой на положителните проби...

реактивен. Разпределението на общата популация на имунните характеристики в популацията винаги съдържа варианти, които не се вписват в интервала, считан за нормален. Поради тази причина установяването на вероятното време на инфекция въз основа на динамиката на лабораторните маркери на HIV инфекцията в някои случаи може да бъде неточно. Доказано е, че за проби с най-вероятен период на установена инфекция до 3 месеца, коректността на определяне на периода на инфекция е напълно съвместима

таблица 2

Коректност на определяне на вероятния период на HIV-1 инфекция с помощта на DS-ELISA-HIV-AT-SROC

Число Числото е правилно Коректност на определянето чрез теста DS-ELISA

Проби Група от проби, определени за вероятния момент на заразяване

в групата проби в групата на HIV-1 (при 95% ниво на сигурност), %*

С епидемиологични до 3 месеца 81 81 100.00 (95.50-100.00)

установено - 3-6 месеца 47 42 89.36 (77.41-95.37)

с течение на времето

HIV-1 инфекция 6-9 месеца 22 17 77,27 (56,56-89,88)

до 9 месеца 150 140 93.33 (88.16-96.34)

9 месеца или повече (CD4+ ниво неизвестно) 79 76 96,20 (89,42-98,70)

9 месеца или повече (ниско ниво на CD4+ 52 51 98,08 (89,88-99,66)

(< 200 кл/мл)

9 месеца и повече 131 127 96,95 (92,41-98,81)

Общ резултат... 281 267 95.02 (91.81-97.01)

Сероконверсия - До 157 дни 117 117 100 (96,82-100,00)

нални панели

Забележка. * - необходимо е да се вземе предвид вероятностният характер на периода на инфекция, установен по време на лабораторните изследвания.

данни, получени за проби с точно установен период на HIV инфекция (т.е. за проби от панели за сероконверсия), и е 100%. При изследване на проби от групата „до 9 месеца” съответствието между резултатите от теста и резултатите от предварително установените дати на инфекцията е 93,33%, за групата „инфекция над 9 месеца” - 96,95%. Една от основните причини за получаване на неверни резултати за групата "инфекция преди 9 месеца" е индивидуалните характеристики на имунния отговор (бърз отговор). За групата от хора, заразени повече от 9 месеца, причините могат да бъдат както характеристиките на имунния отговор (бавен отговор), така и серореверсия (поради лечение или дълбок имунен дефицит в по-късните стадии на HIV инфекцията).

При тестване на търговски панели „Референтен панел от човешки кръвни серуми, съдържащи и несъдържащи антитела срещу HIV тип 1 (подтипове A, B, C) и тип 2“, NIBSC код: 02/210, MSP-HIV-001 и проби № 1342 , K00175, K00259, предоставени от BioMex, беше потвърдена възможността за изследване на проби от кръвна плазма, съдържащи антитела срещу HIV-1 от различни подтипове и HIV-1 група O в DS-ELISA-HIV-AT-SROC.

Заключение

Получените данни показват, че разработената тестова система за ензимен имуноанализ позволява да се разграничи с голяма вероятност ранният период на сероконверсия на HIV инфекцията и по-късният период след инфекцията. Наличието на изследвания за продължителността на инфекцията отваря възможността за използване на информацията, получена не само на популационно, но и на индивидуално ниво. Високата ефективност на тест системата DS-ELISA-HIV-AT-SROC, съчетана с бързината и простотата на процедурата, позволява повторното

препоръчват го за използване в епидемиологичната и клиничната практика.

3. Бобкова М.Р., Лаповок И.А. Лабораторни методи за диференциална диагностика на остра, ранна и настояща HIV инфекция (лекция). Клинична лабораторна диагностика. 2007 г.; 12:25-32.

4. Нешумаев Д.А., Рузаева Л.А., Шевченко Н.М., Кокотюха Ю.А., Бойко Е.П., Елчининова Н.А. и др.. Опитът от използването на теста за определяне на продължителността на инфекцията в диагностичния алгоритъм на HIV инфекцията. Инфекция и имунитет. 2012 г.; 2 (1-2): 420.

6. Нешумаев Д.А., Татянина Е.А., Малишева М.А., Шевченко Н.М., Кокотюха Ю.А., Меирманова Е.М. и др.. Опитът от съвместното използване на филогенетичен анализ и определяне на продължителността на инфекцията при изследване на нозокомиална инфекция с HIV инфекция. В книгата: Материали от VIII Всеруска научно-практическа конференция с международно участие „Молекулярна диагностика -2014“. М.; 2014 г.; том 1: 64-5.

7. Методически препоръки МР 3.1.5.0075/1-13 „Епидемиология. Предотвратяване на инфекциозни заболявания. ХИВ инфекции. Наблюдение на разпространението на щамове на ХИВ, резистентни към антиретровирусни лекарства”, одобрен. Роспотребнадзор 20.08.2013 г. М.; 2013.

8. Лаповок И.А., Казеннова Е.В., Кандрушин Е.В., Баженов А.И., Годков М.А., Олшански А.Я. и др.. Сравнителен анализ на лабораторни методи за диференциална диагностика на ранна HIV инфекция. Въпроси на вирусологията. 2008 г.; 5:46-9.

11. Murphy G., Parry J.V. Тест за откриване на скорошни инфекции с човешки имунодефицитен вирус тип 1. Eurosurveillance. 2008 г.; 13 (36-4): 4-10.

Получено на 04.03.15г

1. Методически указания на Министерството на здравеопазването и социалното развитие на Руската федерация „Епидемиологично разследване на случаи на ХИВ и прилагане на противоепидемични мерки“ №. 6963-РХ от 20.09.2007г. Москва; 2007. (на руски)

2. Методически указания на Министерството на здравеопазването и социалното развитие на Руската федерация „Методически указания за изследване на ХИВ“ №. 5950-РХ от 06.08.2007г. Москва; 2007. (на руски)

3. Бобкова М.Р., Лаповок И.А. Лабораторни методи за диференцирана диагностика на остър, скорошен и настоящ ХИВ (лекция). Клин-ическая лабораторная диагностика. 2007 г.; 12:25-32. (на руски)

4. Нешумаев Д.А., Рузаева Л.А., Шевченко Н.М., Кокотюха Я.А., Бойко Е.П., Ел "чининова Н.А. и др. Опитът от използването на анализа за определяне на термина на инфекция в диагностичния алгоритъм на ХИВ. Infektsiya i immunitet. 2012; 2 (1- 2): 490. (на руски)

5. Итън Дж. У., Халет Т. Б. Защо делът на предаване по време на ранен стадий на ХИВ инфекция не предсказва дългосрочното въздействие на лечението върху разпространението на ХИВ. Proc. Natl. акад. Sci. 2014 г.; 111 (45): 16202-7.

6. Neshumaev D.A., Tat'yanina E.A., Malysheva M.A., Шевченко N.M., Kokotyukha Y.A., Meyrmanova E.M. и др. Опитът от едновременното използване на филогенетичен анализ и определяне на термина на инфекция при вътрешно клинично изследване на HIV инфекция. В: Сборник на VIII руска научно-практическа конференция с международно участие "Молекулярна диагностика - 2014: . Москва; 2014 г.; об. 1:64-5. (на руски)

7. Методически указания MR 3.1.5.0075/1-13 "Епидемиология. Профилактика на инфекциозни заболявания. HIV инфекции. Контрол над

разпространение на щамове на ХИВ, резистентни към антиретровирусни средства", одобрен от Федералната служба за надзор на защитата на правата на потребителите и благосъстоянието на хората, 20.08.2013 г. Москва; 2013 г. (на руски)

8. Лаповок И. А., Казеннова Е. В., Кандрушин Е. В., Баженов А. И., Годков М. А., Олшански А. Ю. и др. Сравнителен анализ на лабораторни методи за диференциална диагностика на скорошна HIV инфекция. Voprosy virusoloii. 2008; 5: 46-9. (в Руски)

9. Hattori J., Shiino T., Gatanaga H., Yoshida S., Watanabe D., Minami R. et al. Тенденции в предавания устойчив на лекарства HIV-1 и демографски характеристики на новодиагностицирани пациенти: Национално наблюдение от 2003 до 2008 г. в Япония. Antivirus Res. 2010 г.; 88 (1): 72-9.

10. Кога и как да се използват анализи за скорошна инфекция за оценка на разпространението на ХИВ на ниво популация. Работна група на UNAIDS/СЗО за глобално наблюдение на ХИВ/СПИН и ППИ. СЗО, 2011 г. Достъпно на: http://www.who.int/hiv/pub/surveillance/sti_surveillance/en/

11. Murphy G., Parry J.V. Анализ за откриване на скорошни инфекции с човешки имунодефицитен вирус тип 1. Eurosurveillance. 2008 г.; 13 (36-4): 4-10.

12. Kassanjee R., Pilcher C., Keating S., Facente S., McKinney E., Price M. et al. Независими от кандидатстващите тестове за разпространение на ХИВ върху проби за оценка в хранилището на CEPHIA. СПИН. 2014 г.; 28 (16): 2439-49.

13. Duong Y.T., Qiu M., De A.K., Jackson K., Dobbs T., Kim A.A. и др. Откриване на скорошна инфекция с ХИВ-1 с помощта на нов анализ за авидитет на ограничаващ антиген: потенциал за оценки на честотата на ХИВ-1 и проучвания за съзряване на авидитета. PLoS One. 2012 г.; 7(3):e33328.

14. Къртис К.А., Хансън Д.Л., Кенеди М.С., Оуен С.М. Оценка на мултиплексен анализ за оценка на честотата на HIV-1. PLoS One. 2013; 8(5):e64201.

15. Консорциум за оценка и ефективност на тестовете за разпространение на ХИВ (CEPHIA). Налично на: http://www.incidence-estimation.org/cephiaqueries/cephiaDB/overview

Нешумаев Дмитрий Александрович, д-р. пчелен мед. науки, доктор по клинична лабораторна диагностика, Лаборатория по бактериологични и молекулярно-генетични изследвания, Регионален център по СПИН; Кокотюха Юлия Александровна, лекар по клинична лабораторна диагностика в лабораторията за изследване на ензимен имуноанализ на Регионалния център за СПИН; Мейрманова Елена Маратовна, лекар по клинична лабораторна диагностика, лаборатория по ензимни имуноанализи, Регионален център за СПИН; Олховски Игор Алексеевич, д-р. пчелен мед. Sci., Директор на Красноярския клон на Федералната държавна бюджетна институция „Център за хематологични изследвания на Министерството на здравеопазването на Русия“; Пузирев Владимир Федорович, д-р. биол. науки, нач дълбочина. производство на рекомбинантни антигени и конюгати от NPO Diagnostic Systems LLC; Бурков Анатолий Николаевич, доктор по медицина. наук, проф., генерален директор на NPO Diagnostic Systems LLC; Уланова Татяна Ивановна, доктор по биология. науки, директор по изследванията, LLC "NPO "Диагностични системи"

Подобни статии: