Анти ХИВ 1 2 какво. Съвременни методи за диагностика на HIV инфекция

Собственици на патент RU 2283497:

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите и медицината. Ензимно-свързаната имуносорбентна тестова система за идентифициране на спектъра на антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус (HIV) от първи и втори тип, първия тип от група О и идентифициране на антигена към човешкия имунодефицитен вирус от първи тип p24 включва имуносорбент на базата на антигени на човешки имунодефицитен вирус, представляващи gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), антитела срещу HIV антиген 1 p24 и реактиви за откриване, горепосочените HIV антигени и HIV антитела, сорбирани в различни ямки на плочи за ензимно-свързан имуносорбентен анализ, и 96-ямкови полистиренови сгъваеми или неотделими плочи се използват за сорбция. Изобретението осигурява повишена чувствителност, опростяване и елиминиране на субективизма при оценяване на резултатите. 1 заплата досиета, 10 таблици, 1 ил.

Изобретението се отнася до областта на биотехнологиите и медицината. Употреба: диференцирано откриване на всички класове специфични антитела към протеини 1 и 2 на човешкия имунодефицитен вирус, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген.

Същност: получаване на ензимно-свързана имуносорбентна тест система за идентифициране на спектъра на антитела от всички класове към отделни протеини и HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген в кръвен серум (плазма), имуноглобулини и човешки кръвни продукти в за идентифициране на спектъра от антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O, откриване на HIV 1 p24 антиген и потвърждаване на положителни или съмнителни резултати от скрининг за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген.

ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Лабораторната диагностика на HIV инфекцията се основава на три области: а) индикация за HIV и неговите компоненти; б) откриване на антитела срещу HIV; в) определяне на промени в имунната система. Сред съществуващите лабораторни диагностични методи най-често срещаните са серологичните - откриване на антитела срещу вирусни антигени.

За откриване на антитела при HIV инфекция се използват главно ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) и имуноблотинг (IB). ELISA се основава на имобилизирането на вирусни антигени върху плаки, към които се свързват антителата на пациента, а комплексът антиген-антитяло се открива с помощта на конюгирани с пероксидаза от хрян миши моноклонални антитела срещу човешки имуноглобулини G и M. Методът е доста специфичен и чувствителен и позволява откриване на вирус-специфични антитела при 95% от пациентите. Останалите 5% от случаите се появяват в ранните стадии на инфекцията, когато все още има малко антитела в кръвния серум, или в терминалните фази на заболяването, когато тялото вече не е в състояние да синтезира антитела поради рязко изчерпване на имунната система. Възможни са и фалшиво положителни резултати от ELISA, предимно при пациенти с автоимунни и онкологични заболявания, както и при инфекции, причинени от вируса Eshptain-Barr. В този случай, кръстосана реакция на антитела към ревматоиден фактор, вирус на Epstein-Barr или към антигенни детерминанти, подобни на протеини от главния комплекс на хистосъвместимост клас 1 и 2 (HLA-4 и DQW3) и имащи способността да се свързват с HIV антигени възниква. Фалшивите положителни резултати са чести при бременни жени и възрастни хора. Хемолизата, липемията и бактериалното замърсяване на серума също могат да причинят ненадеждни резултати.

В тази връзка са предложени и използвани редица методи за тестване на специфичността на резултатите от откриване на антитела. От тези методи най-често използваната реакция е „имунно блотиране“ в модификацията „Western Blot“. Същността на метода е следната: на първия етап HIV протеините се разделят по молекулно тегло с помощта на електрофореза в полиакриламиден гел. След това се извършва електрофоретичен трансфер от полиакриламидния гел към повърхността на нитроцелулозната мембрана. Антигените, прехвърлени по този начин, се откриват върху мембраната чрез индиректен анализ: мембраната се инкубира с тестовия материал; съдържащите се антитела се свързват с HIV антигени, прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана, след което мембранните ленти се инкубират с конюгата; Когато се образува комплекс антиген-антитяло, конюгатът се прикрепя към него; след измиване от конюгата и инкубиране със субстрата се появява оцветяване в онези области на нитроцелулоза, където е настъпило образуването на комплекса антиген-антитяло-конюгат. Чертежът показва примери за положителни, слабо положителни и отрицателни резултати от имуноблот.

Антитела към следните протеини (p) и гликопротеини (gp) се откриват в серума на хора, заразени с HIV-1 и HIV-2: Таблица A.

Таблица Б представя критериите за оценка на резултатите от имуноблотинга, препоръчани от СЗО и Руския център за превенция и контрол на СПИН.

Въз основа на критериите на СЗО, серуми, в които антитела срещу всеки два протеина на обвивката на HIV-1 са открити чрез метода IB, се считат за положителни. Ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41) в комбинация със или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен. Според Федералния научен и методически център на Министерството на здравеопазването на Руската федерация за превенция и контрол на СПИН е възможно да се интерпретират серуми като положителни дори при наличие на антитела само към един мембранен протеин.

Откриването на антитела към антигена p24 може да покаже периода на началото на сероконверсията, тъй като първо се появяват антитела към този протеин. Положителните реакции с gag и pol протеини без наличие на реакция с env протеини могат да отразяват етапа на ранна сероконверсия и също да показват наличието на HIV-2 инфекция или неспецифична реакция.

Използването на имуноблотинг реакция като експертен метод за диагностициране на ХИВ има редица съществени недостатъци:

1. Невъзможността за потвърждаване на откриването на HIV p24 антиген 1 в случай на използване на тестове, които едновременно откриват антиген и антитела срещу HIV, което прави неподходящо (безсмислено) използването на скринингови тестове за едновременно откриване на антиген и антитела срещу HIV ( Заповед на Министерството на здравеопазването на Руската федерация № 292 от 30 юли 2001 г.: „за изследване на донори в станции за кръвопреливане е необходимо да се използват тестови системи, които едновременно откриват антиген и антитела срещу ХИВ“).

2. Откриване само на антитела от клас IgG. Невъзможно е напълно да се потвърдят положителните резултати, получени с помощта на тестове от 3-то и 4-то поколение (откриване на IgG и IgM антитела).

3. Субективност при тълкуването на оценката на теста, особено в случаите на „съмнителни” и „несигурни” резултати и в началните етапи на сероконверсия (откритите ивици върху нитроцелулозните мембрани в тези случаи са неясни, едва видими с невъоръжено око, и често има несъгласие, когато се оценява от различни лица).

4. Невъзможност за автоматизирана количествена оценка на резултатите от анализа.

5. По-ниска чувствителност в сравнение с ELISA.

6. Кратък срок на годност (по време на съхранение лентите от нитроцелулозна мембрана избледняват и не могат да бъдат обективно потвърждение за откриване или неоткриване на ХИВ в спорни случаи).

7. Трудност при настройване на реакцията и съхранение (нитроцелулозните мембранни ленти са много крехки и често се чупят).

8. Висока цена на комплектите за информационна сигурност.

Известен реагент е комплект за едновременно определяне на антигени и антитела към един и същ патоген, включително ХИВ (DE 4236189 F1, 28.04.1994 г.). Въпреки това не се разкрива система за тестване, която позволява диагностициране на ХИВ инфекцията на различни етапи.

Целта на настоящото изобретение е да се получи тестова система, с която е възможно да се потвърдят положителни или съмнителни резултати от скринингови тестове за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група О и HIV 1 p24 антиген, когато се използват тестове за едновременно откриване на на антигени и антитела.

Предложеното техническо решение се постига чрез ензимно-свързана имуносорбентна тестова система за идентифициране на спектъра от антитела срещу вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) от първи и втори тип, първия тип от група О и идентифициране на антигена p24 към човешкия имунодефицитен вирус. вирус от първи тип p24, характеризиращ се с това, че включва имуносорбент на базата на антигени на човешкия имунодефицитен вирус, представляващ gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), антитела срещу HIV 1 антиген p24 и реактиви за откриване, докато гореспоменатите HIV антигени и HIV антитела са адсорбирани в различни ямки на ензимно-свързани имуносорбентни тестови плаки.

В допълнение, за сорбция се използват 96-ямкови полистиренови сгъваеми или неразглобяеми плаки за ензимен имуноанализ.

Техническият резултат, постигнат с настоящото изобретение, е възможността за потвърждаване на положителни резултати за антитела срещу HIV 1 и 2, HIV 1 група O и HIV 1 p24 антиген, висока чувствителност, възможност за автоматизирана интерпретация на резултатите, което елиминира субективността на оценка, лекота на извършване на теста, по-малко отколкото при съществуващите комплекти за сигурност на информацията за разходите.

Това техническо решение се различава от известните:

1. Използване на плака за имунологични реакции като твърдофазов носител.

2. Едновременно използване на антитела срещу HIV p 24 и набор от HIV антигени като сорбент.

Изобретението се илюстрира със следния пример.

Активните принципи на разработената тест система "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1" са:

Имуносорбент - рекомбинантни антигени, подобни на структурните протеини на HIV-1: gp41 (env HIV-1 и HIV 1 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) и моноклонални миши антитела срещу HIV 1(p24) антиген, адсорбирани отделно върху ленти от полистиролова сгъваема плоча.

За приготвяне на имуносорбент използвайте:

1. HIV-1 gp41 е протеин, произведен от E. Coli щам № AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 е протеин, произведен от E. Coli щам № AHIV 109.

3. HIV-1 p24 е протеин, произведен от E. Coli щам № AHIV 105.

4. HIV-1 p31 е протеин, произведен от E. Coli щам № AHIV 108.

5. HIV-2 p36 е протеин, произведен от E. Coli щам № AHIV 106.

Конюгат 1, лиофилизиран или течен, е мише моноклонално антитяло срещу HIV1 p24 антиген, конюгиран с биотин.

1. Конюгат 2, лиофилизиран или течен, е смес от рекомбинантни антигени, подобни на структурните протеини на HIV-1: gp41 (env HIV-1 и HIV 1 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), конюгиран с биотин;

2. Конюгати 3, 4 - лиофилизирани или течни - стрептавидин, белязан с пероксидаза от хрян;

По време на предварителните проучвания е избран дизайнът на тестовата система, разработена е технологията за приготвяне на нейните компоненти и са оптимизирани условията за провеждане на реакцията на ензимен имуноанализ.

При извършване на ELISA в тест системата "DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1" към ямките на плаката със сорбирани антитела към p24 се добавят 25 μl конюгат-1 и 25 μl от конюгат-1 се добавя към ямките със сорбираните антигени 25 µl от конюгат-2. Реакционната схема е показана по-долу. След това към всяка ямка се добавят 25 μl от тестовата проба. В същото време в ямките с антигени цветът се променя от оранжев на розов, а в ямките с антитела - от зелен на сив. Сместа се инкубира за 45 минути при 37°С на шейкър (или 1 час при 37°С в термостат). След това, без измиване, добавете 50 μl конюгат-3 в ямките на плаката за определяне на антигена p24 и 50 μl конюгат-4 в ямките за определяне на антитела. След инкубиране в продължение на 20 минути при 37°C на шейкър (или 30 минути при 37°C в термостат), плаката се промива и се проявява със субстратна смес. Общо време за реакция 1 час 25 минути (или 1 час 50 минути). Антигенът p24, присъстващ в тестовата проба, се свързва с моноклонални антитела към p24, а специфичните антитела образуват комплекс с рекомбинантни антигени върху плаката. Полученият имунен комплекс от анти-р24 с р24 се открива с анти-р24-биотин конюгати, след това със стрептавидин-пероксидаза, а Ag-HIV имунните комплекси с At-HIV се откриват с Ag-биотин конюгат, след това със стрептавидин- пероксидаза.

Схема за настройка на реакцията.

Резултатите се отчитат спектрофотометрично при две дължини на вълната: 450/620-680 nm с устройство, конфигурирано „по въздух“. Нека вземем предвид резултатите при една дължина на вълната от 450 nm.

Резултатите от анализа се вземат предвид, ако средните стойности на оптичната плътност (OD) в ямки с K- са не повече от 0,2, в ямки с K + - не по-малко от 1,0. ОП крит. изчислено по формулата:

ОП крит. gp41 = ср. значение OP K-(gp41)+0.15

ОП крит. gp120 = ср. значение OP K-(gp120)+0.15

ОП крит. p24 = ср. значение ОП К-(р24)+0,15

ОП крит. p31 = ср. значение ОП К-(р31)+0,15

ОП крит. gp36 = ср. значение OP K-(gp36)+0.15

ОП крит. Ag p24 = ср. значение OP k-(Ag p24)+0.04

където 0,15 и 0,04 са коефициенти, установени чрез статистическа обработка при производителя. При разработването на тестовата система са използвани:

1. Проби от кръвен серум от здрави донори (n=610).

2. Кръвни серумни проби от пациенти с различни инфекциозни заболявания, несвързани с HIV (остри респираторни инфекции, пневмония, тонзилит, херпетични и цитомегаловирусни инфекции, сифилис, хламидия, вирусен хепатит А, В и С (n=224)).

3. Кръвни серумни проби от пациенти с различни неинфекциозни заболявания - травми, заболявания на сърдечно-съдовата система, онкология (n=35).

4. Проби от кръвен серум на бременни жени (n=40).

5. Проби от кръвен серум, серопозитивни в ELISA и потвърдени в имуноблот (n=428).

6. Серумни проби с положителен резултат от имуноензимен тест системи за едновременно определяне на HIV 1.2 антитела и р24 антиген и неопределен резултат чрез имуноблот (n=123).

7. Вътрешен панел от серуми, съдържащи и несъдържащи антитела срещу ХИВ 1,2, тествани на тестови системи за ензимен имуноанализ и имуноблот, регистрирани от Министерството на здравеопазването на Руската федерация (n=21).

8. Стандарт "HIV 1 ANTIGEN STANDARD", "BIO RAD", Франция, кат. No. 72217, който е антиген, получен от вирусен лизат.

9. Вътрешен стандарт на предприятието. Проба, съдържаща р 24 антиген в концентрация 200 pg/ml, получена от вирусния лизат и титрувана по "HIV 1 ANTIGEN STANDARD" фирма "BIO RAD", Франция, кат. № 72217.

10. Стандартен панел от серуми, съдържащи антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус тип 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, "Медико-биологичен съюз", Новосибирск.

11. Стандартен панел от серуми, съдържащи антитела към човешкия имунодефицитен вирус тип 2 (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, "Медико-биологичен съюз", Новосибирск.

12. Стандартен панел от серуми, които не съдържат антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус тип 1 и 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, "Медико-биологичен съюз", Новосибирск.

Чувствителността на тестовата система за откриване на антиген p24 беше оценена с помощта на „HIV I ANTIGEN STANDARD“, „BIO RAD“ и вътрешния стандарт на предприятието. С помощта на вътрешния стандарт бяха приготвени 4 серийни двукратни разреждания от 40 pg/ml до 5 pg/ml с нормална донорска плазма, свободна от HIV антитела 1, 2, като разредител. Най-малкото количество откриваем антиген беше взето като критерий за чувствителност. Получените данни са представени в таблица 1.

За да се оцени чувствителността на тестовата система при откриване на специфични антитела, бяха използвани стандартни панели от проби, съдържащи антитела срещу човешкия имунодефицитен вирус (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42- 28-216-02P (HIV 2) p.003).

Получените данни са представени в таблици 3, 4.

Диагностичната ефективност на тест системата „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” е сравнена с тест системите „Jenskrin-HIV-Ag/At” (Bio-Rad), „DIA-HIV” 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard ), "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). За тази цел серумните проби от вътрешния панел бяха тествани във всички посочени тестове. Резултатите, представени в таблица 5, показват високата диагностична ефективност на "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1".

Проучвания за чувствителност на тест системата "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" също бяха проведени с кръвни серуми от пациенти, потвърдени чрез имуноблотинг като ХИВ положителни. Тествани са общо 428 проби от такива серуми. Получени са няколко възможности за откриване на антитела срещу различни HIV протеини и антигена p24. Резултатите са представени в таблица 6.

При тестване на HIV 1 положителни проби, 3% от серумите показват положителна реакция с gp36 (HIV 2 env). OP/OPcrit. в тези проби не надвишава 2,0. Нашите данни за кръстосаната реактивност на протеините на външната обвивка на HIV 1 (gp41) и HIV 2 (gp36) съвпадат с литературните данни.

Тълкуване на резултатите

Анализът на тестването на ХИВ-позитивни серуми и проби от стандартни и вътрешни панели в "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1" ни позволи да разработим критерии за тълкуване на резултатите от този тест. Препоръчителните критерии са дадени в таблица 7.

Въз основа на тези критерии, всички проби от HIV положителни серуми (n=428) бяха определени като положителни в „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1“. От 16 проби от стандартния панел, съдържащи антитела срещу HIV 1, 14 бяха определени като положителни и 2 бяха определени като неопределени. Всичките 8 проби от стандартния панел, съдържащи антитела срещу HIV 2, бяха определени като положителни. От 10 проби от вътрешния панел, съдържащи антитела срещу HIV 1, 7 бяха определени като положителни и 3 бяха определени като неопределени.

Проучвания за чувствителност на тест системата "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1" също са проведени с кръвни серуми от пациенти, които са имали положителен резултат в ензимно-свързани имуносорбентни тест системи, които едновременно откриват антитела и р24 антиген и неопределен в имуноблот. Изследвани са общо 123 такива проби. Данните са представени в таблица 8.

При тестване на серуми с неопределен резултат от имуноблот (n=123) в “DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”, 72 проби (58,5%) показват положителен резултат. От тях 26 серума (21,1%) са положителни само за p24, 20 (16,3%) - само за антитела, 16 (13%) - за p24 с антитела към един от протеините, 10 (8,1%) - за p24 с антитела към два или повече от протеините. По този начин, тестването само за антитела (без откриване на p24) би идентифицирало 30 проби (24,4%) като положителни. Откриването на антиген p24 в теста позволява допълнителни 42 проби (34,1%) да бъдат идентифицирани като положителни.

За да се оцени специфичността на тестовата система, беше използван стандартен панел от серуми, които не съдържаха антитела срещу HIV 1, 2 (n=20); кръвни серумни проби от здрави донори (n=610), кръвни серумни проби от пациенти с различни инфекциозни заболявания (n=224), несвързани с HIV; кръвни серумни проби от пациенти с различни неинфекциозни заболявания - травми, заболявания на сърдечно-съдовата система, онкология (n=35); кръвни серумни проби от бременни жени (n=40). Изследвани са общо 929 проби. Една проба от кръвни серуми на здрави донори показа фалшив положителен резултат - бяха открити антитела срещу gp41 и p24. 7 проби от кръвни серуми от здрави донори и 2 проби от кръвни серуми от пациенти с инфекциозни заболявания, които не са свързани с ХИВ, показват фалшив положителен резултат за p24.

За оценка на специфичността на тестовата система е използван стандартен панел от отрицателни проби (OSO 42-28-214-94-02p, стр. 009). Специфичността е 100%.

По този начин проучванията показват, че специфичността на тестовата система „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1“ е 99% при изследване на проби от кръвен серум от нормални донори и пациенти с различни инфекциозни и соматични заболявания .

Получените данни показват високата диагностична ефективност на разработената тест система "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1". Тестовата система може да се използва за откриване на антитела към отделни протеини на HIV тип 1 и 2 и HIV1 p24 антиген, за да се потвърди положителен резултат от скрининга с тестови системи, които откриват антитела, или тестови системи, които едновременно откриват антитела и HIV1 p24 антиген. Тестовата система може да се използва като алтернатива на имуноблот теста за потвърждаване на положителни резултати, както и за изследване на динамиката на HIV антителата и р24 антигена на различни етапи от инфекцията.

ПРЕДИМСТВА НА ТЕСТА

1. Потвърдителен ензимен имуноанализ във формат на таблетка

2. Потвърждаващ тест, комбиниращ определяне на спектъра на HIV 1, 2 антитела и HIV 1 p24 антиген

3. Откриване на антитела от всички Ig класове

4. Чувствителността за откриване на p24 е поне 5 pg/ml

5. Намалява неопределените резултати в сравнение с имуноблотинга

6. Време за анализ - 1 час 25 минути (имуноблот - от 3 до 20 часа)

7. Визуална оценка на добавянето на всички компоненти и проби.

1. Ензимно-свързана имуносорбентна тестова система за идентифициране на спектъра от антитела срещу вируса на човешката имунна недостатъчност (HIV) от първи и втори тип, първия тип от група О и идентифициране на антигена p24 към вируса на човешката имунна недостатъчност от първи тип p24, характеризиращ се с това, че включва имуносорбент на базата на човешки антигени на имунодефицитен вирус, представляващи gp41 (env HIV-1 и HIV-2 група O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV -2), антитела срещу HIV 1 антиген p24 и реагенти за откриване, докато гореспоменатите HIV антигени и HIV антитела се сорбират в различни ямки на плаки за ензимно-свързан имуносорбентен анализ.

2. Тестова система за ензимен имуноанализ съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че за сорбция се използват 96-ямкови полистиренови сгъваеми или неотделими плаки за ензимен имуноанализ.

Обща информация за изследването

ХИВ (вирус на човешката имунна недостатъчност) е вирус от семейството на ретровирусите, който инфектира клетките на човешката имунна система (CD4, Т хелперни клетки). Причинява СПИН.

HIV-1 е най-разпространеният тип вирус, най-често срещан в Русия, САЩ, Европа, Япония и Австралия (обикновено подтип B).

ХИВ-2 е рядък тип, често срещан в Западна Африка.

За диагностициране на вируса на човешката имунна недостатъчност се използва комбинирана тестова система от четвърто поколение, която е в състояние да открие ХИВ инфекция в рамките на 2 седмици след навлизането на вируса в кръвта, докато тестовите системи от първо поколение правят това само 6-12 седмици след заразяването.

Предимството на този комбиниран тест за HIV е откриването, благодарение на използването на антитела срещу HIV-1 p24 като реагенти, на специфичния антиген p24 (вирусен капсиден протеин), който може да бъде открит чрез този тест в рамките на 1-4 седмици от дори преди сероконверсия, което значително съкращава „периода на прозореца“.

В допълнение, този тест за ХИВ открива антитела срещу ХИВ-1 и ХИВ-2 в кръвта (чрез реакцията антиген-антитяло), които се произвеждат в достатъчни количества, за да бъдат открити от тестовата система 2-8 седмици след заразяването.

След сероконверсия антителата започват да се свързват с антигена p24, което води до положителен тест за HIV антитяло и отрицателен тест за p24. След известно време обаче в кръвта ще бъдат открити едновременно антитела и антиген. В терминалния етап тестът за СПИН за антитела срещу HIV може да даде отрицателен резултат, тъй като механизмът на производство на антитела е нарушен.

Етапи на HIV инфекция

1. Инкубационният период или „периодът на серонегативния прозорец“ е времето от момента на заразяването до развитието на защитни антитела срещу вируса в кръвта, когато тестовете за антитела срещу ХИВ са отрицателни, но човекът вече може да предава вируса на други хора. Продължителността на този период е от 2 седмици до 6 месеца.
2. Периодът на остра ХИВ инфекция започва средно 2-4 седмици от момента на заразяването и продължава приблизително 2-3 седмици. На този етап някои хора могат да развият неспецифични грипоподобни симптоми поради активна репликация на вируса.
3. Латентният стадий е асимптоматичен, но по време на него има постепенно намаляване на имунитета и увеличаване на количеството на вируса в кръвта.
4. СПИН (синдром на придобита имунна недостатъчност) е крайният стадий на развитие на HIV инфекцията, който се характеризира с тежко потискане на имунната система, както и съпътстващи заболявания, енцефалопатия или рак.

Въпреки факта, че HIV инфекцията е нелечима, днес има високоактивна антиретровирусна терапия (ART), която може значително да удължи живота на HIV-инфектиран човек и да подобри неговото качество.

Този тест има особено висока диагностична стойност, ако ХИВ инфекцията е настъпила малко преди момента на изследването (2-4 седмици).

За какво се използва изследването?

Анализът се използва за ранна диагностика на ХИВ, което позволява предотвратяване на по-нататъшно предаване на вируса на други хора, както и навременно започване на антиретровирусна терапия и лечение на заболявания, които допринасят за прогресирането на ХИВ инфекцията.

Кога е насрочено изследването?

• С персистиращи симптоми (за 2-3 седмици) с неизвестна етиология: субфебрилна температура, диария, нощно изпотяване, внезапна загуба на тегло, увеличени лимфни възли.
• При рецидивираща херпесна инфекция, вирусен хепатит, пневмония, туберкулоза, токсоплазмоза.
• Ако пациентът страда от полово предавани болести (сифилис, хламидия, гонорея, генитален херпес, бактериална вагиноза).
• Ако пациентът е имал незащитен вагинален, анален или орален секс с множество сексуални партньори, нов партньор или партньор, за чийто ХИВ статус пациентът не е сигурен.
• Когато пациентът е претърпял кръвопреливане на донор (въпреки че случаите на инфекция по този начин са практически изключени, тъй като кръвта се тества внимателно за наличие на вирусни частици и се подлага на специална термична обработка).
• Ако пациентът инжектира наркотици с помощта на нестерилни инструменти.
• По време на бременност/планиране на бременност (приемането на азидотимидин по време на бременност, цезарово сечение, за да се избегне предаването на вируса на бебето по време на преминаване през родовия канал, и избягването на кърменето намалява риска от предаване на ХИВ от майка на дете от 30% на 1% ).
• Случайно инжектиране със спринцовка или друг предмет (например медицински инструмент), съдържащ заразена кръв (в такива случаи вероятността от инфекция е изключително ниска).

Най-разпространеният вирус в света днес е СПИН, вирус от подсемейството на ретровирусите; те се наричат ​​още лентивируси или „бавни“. Всъщност в човешкото тяло те започват да проявяват активност след сравнително дълго време, приблизително 10 години.

Има имунодефицити от първи и втори тип. Но можем спокойно да говорим за експанзията на първия тип вирус. След като влезе в кръвта и се присъедини към клетката, която отговаря за имунитета, вирусът започва да се размножава бързо. Докато молекулата CD4, отговорна за неговото разпознаване, идентифицира коварния враг, той успява да зарази цялото тяло. Следователно, колкото по-рано се диагностицира, толкова по-големи са шансовете на пациента да получи своевременно лечение и да живее по-дълго.

Ако човек има причина да се изследва за СПИН, това трябва да стане незабавно. Най-често основата на такава диагностика е определянето на антитела срещу имунодефицит в кръвта - протеини, които възникват като реакция на наличието на вируса и започват да се образуват в периода от 1,5 до 6 месеца от момента на възможното инфекция. Съответно е по-препоръчително да се подложите на диагностика след този период.

Количеството на антителата се определя чрез анализ, наречен ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Този метод е доверен, той е относително точен и силно чувствителен, тези цифри са над 99,5%. Фармацевтичният пазар предлага редица диагностични тестови комплекти за ELISA: CombiBest HIV, Anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV, CombiBest anti-HIV 1 2, CombiBest anti-HIV 1 2 d 0172. Тези тестови системи принадлежат към третата поколение. Недостатъкът на тези реактиви е, че не винаги откриват заболяването рано. Човекът вече е носител на вируса, той е потенциално опасен за партньорите, но антителата все още не присъстват в кръвта.

Комплектите са оборудвани основно с редица тестове за провеждане на 12*8 или 192 теста за ХИВ. Не се препоръчва да ги използвате сами. Описанието на лекарствата показва, че основната им цел е да открият количеството антитела срещу двата вида СПИН. И също така определяне на антитела от всички класове срещу СПИН. Ако няма антитела, значи заболяването не е диагностицирано.

Четвъртото поколение тестове „виждат“, в допълнение към антителата, антигени на СПИН; те са в състояние да открият инфекция по-рано от методите от трето поколение. За сравнение: HIV антигенът е в кръвта от 5-ия ден, а първите антитела се появяват не по-рано от месец по-късно. CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (комплект 1) и CombiBest HIV 1, 2 AG/AT (комплект 2) принадлежат към тестовете от 4-то поколение. С помощта на набор от тези реагенти се откриват антитела срещу антиген тип 1, 2 и р24 чрез изследване на човешки кръвен серум или плазма. Много страни използват ELISA тестване от 4-то поколение, което също се нарича антиген/антитяло, съкратено като AGAT.

Тестването се извършва анонимно.

Навременната диагностика на ХИВ инфекцията става изключително важна мярка, тъй като ранното започване на лечението може до голяма степен да определи по-нататъшното развитие на заболяването и да удължи живота на пациента. През последните години се наблюдава значителен напредък в идентифицирането на тази ужасна болест: по-старите тестови системи се заменят с по-модерни, методите за изследване стават по-достъпни и тяхната точност значително се увеличава.

В тази статия ще говорим за съвременните методи за диагностициране на ХИВ инфекцията, чието познаване е полезно за навременно лечение на този проблем и поддържане на нормално качество на живот на пациента.

Методи за диагностика на ХИВ

В Русия се провежда стандартна процедура за диагностициране на ХИВ инфекцията, която включва две нива:

• ELISA тест система (скрининг анализ);
• имуноблотинг (IB).

За диагностика могат да се използват и други методи:

• бързи тестове.

ELISA тест системи

На първия етап от диагностицирането се използва скринингов тест (ELISA) за откриване на HIV инфекция, който се основава на HIV протеини, създадени в лаборатории, които улавят специфични антитела, произведени в тялото в отговор на инфекция. След взаимодействието им с реагентите (ензимите) на тест системата цветът на индикатора се променя. След това тези промени в цвета се обработват с помощта на специално оборудване, което определя резултата от направения анализ.

Такива тестове ELISA могат да покажат резултати в рамките на няколко седмици след въвеждането на HIV инфекцията. Този тест не определя наличието на вируса, но открива производството на антитела към него. Понякога в човешкото тяло производството на антитела срещу ХИВ започва след 2 седмици след инфекцията, но при повечето хора те се произвеждат на по-късна дата, след 3-6 седмици.

Има четири поколения ELISA тестове с различна чувствителност. През последните години все повече се използват трето и четвърто поколение тест системи, които са базирани на синтетични пептиди или рекомбинантни протеини и имат по-голяма специфичност и точност. Те могат да се използват за диагностициране на ХИВ инфекция, наблюдение на разпространението на ХИВ и осигуряване на безопасност при тестване на дарена кръв. Точността на тестовите системи ELISA III и IV поколение е 93-99% (тестовете, произведени в Западна Европа, са по-чувствителни - 99%).

За извършване на ELISA тест се вземат 5 ml кръв от вената на пациента. Между последното хранене и анализа трябва да изминат най-малко 8 часа (обикновено се извършва сутрин на празен стомах). Препоръчително е да направите такъв тест не по-рано от 3 седмици след предполагаемата инфекция (например след незащитен полов акт с нов сексуален партньор).

Резултатите от теста ELISA се получават след 2-10 дни:

• отрицателен резултат: показва липса на HIV инфекция и не изисква контакт със специалист;
• фалшиво отрицателен резултат: може да се наблюдава в ранните стадии на инфекция (до 3 седмици), в по-късните стадии на СПИН при тежко потискане на имунната система и при неправилна подготовка на кръвта;
• фалшив положителен резултат: може да се наблюдава при някои заболявания и при неправилна подготовка на кръвта;
• положителен резултат: показва HIV инфекция, изисква провеждане на IB и пациентът да се свърже със специалист в центъра за СПИН.

Защо тестът ELISA може да даде фалшиво положителни резултати?

Фалшиво положителни резултати от теста ELISA за ХИВ могат да възникнат поради неправилна обработка на кръвта или при пациенти със следните състояния и заболявания:

• множествена миелома;
• инфекциозни заболявания, причинени от вируса на Epstein-Barr;
• състояние след ;
• автоимунни заболявания;
• на фона на бременност;
• състояние след ваксинация.

Поради описаните по-горе причини в кръвта могат да присъстват неспецифични кръстосано реагиращи антитела, чието производство не е провокирано от HIV инфекция.

През последните години честотата на фалшиво положителните резултати е намаляла значително поради използването на тестови системи от поколение III и IV, които съдържат по-чувствителни пептидни и рекомбинантни протеини (те се синтезират с помощта на генно инженерство in vitro). След въвеждането на такива ELISA тестове, честотата на фалшивите положителни резултати намалява значително и е около 0,02-0,5%.

Фалшиво положителен резултат не означава, че лицето е заразено с ХИВ. В такива случаи СЗО препоръчва провеждането на друг тест ELISA (задължително IV поколение).

Кръвта на пациента се изпраща в референтна или арбитражна лаборатория с маркировка „повтаряне“ и се изследва с помощта на тест система IV поколение ELISA. Ако резултатът от новия анализ е отрицателен, тогава първият резултат се счита за грешен (фалшиво положителен) и IS не се извършва. Ако резултатът е положителен или съмнителен по време на втория тест, пациентът трябва да се подложи на IB след 4-6 седмици, за да потвърди или отхвърли HIV инфекцията.

Имунен блотинг

Окончателна диагноза ХИВ инфекция може да бъде направена само след получаване на положителен резултат от имуноблотинг (IB). За извършването му се използва нитроцелулозна лента, върху която се нанасят вирусни протеини.

Вземането на кръв за IB се извършва от вена. След това се подлага на специална обработка и съдържащите се в серума му протеини се разделят в специален гел според техния заряд и молекулно тегло (манипулацията се извършва със специална апаратура под въздействието на електрическо поле). Нитроцелулозна лента се нанася върху гела от кръвен серум и се извършва блотинг („блотинг“) в специална камера. Лентата се обработва и ако използваните материали съдържат антитела срещу HIV, те се свързват с антигенните ленти на IB и се появяват като линии.

IB се счита за положителен, ако:

• според американските критерии на CDC - на лентата има две или три линии gp41, p24, gp120/gp160;
• според американските критерии на FDA лентата има две линии p24, p31 и линия gp41 или gp120/gp160.

В 99,9% от случаите положителният IB резултат показва HIV инфекция.

Ако няма линии, IB е отрицателен.

При идентифициране на линии с gr160, gr120 и gr41, IB е съмнително. Този резултат може да възникне, когато:

• онкологични заболявания;
• бременност;
• чести кръвопреливания.

В такива случаи се препоръчва да се повтори изследването с помощта на комплект от друга компания. Ако след допълнително IB резултатът остане съмнителен, тогава е необходимо наблюдение в продължение на шест месеца (IB се извършва на всеки 3 месеца).

Полимеразна верижна реакция

PCR тест може да открие РНК на вируса. Неговата чувствителност е доста висока и позволява откриване на HIV инфекция в рамките на 10 дни след заразяването. В някои случаи PCR може да даде фалшиво положителни резултати, тъй като неговата висока чувствителност може да реагира и на антитела към други инфекции.

Тази диагностична техника е скъпа и изисква специално оборудване и висококвалифицирани специалисти. Тези причини не позволяват извършването на масово тестване на населението.

PCR се използва в следните случаи:

• за откриване на ХИВ при новородени, родени от инфектирани с ХИВ майки;
• за откриване на ХИВ в „периода на прозореца” или при съмнителна ИБ;
• за контрол на концентрацията на ХИВ в кръвта;
• за изследване на донорска кръв.

PCR тестът сам по себе си не поставя диагноза ХИВ, а се провежда като допълнителен диагностичен метод за разрешаване на спорни ситуации.

Експресни методи

Едно от новостите в диагностиката на ХИВ са бързите тестове, чиито резултати могат да бъдат оценени в рамките на 10-15 минути. Най-ефективни и точни резултати се получават с помощта на имунохроматографски тестове, базирани на принципа на капилярния поток. Те представляват специални ленти, върху които се нанася кръв или други тестови течности (слюнка, урина). Ако има антитела срещу HIV, след 10-15 минути върху теста се появява цветна и контролна лента - положителен резултат. Ако резултатът е отрицателен, се появява само контролната лента.

Както при ELISA тестовете, резултатите от бързите тестове трябва да бъдат потвърдени от IB анализ. Само след това може да се постави диагноза HIV инфекция.

Има налични комплекти за бързи домашни тестове. Тестът OraSure Technologies1 (САЩ) е одобрен от FDA, предлага се без рецепта и може да се използва за откриване на ХИВ. След теста, ако резултатът е положителен, на пациента се препоръчва да се подложи на преглед в специализиран център за потвърждаване на диагнозата.

Други тестове за домашна употреба все още не са одобрени от FDA и техните резултати могат да бъдат много съмнителни.

Въпреки факта, че бързите тестове са по-ниски по точност от тестовете ELISA от IV поколение, те се използват широко за допълнително изследване на населението.

Можете да направите тестове за откриване на ХИВ инфекция във всяка клиника, централна областна болница или специализирани центрове за СПИН. На територията на Русия те се извършват абсолютно конфиденциално или анонимно. Всеки пациент може да очаква да получи медицинска или психологическа консултация преди или след теста. Ще трябва да платите само за тестове за ХИВ в търговските медицински институции, докато в държавните клиники и болници те се извършват безплатно.

Прочетете за начините, по които можете да се заразите с ХИВ и какви митове съществуват за възможностите да се заразите.

Описание

Подготовка

Показания

Тълкуване на резултатите

Описание

Метод за определяне Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA).

Проучван материалКръвен серум

Възможност за домашно посещение

Комбинирано откриване на антитела срещу HIV тип 1 и 2 и HIV p24 антиген, качествен тест.

внимание. При положителни и съмнителни реакции срокът за издаване на резултати може да бъде удължен до 10 работни дни. HIV (вирус на човешка имунна недостатъчност), който причинява СПИН (синдром на придобита имунна недостатъчност), принадлежи към семейството на ретровирусите. Предава се от човек на човек чрез използване на замърсени игли и спринцовки за интравенозно приложение на лекарства или терапевтични процедури по време на сексуален контакт, както хетеросексуален, така и хомосексуален. Предаването на вируса може да стане чрез преливане на заразена кръв и нейни продукти, даряване на органи или семенна течност, а сред медицинските работници - чрез нараняване от замърсени игли или инструменти. ХИВ инфекцията е възможна чрез предаване от заразена майка на дете (вертикален път), въпреки че съвременните методи за превенция, използващи антиретровирусна терапия, ако се спазват всички препоръки, могат да намалят този риск до минимум.

Процесът на взаимодействие на вируса с клетката включва няколко етапа: свързване на вируса с клетката, освобождаването му от обвивката, проникване в цитоплазмата, синтез на ДНК с помощта на вирусна РНК, интегриране на вирусна ДНК в генома на клетката гостоприемник. След това започва латентният стадий на инфекцията. В това състояние провирусната ДНК може да съществува известно време, без да показва активност и без да засяга живота на клетката гостоприемник. Въпреки че няма експресия на вирусни протеини, няма имунен отговор към вируса. Антителата срещу HIV, които характеризират имунния отговор на организма, се появяват след активирането на вирусната ДНК и началото на активното възпроизвеждане на вируса. Продължителността на латентния период зависи от редица фактори, включително индивидуалните генетични характеристики на организма.

Антителата срещу HIV могат да се появят от втората седмица след заразяването; тяхното съдържание се увеличава в рамките на 2-4 седмици и остава в продължение на много години. При 90-95% от заразените се появяват през първите три месеца след заразяването, при 5-9% - в периода от три до шест месеца, при 0,5-1% - по-късно.

През първите седмици на инфекцията, дори преди появата на антитела срещу вируса (т.е. преди сероконверсия), наличието на HIV антигени, включително неговия р24 капсиден протеин, може да бъде открито в серумни или плазмени проби. По-късно, след сероконверсия, обикновено става неоткриваем.

Комбинираните тест системи от 4-то поколение, които включват теста HIV Ag/Ab Combo (Architect, Abbott), откриват както антитела срещу HIV тип 1 и 2, така и HIV p24 антиген, което позволява ранно откриване на инфекция. Специалните характеристики на скрининг теста, използван в лабораторията INVITRO за откриване на HIV инфекция, включват високата специфичност на изследването (> 99,5%); Анализът е 100% чувствителен към антитела, характерни за периода на сероконверсия, а чувствителността на теста към p24 антигена е около 18 pg/ml.

Процедурата за провеждане на лабораторно изследване за ХИВ е строго регламентирана от заповедите на Министерството на здравеопазването на Руската федерация и включва етапа на скрининг (селекция) изследване за наличието на антитела срещу ХИВ с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) методи, одобрени за употреба, и етап на проверка (потвърждение) по-подробно изследване в лабораторията на градския център за СПИН. Трябва да се отбележи, че дори най-добрите системи за скрининг ELISA не гарантират 100% специфичност, т.е. има известна вероятност за получаване на неспецифични, фалшиво положителни резултати, свързани с характеристиките на кръвния серум на пациента. Следователно, положителен резултат от скрининг ELISA изследване може да не бъде потвърден при потвърдителни тестове, след което на пациента ще бъде даден отрицателен или неопределен резултат. Ако резултатът от потвърдителното изследване е несигурен, тестването трябва да се повтори след 2-3 седмици.

Лабораторната диагностика на HIV инфекцията при деца, родени от заразени с HIV майки, има свои собствени характеристики. Майчините антитела срещу HIV (клас IgG) могат да циркулират в кръвта им до 18 месеца от момента на раждането. Липсата на антитела срещу HIV при новородени не означава, че вирусът не е проникнал през плацентарната бариера. Деца на HIV-инфектирани майки подлежат на лабораторно диагностично изследване в рамките на 36 месеца след раждането.

Подготовка

Не е необходима специална подготовка. Препоръчително е кръвта да се вземе не по-рано от 4 часа след последното хранене. Можете да намерите общи препоръки за подготовка за изследване. Препоръчително е да се проведе тест за откриване на антиген и антитела срещу ХИВ не по-рано от две седмици след евентуална инфекция, с повторен тест след три и шест седмици в случай на отрицателен резултат. Заявленията за изследване в INVITRO LLC се попълват с помощта на паспорт или документ, който го замества (миграционна карта, временна регистрация по местоживеене, документ за самоличност на военен персонал, удостоверение от паспортната служба в случай на загуба на паспорт, регистрационна карта от хотел). Представеният документ трябва задължително да съдържа информация за временна или постоянна регистрация в Руската федерация и снимка. При липса на паспорт (документ, който го замества), пациентът има право да попълни анонимно заявление за даряване на биоматериал. При анонимен преглед, заявление и проба от биоматериал, получени от клиента, се присвоява номер, който е известен само на пациента и медицинския персонал, който е направил поръчката. ! Резултатите от анонимно проведени изследвания не могат да се предоставят за хоспитализация, професионални прегледи и не подлежат на регистрация в ОРУИБ.

Показания за употреба

• Увеличени лимфни възли в повече от две области.
• Левкопения с лимфопения.
• Нощно изпотяване.
• Внезапна загуба на тегло по неизвестна причина.
• Диария за повече от три седмици с неизвестна причина.
• Треска с неизвестна причина.
• Планиране на бременност.
• Предоперативна подготовка, хоспитализация.
• Откриване на следните инфекции или техните комбинации: туберкулоза, манифестна токсоплазмоза, често рецидивираща херпесвирусна инфекция, кандидоза на вътрешните органи, повторна невралгия на херпес зостер, пневмония, причинена от микоплазми, пневмоцисти или легионела.
• Сарком на Капоши в млада възраст.
• Случайни сексуални контакти.

Тълкуване на резултатите

Тълкуването на резултатите от изследването съдържа информация за лекуващия лекар и не е диагноза. Информацията в този раздел не трябва да се използва за самодиагностика или самолечение. Лекарят поставя точна диагноза, като използва както резултатите от това изследване, така и необходимата информация от други източници: медицинска история, резултати от други изследвания и др.

Мерни единици в независима лаборатория INVITRO: качествен тест. Форма на представяне на резултатите: при липса на антитела срещу HIV 1 и 2 и антиген p24 отговорът е „отрицателен“. Ако антитела срещу ХИВ или антиген се открият при скринингов ензимно-свързан имуносорбентен тест, се изпраща серумна проба за потвърждение чрез имуноблотинг в градския СПИН център, който потвърждава положителни и неопределени резултати.

Положителен резултат:

1. HIV инфекция;
2. фалшив положителен резултат, изискващ повторни или допълнителни изследвания *);
3. проучването не е информативно при деца под 18 месеца, родени от HIV-инфектирани майки.

*Специфичността на системата за скринингови тестове Антитела срещу HIV 1 и 2 и HIV антиген 1 и 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), според оценките, предоставени от производителя на реагента, е около 99,6% както в общата популация, така и в група пациенти с потенциални смущения (инфекции HBV, HCV, рубеола, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, Chl. trach. и др., автоимунни патологии (включително ревматоиден артрит, наличие на антинуклеарни антитела) , бременност, повишени нива на IgG, IgM, моноклонални гамапатии, хемодиализа, многократни кръвопреливания).