تفاعل سلسلة البوليمر. تعرف على ما هو "PCR" في القواميس الأخرى

GOU VPO "أكاديمية كراسنويارسك الطبية الحكومية"

سميت باسم وكالة ياسينيتسكي الفيدرالية للصحة والتنمية الاجتماعية »

قسم الوراثة الطبية والفيزيولوجيا العصبية السريرية IPO

المبادئ الأساسية للطريقة

تفاعل البوليميراز المتسلسل

دليل منهجي للطلاب 3-4 سنوات

في تخصصات الطب العام (060101) و

كراسنويارسك - 2007

شنايدر، N. A.، بوتيانوف، R. A. المبادئ الأساسية لطريقة تفاعل البلمرة المتسلسل. الدليل المنهجي للعمل اللامنهجي لطلاب السنوات 3-4 في تخصصات الطب العام (060101) وطب الأطفال (060103). – كراسنويارسك: دار النشر التابعة للمؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي KrasSMA، 2007. – 42 ص.

يتوافق دليل التدريس تمامًا مع متطلبات معيار الدولة (2000) ويعكس الجوانب الرئيسية للطريقة الحديثة لتشخيص الأمراض البشرية الوراثية - طريقة تفاعل البلمرة المتسلسل، ويتم تكييف المواد التعليمية مع التقنيات التعليمية، مع مراعاة التفاصيل التدريب لمدة 3-4 سنوات في كليات الطب وطب الأطفال.

المراجعون:رئيس قسم الوراثة الطبية بالمؤسسة التعليمية الحكومية للتعليم المهني العالي

"جامعة نوفوسيبيرسك الطبية الحكومية التابعة للوكالة الفيدرالية للصحة والتنمية الاجتماعية"، دكتوراه في العلوم الطبية، أستاذ؛

تكرار الحمض النووي

الهدف من دراسة هذه الطريقة هو الحمض النووي الريبي منقوص الأكسجين (DNA). الحمض النووي هو الناقل العالمي للمعلومات الوراثية في جميع الكائنات الحية الموجودة على الأرض (باستثناء الكائنات الحية الدقيقة التي تحتوي على الحمض النووي الريبي). الحمض النووي عبارة عن شريط مزدوج ملتوي في شكل حلزون. يتكون كل شريط من النيوكليوتيدات المتصلة بالتسلسل. خيوط الحمض النووي لها اتجاهان متعاكسان: نهاية 5 بوصات من أحد الخيوط تتوافق مع نهاية 3 بوصات من السلسلة الثانية. الخاصية الفريدة للحمض النووي هي قدرته على التضاعف. هذه العملية تسمى تكرار. يحدث تكرار جزيء الحمض النووي خلال الفترة الاصطناعية من الطور البيني. تعمل كل سلسلة من سلسلتي الجزيء "الأم" كقالب لـ "الابنة". بعد النسخ المتماثل، يحتوي جزيء الحمض النووي المركب حديثًا على شريط "أم" واحد، والثاني عبارة عن شريط "ابنة" مركب حديثًا (طريقة شبه محافظة). من أجل تصنيع قالب لجزيء DNA جديد، من الضروري أن يكون الجزيء القديم مستديرًا وممدودًا. يبدأ النسخ المتماثل في عدة أماكن في جزيء الحمض النووي. يسمى الجزء من جزيء DNA من نقطة بداية أحد التضاعفات إلى نقطة بداية تضاعف آخر نسخة طبق الأصل.

تم تنشيط بدء النسخ المتماثل الاشعال(البادئات) تتكون من 100-200 زوج من النيوكليوتيدات. يتفكك إنزيم هيليكاز الحمض النووي ويقسم حلزون الحمض النووي الأم إلى شريطين، حيث يتم تجميع خيوط الحمض النووي "الابنة"، وفقًا لمبدأ التكامل، بمشاركة إنزيم بوليميريز الحمض النووي. لكي يبدأ الإنزيم عمله، يلزم وجود كتلة البداية - جزء أولي صغير مزدوج الجديلة. يتم تشكيل كتلة البداية من خلال تفاعل التمهيدي مع المنطقة التكميلية للشريط المقابل من الحمض النووي الأصلي. في كل نسخة متماثلة، يمكن أن يتحرك بوليميراز الحمض النووي على طول الشريط "الأم" في اتجاه واحد فقط (5`=>3`).

على الخصلة الرائدة، بينما تنحل النسخة المتماثلة، تنمو الخصلة "الابنة" تدريجيًا بشكل مستمر. على الشريط المتأخر، يتم تصنيع الشريط الابن أيضًا في الاتجاه (5`=>3`)، ولكن في أجزاء منفصلة عندما يتم فك النسخة المتماثلة.

وبالتالي، فإن إضافة النيوكليوتيدات التكميلية للخيوط "الابنة" تحدث في اتجاهين متعاكسين (مضاد للتوازي). النسخ المتماثل في كافة النسخ المتماثلة يحدث في وقت واحد. يتم خياطة شظايا وأجزاء من الخيوط "الابنة" التي تم تصنيعها في نسخ مختلفة في خيط واحد بواسطة إنزيم الليجاز. يتميز النسخ المتماثل بشبه المحافظة، وعدم التوازي، والانقطاع. يتم تكرار جينوم الخلية بأكمله مرة واحدة خلال فترة زمنية تقابل دورة انقسامية واحدة. نتيجة لعملية النسخ، يتم تشكيل جزيئين من الحمض النووي من جزيء DNA واحد، حيث يكون أحدهما من جزيء الحمض النووي الأم، والثاني من الابنة، تم تصنيعه حديثًا (الشكل 1).

أرز. 1. مخطط تكرار جزيء الحمض النووي.

وهكذا تشمل دورة تكرار الحمض النووي ثلاث مراحل رئيسية:

1. تفكيك حلزون الحمض النووي وتباعد الخيوط (تمسخها)؛

2. إرفاق الاشعال.

3. استكمال سلسلة الخيط الطفل.

مبدأ طريقة PCR

إن تكرار الحمض النووي هو الذي يشكل أساس تفاعل البوليميراز المتسلسل. في PCR، يتم تنفيذ العمليات المذكورة أعلاه في أنبوب اختبار في الوضع الدوري. يتم الانتقال من مرحلة تفاعل إلى أخرى عن طريق تغيير درجة حرارة خليط الحضانة. عندما يتم تسخين المحلول إلى 93-95 درجة مئوية، يحدث تمسخ الحمض النووي. للانتقال إلى المرحلة التالية - إضافة أو "تلدين" البادئات - يتم تبريد خليط الحضانة إلى 50-65 درجة مئوية. بعد ذلك، يتم تسخين الخليط إلى 70-72 درجة مئوية - وهي الدرجة المثالية لبوليميراز الحمض النووي - في هذه المرحلة يحدث بناء شريط DNA جديد. ثم تتكرر الدورة مرة أخرى. بعبارة أخرى طريقة PCR هي زيادة متعددة في رقم النسخة (التضخيم) جزء محدد من الحمض النووي يتم تحفيزه بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي.

يجب أن يحدث نمو خيوط الحمض النووي الابنة في وقت واحد على كلا شريطي الحمض النووي للأم، لذا فإن تكرار الشريط الثاني يتطلب أيضًا بادئًا خاصًا به. وهكذا، تتم إضافة بادئين إلى خليط التفاعل: أحدهما للسلسلة "+"، والثاني للسلسلة "-". بعد أن تعلق على الخيوط المقابلة لجزيء الحمض النووي، تقتصر البادئات على الجزء الذي سيتم تكراره أو تضخيمه عدة مرات لاحقًا. ويبلغ طول هذه القطعة، التي تسمى الأمبليكون، عادة عدة مئات من النيوكليوتيدات.

مراحل تفاعل البوليميراز المتسلسل

تتضمن كل دورة تضخيم 3 مراحل، تحدث في ظروف درجات حرارة مختلفة (الشكل 2).

· المرحلة 1:تمسخ الحمض النووي . يحدث عند 93-95 درجة لمدة 30-40 ثانية.

· المرحلة 2:الصلب التمهيدي . يحدث ارتباط البادئات بشكل مكمل للتسلسلات المقابلة على خيوط الحمض النووي المتقابلة عند حدود منطقة معينة. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. وقت التلدين 20-60 ثانية.

· المرحلة 3:إكمال سلاسل الحمض النووي: يحدث الإكمال التكميلي لسلاسل الحمض النووي من الطرف 5 بوصة إلى الطرف 3 بوصة من السلسلة في اتجاهين متعاكسين، بدءًا من مواقع الارتباط التمهيدي. المادة المستخدمة في تصنيع سلاسل الحمض النووي الجديدة هي ثلاثي فوسفات ديوكسي ريبونوكليوسيد المضاف إلى المحلول. يتم تحفيز عملية التوليف بواسطة إنزيم بوليميراز طق ويتم عند درجة حرارة 70-72 درجة مئوية. وقت التوليف هو 20-40 ثانية.

تعمل سلاسل الحمض النووي الجديدة التي تشكلت في دورة التضخيم الأولى كقوالب لدورة التضخيم الثانية، حيث يتم تشكيل جزء محدد من DNA amplicon (الشكل 3). في دورات التضخيم اللاحقة، تعمل الأمبليكونات كقالب لتركيب سلاسل جديدة.

وبالتالي، فإن تراكم الأمبليكونات في المحلول يحدث وفقًا للصيغة 2"، حيث n هو عدد دورات التضخيم. لذلك، حتى لو كان الحل الأولي يحتوي في البداية على جزيء DNA واحد مزدوج الجديلة، ثم في 30-40 دورة حول يتراكم في المحلول 108 جزيئات من الأمبليكون، وهذه الكمية كافية للكشف البصري الموثوق به عن هذه القطعة عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز.

تتم عملية التضخيم في منظم حرارة خاص قابل للبرمجة ( دورة حرارية)، والذي، وفقًا لبرنامج معين، يغير درجات الحرارة تلقائيًا وفقًا لعدد دورات التضخيم.

لتنفيذ التضخيم، المكونات التالية مطلوبة:

· مصفوفة الحمض النووي(الحمض النووي أو جزء منه يحتوي على الجزء المحدد المطلوب)؛

· الاشعال(أليغنوكليوتيدات صناعية (20-30 زوجًا من النيوكليوتيدات)، مكملة لتسلسلات الحمض النووي عند حدود الجزء المحدد الذي يتم تحديده). يلعب اختيار جزء محدد واختيار الاشعال دورًا حاسمًا في خصوصية التضخيم، مما يؤثر على جودة التحليل.

· خليط من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد (dNTPs)(خليط من أربعة dNTPs، وهي المادة اللازمة لتخليق سلاسل DNA التكميلية الجديدة بتركيزات مكافئة تبلغ 200-500 ميكرومتر)

· إنزيمطق-بوليميراز(بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة الذي يحفز استطالة السلاسل التمهيدية عن طريق الإضافة المتتابعة لقواعد النيوكليوتيدات إلى السلسلة المتنامية من الحمض النووي المركب، 2-3 ملم).

· محلول منظم(وسط التفاعل الذي يحتوي على أيونات Mg2+ الضرورية للحفاظ على نشاط الإنزيم، درجة الحموضة 6.8-7.8).

لتحديد مناطق محددة من جينوم فيروسات الحمض النووي الريبوزي (RNA)، يتم الحصول أولاً على نسخة الحمض النووي (DNA) من قالب الحمض النووي الريبي (RNA) باستخدام تفاعل النسخ العكسي (RT) المحفز بواسطة إنزيم الراجع (النسخ العكسي).

أرز. 2. التضخيم (الدورة الأولى).

أرز. 3. التضخيم (الدورة الثانية).

التطبيقات الرئيسية لـ PCR

· الطب السريري:

o تشخيص الالتهابات،

o تحديد الطفرات، بما في ذلك تشخيص الأمراض الوراثية،

o التنميط الجيني، بما في ذلك التنميط الجيني HLA،

o التقنيات الخلوية

· البيئة (كوسيلة لمراقبة حالة وجودة الأشياء البيئية والمنتجات الغذائية)

· تحديد الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs)

تحديد الهوية الشخصية، إثبات الأبوة، الطب الشرعي

· علم الأحياء العام والخاص،

المبادئ الأساسية

تنظيم المختبرات التشخيصية

يتم العمل في مختبر PCR وفقًا لـ "قواعد التصميم واحتياطات السلامة والصرف الصحي الصناعي ونظام مكافحة الأوبئة والنظافة الشخصية عند العمل في المختبرات (الإدارات والأقسام) التابعة للمؤسسات الصحية والوبائية التابعة لنظام الرعاية الصحية.

تلوث عينات الحمض النووي

يرتبط إجراء تشخيص PCR بمشكلة بسبب الحساسية العالية للطريقة - الاحتمال تلوث اشعاعى. يؤدي إدخال كميات ضئيلة من الحمض النووي الإيجابي في أنبوب التفاعل (منتجات تضخيم الحمض النووي المحددة - الأمبليكونات؛ معيار الحمض النووي المستخدم كعنصر تحكم إيجابي؛ الحمض النووي الإيجابي من عينة سريرية) إلى تضخيم جزء معين من الحمض النووي أثناء تفاعل البوليميراز المتسلسل، ونتيجة لذلك ، لظهور نتائج إيجابية كاذبة.

في عملية العمل قد تواجهك نوعين من التلوث:

1. التلوث المتبادلمن عينة إلى أخرى (أثناء معالجة العينات السريرية أو عند إذابة خليط التفاعل)، مما يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة متفرقة؛

2. التلوث بمنتجات التضخيم(الأمبليكونات)، وهو ذو أهمية قصوى، لأنه أثناء عملية PCR، تتراكم الأمبليكونات بكميات هائلة وهي منتجات مثالية لإعادة التضخيم.

يؤدي تلوث الأواني الزجاجية والماصات الأوتوماتيكية ومعدات المختبرات أو سطح مقاعد المختبر أو حتى سطح جلد العاملين في المختبر بكميات ضئيلة من الأمبليكون إلى نتائج إيجابية كاذبة منهجية. قد يكون تحديد مصدر التلوث أمرًا صعبًا للغاية ويتطلب استثمارًا كبيرًا للوقت والمال. تتيح لنا الخبرة المكتسبة حتى الآن في المختبرات التي تستخدم طريقة PCR للتشخيص صياغة المتطلبات الأساسية لتنظيم هذه المختبرات وإجراء التحليلات نفسها. الامتثال لهذه المتطلبات يلغي احتمال التلوث والنتائج الإيجابية الكاذبة.

مراحل تحليل PCR

ويتم فصلهما جغرافيًا عن طريق وضعهما في غرف منفصلة (الشكل 4، 5):

· غرفة ما قبل PCR،حيث تتم معالجة العينات السريرية، وعزل الحمض النووي، وإعداد خليط التفاعل لـ PCR، وإجراء PCR (في حالة توفر الظروف، يوصى أيضًا بتنفيذ المرحلتين الأخيرتين في غرفة منفصلة إضافية). في هذه المباني، يُحظر تنفيذ جميع أنواع العمل الأخرى باستخدام عوامل الاختبار، والتي يتم إجراء تشخيصات PCR لها في هذا المختبر.

· غرفة ما بعد PCR،حيث يتم الكشف عن منتجات التضخيم. يمكن استخدام طرق كشف أخرى في هذه الغرفة. يُنصح بتحديد موقع غرفة الكشف عن منتج التضخيم بعيدًا قدر الإمكان عن غرف ما قبل PCR.

تم تجهيز غرف العمل بمصابيح فوق بنفسجية بأقصى إشعاع في المنطقة 260 نانومتر (نوع DB-60) بمعدل 2.5 وات لكل 1 م3. توجد المصابيح بحيث تتعرض أسطح طاولات العمل والمعدات والمواد التي يتصل بها المشغل أثناء تحليل PCR للإشعاع المباشر. يتم إجراء التشعيع خلال ساعة واحدة قبل بدء العمل وخلال ساعة واحدة بعد الانتهاء من العمل.

يعمل أطباء المختبرات بملابس مختبرية خاصة، يتم تغييرها عند الانتقال من غرفة إلى أخرى، وقفازات يمكن التخلص منها. تتم معالجة الملابس من غرف مختلفة بشكل منفصل. يعمل موظفون مختلفون في مراحل مختلفة من تحليل PCR.

للعمل، يتم استخدام مجموعات منفصلة من الموزعات والأواني البلاستيكية والزجاجية ومعدات المختبرات والعباءات والقفازات، المخصصة لمراحل التحليل المختلفة وغير المحمولة من غرفة إلى أخرى. يتم وضع علامة مناسبة على المعدات والمواد والإمدادات في كل غرفة.

يتم تنفيذ جميع مراحل العمل فقط باستخدام المواد الاستهلاكية التي يمكن التخلص منها: أطراف الماصات الأوتوماتيكية، وأنابيب الاختبار، والقفازات، وما إلى ذلك. تأكد من تغيير النصائح عند الانتقال من عينة إلى أخرى. من الضروري استخدام الأطراف مع مرشح - حاجز الهباء الجوي لمنع قطرات المحلول الدقيقة من دخول الماصة. يتم التخلص من الأنابيب والأطراف المستعملة في حاويات خاصة أو حاويات تحتوي على محلول مطهر. يتم تخزين العينات السريرية بشكل منفصل عن الكواشف.

لمعالجة وتنظيف مكان العمل، تم تجهيز كل غرفة بمسحات الشاش القطني (المناديل)، والملاقط، والمحاليل المطهرة والمعطلة.

يستثني المختبر التشخيصي PCR العمل المتعلق بإنتاج (الاستنساخ) وعزل البلازميدات المؤتلفة التي تحتوي على تسلسلات DNA أو أجزاء جينية من مسببات الأمراض التي يتم تشخيصها في هذا المختبر.

جمع المواد السريرية

يمكن أن تكون المواد التي سيتم دراستها من أجل PCR عبارة عن قصاصات من الخلايا الظهارية والدم والبلازما والمصل والسوائل الجنبية والدماغية الشوكية والبول والبلغم والمخاط والإفرازات البيولوجية الأخرى والخزعات.

يتم جمع المواد في غرفة معالجة ذات ملف تعريف مناسب. بعد جمع العينات، ينبغي تسليم العينات إلى مختبر التشخيص PCR في أقرب وقت ممكن.

يجب أخذ العينات باستخدام أدوات معقمة، ويفضل أن تكون قابلة للاستخدام مرة واحدة، فقط في أنابيب بلاستيكية أو أنابيب زجاجية معقمة يمكن التخلص منها، ومعالجتها مسبقًا لمدة ساعة بخليط الكروم، وغسلها جيدًا بالماء المقطر ومكلسها في خزانة تجفيف عند درجة حرارة 150 درجة مئوية. لمدة 1 ساعة.

منطقة الكشف (طابق آخر أو مبنى آخر).

أرز. 4. جهاز مختبر PCR مع الكشف بالرحلان الكهربائي.

منطقة الكشف (طابق آخر أو مبنى آخر)

أرز. 5. جهاز مختبر PCR مع كشف الفلورسنت (التحليل الكمي).

أرز. 6. غرفة استخراج الحمض النووي.يظهر في الصورة صندوق منضدية به مصباح مبيد للجراثيم.

أرز. 7. غرفة التضخيم.

أرز. 8. غرفة الكشف.

أرز. 9. عينات الدم لتشخيص الحمض النووي للأمراض الوراثية.

تخزين العينات ونقلها

لتشخيص الأمراض الوراثية، يتم تخزين عينات الدم في نماذج ورقية خاصة أو في إبيندورف (أنابيب بلاستيكية) في حالة مجمدة لفترة طويلة (الشكل 9).

لتشخيص الأمراض المعدية، يتم الاحتفاظ بالعينات في درجة حرارة الغرفة لمدة لا تزيد عن ساعتين. إذا كانت هناك حاجة للتخزين لفترة أطول، يمكن وضع العينات في الثلاجة عند درجة حرارة 2-8 درجة مئوية لمدة لا تزيد عن يوم واحد. يُسمح بالتخزين الأطول (حتى أسبوعين) في الثلاجة عند درجة حرارة تقل عن 20 درجة مئوية. لا يسمح بالتجميد والذوبان المتكرر للعينات.

إذا كان مختبر التشخيص PCR وغرفة الإجراءات لأخذ العينات منفصلين جغرافياً، فيجب أن يتم نقل العينات في ترمس أو حاويات حرارية مع مراعاة قواعد تخزين العينات وقواعد نقل المواد المعدية.

استخراج الحمض النووي من العينات

أصبحت طريقة الامتصاص في الطور الصلب منتشرة على نطاق واسع، والتي تتكون من إضافة عامل تحلل يحتوي على محلول الجوانيدين، وامتصاص الحمض النووي على مادة ماصة، والغسيل المتكرر، وامتصاص الحمض النووي بمحلول منظم. عند معالجة المصل أو البلازما أو الدم الكامل، عادة ما يتم استخدام طريقة استخلاص الفينول. تتضمن الطريقة إزالة البروتين باستخدام الفينول/الكلوروفورم متبوعًا بترسيب الحمض النووي (أو الحمض النووي الريبي) باستخدام الإيثانول أو الأيزوبروبانول. تتم المعالجة في أنابيب الطرد المركزي الصغيرة Eppendor P بحجم 1.5 مل. وقت المعالجة هو 1.5-2 ساعة (الشكل 10).

أرز. 10. استخراج الحمض النووي.

إجراء PCR

يتم نقل كمية معينة من العينة من العينة السريرية المعالجة إلى أنبوب طرد مركزي صغير خاص من نوع إيبندورف بحجم 0.2 أو 0.5 مل، ويتم إضافة خليط تضخيم يتكون من الماء ومحلول PCR المؤقت ومحلول dNTP ومحلول التمهيدي والمحلول إلى نفس الأنبوبة طق بوليميريز (يضاف إلى الخليط أخيرا) وعادة يكون حجم خليط التفاعل 25 ميكرولتر ثم تضاف قطرة واحدة من الزيت المعدني إلى كل أنبوب لمنع تبخر خليط التفاعل أثناء عملية التضخيم. يتم نقل الأنابيب إلى منظم حرارة قابل للبرمجة (مضخم)، حيث يتم التضخيم تلقائيًا وفقًا لبرنامج معين (الشكل 11).

أرز. أحد عشر. المضخم " دراجة حرارية ».

وقت رد الفعل، اعتمادا على البرنامج المحدد، هو 2-3 ساعات. بالتوازي مع العينات التجريبية، يتم وضع عينات المراقبة: تشمل المراقبة الإيجابية جميع مكونات التفاعل، ولكن بدلاً من مادة العينة السريرية، تتم إضافة تحضير الحمض النووي للجين قيد الدراسة. تشمل المراقبة السلبية جميع مكونات التفاعل، ولكن بدلاً من المواد السريرية أو تحضير الحمض النووي، تتم إضافة كمية مناسبة من الماء منزوع الأيونات أو مستخلص لا يحتوي على الحمض النووي الذي يتم اختباره. السيطرة السلبية ضرورية للتحقق من مكونات التفاعل لعدم وجود الحمض النووي بسبب التلوث واستبعاد النتائج الإيجابية الكاذبة.

تسجيل النتائج

يتم الكشف عن جزء الحمض النووي المحدد المضخم عن طريق الفصل الكهربائي لهلام الاغاروز في وجود بروميد الإيثيديوم. يشكل بروميد الإيثيديوم مركبًا خلاليًا مستقرًا مع شظايا الحمض النووي، والذي يظهر على شكل أشرطة مضيئة عند تشعيع الجل بالأشعة فوق البنفسجية بطول موجة 290-330 نانومتر. اعتمادًا على حجم الأمبليكونات المتكونة نتيجة تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم استخدام هلام يحتوي على نسبة أغاروز تتراوح من 1.5% إلى 2.5%. لتحضير هلام الاغاروز، يتم إذابة خليط من الاغاروز والمحلول المنظم والماء في فرن ميكروويف أو في حمام مائي، ويضاف محلول بروميد الإيثيديوم. يُسكب الخليط، المبرد إلى 50-60 درجة مئوية، في القالب بطبقة بسمك 4-6 مم، وباستخدام أمشاط خاصة، يتم عمل جيوب في الجل لوضع العينة. يتم تثبيت الأمشاط بحيث تبقى طبقة من الاغاروز بسمك 0.5-1 مم بين قاع الآبار وقاعدة الجل. بعد أن يتصلب الجل، يتم تطبيق مكبر للصوت على الجيوب بمبلغ 5-15 ميكرولتر. من المستحسن إجراء الرحلان الكهربائي لخليط من علامات طول جزء الحمض النووي بالتوازي مع العينات الضابطة والتجريبية. عادة، يحتوي هذا الخليط على عشرة أجزاء من الحمض النووي بطول 100، 200، 300، إلخ. أزواج أساسية.

إن استخدام مثل هذا الاختبار يجعل من الممكن التحقق من طول الأمبليكونات في العينات الضابطة والتجريبية. يتم نقل الجل مع العينة المطبقة إلى غرفة الرحلان الكهربائي المملوءة بالمخزن المؤقت، ويتم توصيل الغرفة بمصدر طاقة ويتم إجراء الفصل الكهربي لمنتجات التضخيم لمدة 30-45 دقيقة عند شدة مجال كهربائي تبلغ 10-15 فولت/ سم. في هذه الحالة، يجب أن تتحرك مقدمة الصبغة الموجودة في خليط التفاعل مسافة 3 سم على الأقل.

بعد اكتمال الفصل الكهربائي، يتم نقل الجل إلى جهاز نقل زجاجي ومشاهدته تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية. للتوثيق، يتم تصوير الجل على فيلم Micrat 300 أو تسجيله باستخدام نظام فيديو متصل بالكمبيوتر.

أولا وقبل كل شيء، يتم تقييم عينات المراقبة. يجب أن يكون هناك شريط متوهج برتقالي في المسار الكهربي المتوافق مع التحكم الإيجابي. يجب أن تتوافق حركتها الكهربية مع طول الأمبليكون المحدد في التعليمات.

في المسار الكهربي المطابق للتحكم السلبي، يجب أن يكون هذا النطاق غائبًا. يشير وجود مثل هذا النطاق في التحكم السلبي إلى التلوث - تلوث الكواشف المستخدمة في اختبار الحمض النووي أو الأمبليكون. يتم تقييم عينات الاختبار من خلال وجود نطاق في المسار المقابل، والذي يقع على نفس مستوى النطاق في عينة التحكم الإيجابية. تتوافق كثافة الفرقة مع كمية الحمض النووي التي يتم اختبارها في العينة، مما يسمح بإجراء تقييم شبه كمي لـ PCR. عادة، يتم تقييم النتائج الإيجابية على مقياس من أربع نقاط. إذا كان توهج النطاق في عينة الاختبار ضعيفًا جدًا، فيجب إعادة ترتيب هذه العينة (الشكل 12).

أرز. 12. الاغاروز الكهربائي للهلام.

تطبيقات PCR لتشخيص الطفرات النقطية وتعدد أشكال الجينات

أحد المجالات الرائدة لتطبيق تفاعل البوليميراز المتسلسل في الرعاية الصحية العملية هو تشخيص الطفرات النقطية وتعدد أشكال الجينات . هناك طرق مباشرة وغير مباشرة لتشخيص الحمض النووي. في الحالات التي يكون فيها الجين معروفًا، يؤدي تلفه إلى تطور مرض وراثي، ويمكن اكتشاف هذا الضرر بالطرق الوراثية الجزيئية. تسمى هذه الأساليب مباشرة. باستخدام الطرق المباشرة، يتم الكشف عن المخالفات في تسلسل النوكليوتيدات الأولية للحمض النووي (الطفرات وأنواعها). وتتميز الطرق المباشرة بالدقة التي تصل إلى 100% تقريبًا.

ومع ذلك، في الممارسة العملية، يمكن استخدام هذه الأساليب في ظل ظروف معينة:

· مع التوطين الخلوي المعروف للجين المسؤول عن تطور مرض وراثي.

· يجب استنساخ جين المرض ومعرفة تسلسله النوكليوتيدي.

الغرض من تشخيص الحمض النووي المباشر هو تحديد الأليلات الطافرة.

وبالتالي، في الحالات التي يكون فيها نوع تلف الحمض النووي معروفًا والذي يؤدي إلى مرض وراثي، يتم فحص جزء الحمض النووي الذي يحتوي على الضرر مباشرةً، أي يتم استخدام طريقة تشخيص الحمض النووي المباشر.

ومع ذلك، حتى الآن، لم يتم تعيين جينات العديد من الأمراض، وتنظيمها إكسون-إنترون غير معروف، وتتميز العديد من الأمراض الوراثية بعدم التجانس الوراثي الواضح، والذي لا يسمح بالاستخدام الكامل لطرق تشخيص الحمض النووي المباشر. لذلك، في الحالات التي يكون فيها موضع الضرر غير معروف، يتم استخدام نهج آخر، يتعلق بدراسة محيط الجين المسؤول عن المرض الجيني، بالاشتراك مع التحليل العائلي، أي الطرق غير المباشرة للتشخيص الوراثي الجزيئي للمرض. تستخدم الأمراض الوراثية.

يمكن استخدام طرق مختلفة للكشف عن الطفرات النقطية وعمليات الحذف الصغيرة، ولكنها جميعًا تعتمد على طريقة PCR. يتيح لك هذا التفاعل مضاعفة تسلسل نيوكليوتيدات الحمض النووي عدة مرات ثم البحث عن الطفرات. تعتمد طرق البحث عن أجزاء الحمض النووي التي تحمل طفرات على تحليل مقارن لتسلسلات نيوكليوتيدات الحمض النووي المتحولة والعادية.

تحليل منتجات PCR

في عملية تشخيص الحمض النووي المباشر

يتضمن دراسة السمات المحددة لمنطقة الجينات المتضخمة. وهكذا، في الأمراض الناجمة عن توسع تكرارات ثلاثي النوكليوتيد، تختلف منتجات التضخيم في طولها (مما يعكس العدد المختلف للثلاثية التوائم في منطقة الجينات المدروسة)، ونتيجة لذلك، في سرعة حركتها في الجل. بفضل هذا، يتم تحقيق فصل كهربي واضح للأليلات الطبيعية والمتحولة وتحديد دقيق للجزء الممدود من الناحية المرضية، أي تشخيص الحمض النووي للمرض (الشكل 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width = "417" height = "110 src = ">

أرز. 14. تشخيص الحذف أسكت في الجين DYT 1 في المرضى الذين يعانون من خلل التوتر العضلي المستقل عن دوبا (الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد). الممرات 2،3،6 – مريضة؛ المسارات 1،4،5 - التحكم. يشير السهم الرفيع إلى الأليل الطبيعي، ويشير السهم السميك إلى الأليل الأقصر المتحول (حذف ثلاث نيوكليوتيدات).

إذا كانت منطقة الحمض النووي بأكملها قيد الدراسة جزءًا من عملية حذف ممتدة، فلن يتم إجراء تضخيم الحمض النووي PCR من هذا الأليل المحذوف بسبب عدم وجود مواقع للتهجين التمهيدي. في هذه الحالة، سيتم تشخيص الحذف المتماثل على أساس الغياب الكامل لمنتج تفاعل PCR (تخليق الحمض النووي مستحيل من كلا نسختي الجين). من خلال الحذف المتغاير، من الممكن اكتشاف منتج PCR تم تصنيعه من أليل طبيعي (محتجز)؛ ومع ذلك، لتشخيص مثل هذه الطفرة بشكل موثوق، من الضروري استخدام طرق تصوير الحمض النووي الأكثر تعقيدًا التي تسمح بتقدير جرعة تفاعل البوليميراز المتسلسل النهائي منتج.

لتحديد الطفرات النقطية (في أغلب الأحيان بدائل النوكليوتيدات) في مواقع معينة، يتم استخدام طريقة PCR مع طرق أخرى للتحليل الوراثي الجزيئي. إذا كان موقع وطبيعة طفرة النقطة المفترضة معروفين بدقة، فإن تقييد النواة النووية (أنزيمات التقييد) هي إنزيمات خلوية خاصة معزولة من سلالات مختلفة من البكتيريا.

تتعرف هذه الإنزيمات على تسلسلات نيوكليوتيدات محددة يتراوح طولها من أربعة إلى عشرة نيوكليوتيدات. بعد ذلك، يتم تنفيذ تقييد (خط العرض (القطع)) لهذه التسلسلات كجزء من جزيء الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. يتعرف كل إنزيم تقييد على تسلسل نيوكليوتيدات محدد ومحدد بدقة ويقطعه في مكان ثابت - موقع التقييد (موقع الاعتراف).

في الحالات التي تؤدي فيها طفرة نقطية إلى تغيير موقع التعرف الطبيعي لإنزيم تقييد معين، لن يتمكن هذا الإنزيم من قطع الجزء الطافر المضخم بواسطة PCR. في بعض الحالات، تؤدي الطفرة إلى ظهور موقع جديد للتعرف على إنزيم تقييد معين يكون غائبًا بشكل طبيعي.

في كلتا الحالتين، ستنتج منتجات PCR المتحولة والعادية المعالجة باستخدام إنزيم التقييد المحدد شظايا تقييد ذات أطوال مختلفة، والتي يمكن اكتشافها بسهولة عن طريق الرحلان الكهربائي (الشكل 15).

وبالتالي، إذا كان من الضروري اكتشاف أي طفرة نقطية محددة بسرعة، فسيتم تقليل المهمة إلى البحث عن إنزيم التقييد المقابل، والذي يتم تحديد موقع التعرف عليه في موقع تسلسل النيوكليوتيدات المعطل. إن معالجة منتجات PCR باستخدام إنزيم التقييد هذا سيجعل من الممكن التمييز بسهولة بين الأليلات الطبيعية والمتحولة. يبسط تحليل التقييد إلى حد كبير اكتشاف الطفرات النقطية المعروفة ويستخدم الآن على نطاق واسع لتشخيص الحمض النووي المباشر للأمراض الوراثية.

المرحلة النهائية التحليل الوراثي الجزيئي للطفراتهو تحديد تسلسل النيوكليوتيدات لجزء الحمض النووي قيد الدراسة (التسلسل)، والذي يتم مقارنته بالمعيار ويتم صياغة التشخيص الجيني النهائي. بفضل النجاحات التي حققها علم الوراثة الجزيئي، تم الآن تطوير طرق تشخيص الحمض النووي لأكثر من 400 مرض وراثي.

أرز. 15. الكشف عن طفرة النقطة باستخدام تحليل التقييد:أ - منطقة الجينات المتضخمة التي تحتوي على موقع تقييدAGCTلتقييد نوكليازألو أنا. طفرهز→ أيغير تسلسل النيوكليوتيدات هذا، مما يؤدي إلى إنزيم التقييدألويمحظور؛ ب – الرسم الكهربي لمنتجات التقييد: المسار 1 – التماثل الجيني للأليل الطبيعي؛ المسار 2 - تماثل الزيجوت للطفرة؛ المسار 3 - حالة متغايرة الزيجوت (أليل طبيعي + طفرة).

إن تشخيص الأمراض الوراثية، بناءً على الفحص المباشر للأليلات الطافرة لدى المرضى أو أفراد أسرهم أو الحاملين المتغايرين للطفرات المرضية، مناسب للتشخيص قبل ظهور الأعراض وقبل الولادة، والذي يمكن تطبيقه في المراحل الأولى من نمو الجنين، قبل أن يتم تشخيصه. ظهور أي أعراض سريرية أو بيوكيميائية للأمراض.

بغض النظر عن طريقة اكتشاف الطفرة، لا يمكن الحصول على الخصائص الجزيئية الدقيقة لكل طفرة إلا عن طريق التسلسل المباشر. لأتمتة هذه العملية، تم استخدام أجهزة خاصة على نطاق واسع في السنوات الأخيرة - أجهزة التسلسل، والتي تجعل من الممكن تسريع عملية قراءة معلومات الحمض النووي بشكل كبير.

يتم فتح الطريق إلى الاستخدام الأوسع للبحوث البيولوجية الجزيئية في مختبرات التشخيص السريري من خلال تسريع العملية التحليلية من خلال تنفيذ جميع الإجراءات في سلسلة واحدة متواصلة، دون نقل العينات، وتهيئة الظروف لمنع التلوث أثناء الاختبار المتوازي لعدد من التحاليل وتسجيل موضوعي النتائج في كل دورة.

التعديلات الرئيسية لطريقة PCR

يستخدم للمسح السريع والبحث عن الطفرات الجينية المعروفة.

متعدد (متعدد التمهيدي) PCR

تعتمد هذه الطريقة على التضخيم المتزامن لعدة إكسونات من الجين قيد الدراسة في تفاعل واحد. وهذا يسمح بإجراء فحص سريع وفعال من حيث التكلفة للطفرات الأكثر شيوعًا. على سبيل المثال، من أجل التشخيص السريع لحمل عمليات الحذف في جين الدستروفين لدى المرضى الذين يعانون من الحثل العضلي الدوشيني/بيكر التقدمي، يتم إجراء تضخيم متزامن لمجموعة من الإكسونات الأكثر تحورًا لهذا الجين. نظرًا لأن هذه الأمراض موروثة بطريقة متنحية مرتبطة بـ X وترتبط بتلف كروموسوم X الوحيد عند الأولاد، في حالة الحذف الممتد، سيكشف الترحيل الكهربائي لنواتج التفاعل عن عدم وجود جزء أو أكثر من أجزاء الحمض النووي (إكسونات) )، والتي يمكن أن تكون بمثابة تأكيد جزيئي للتشخيص. وبالإضافة إلى ذلك، من خلال اختيار أقسام الجينات المحددة لتضخيم PCR، من الممكن إجراء تقييم دقيق إلى حد ما للطول الإجمالي للحذف ونقاط توقف الجينات (وصولاً إلى إكسون).

إن الاستخدام المشترك للعديد من التفاعلات المتعددة يجعل من الممكن تشخيص ما يصل إلى 98٪ من جميع عمليات الحذف التي تحدث في المرضى الذين يعانون من الحثل العضلي الدوشيني / بيكر التدريجي. يمثل هذا ما يقرب من 60٪ من إجمالي عدد الطفرات المعروفة في جين الديستروفين ويشير إلى الكفاءة العالية جدًا لطريقة الفحص هذه لتشخيص الحمض النووي لاعتلالات الديستروفين (الشكل 16).

أرز. 16. التشخيص المباشر للحمض النووي لضمور العضلات الدوشيني باستخدام PCR المتعدد (الرحلان الكهربائي لهلام الاغاروز). في كل فرد من الأفراد الذين تم فحصهم، تم تضخيم أربعة إكسونات من جين الديستروفين في وقت واحد (إكسونات 17 و19 و44 و45؛ تشير الأسهم إلى منتجات التضخيم المقابلة). المسار 1 - التحكم، الممرات 2-5 - مرضى الحثل العضلي الدوشيني مع عمليات حذف مختلفة لجين الدستروفين (المساران 2 و 5 - حذف إكسون 45، المسار 3 - حذف إكسون 44، المسار 4 - حذف إكسون 17 و 19 ).

تضخيم أليل محدد

تعتمد الطريقة على استخدام زوجين مستقلين من البادئات لمنطقة جينية محددة: يكون البادئ واحد شائعًا في كلا الزوجين، والبادئ الثاني في كل زوج له بنية مختلفة ومكمل إما لتسلسل الحمض النووي الطبيعي أو المتحور. ونتيجة لهذا التفاعل، يمكن تصنيع نوعين من منتجات PCR في وقت واحد في المحلول - العادي والمتحول. علاوة على ذلك، فإن تصميم البادئات المستخدمة يجعل من الممكن التمييز بوضوح بين منتجات التضخيم الطبيعية والمتحولة حسب حجمها الجزيئي. هذه الطريقة مرئية للغاية وتسمح لك بالتحقق من النقل المتماثل والمتغاير للأليل المتحول.

طريقة التعديل الموجه للموقع للحمض النووي المضخم

تعتمد الطريقة على استخدام ما يسمى ببادئ عدم التطابق في تفاعل البوليميراز المتسلسل (ليس مكملاً تمامًا للقالب)، والذي يختلف عن تسلسل الحمض النووي للقالب بنيوكليوتيد واحد. نتيجة لإدراج التمهيدي المحدد في منتج PCR المتحول، يتم تشكيل موقع تقييد تم إنشاؤه بشكل مصطنع لأحد نوكليازات التقييد الداخلية، مما يسمح بتشخيص الحمض النووي المباشر لطفرة معينة معروفة باستخدام تحليل التقييد. ويعد إنشاء موقع التقييد الاصطناعي هذا ضروريا إذا لم يكشف البحث عن وجود إنزيم معروف ومتوفر، والذي يتأثر موقع التقييد "الطبيعي" الخاص به نتيجة ظهور الطفرة التي تتم دراستها في جزيء DNA .

طريقة النسخ العكسي PCR (ر.ت- تفاعل البوليميراز المتسلسل)

يتم استخدام هذه الطريقة في الحالات التي يكون فيها أكثر ملاءمة لاستخدام الحمض النووي الجينومي ليس كموضوع للدراسة، ولكن [كدنا] أكثر إحكاما وغنية بالمعلومات يتم الحصول عليها بعد المعالجة المناسبة لعينات الأنسجة، على سبيل المثال، مادة الخزعة أو خطوط الخلايا من الخلايا الليمفاوية، الخلايا الليفية، وما إلى ذلك. الشرط المهم هنا هو التعبير (على الأقل في الحد الأدنى) عن الجين المطلوب في الأنسجة قيد الدراسة.

في المرحلة الأولى، يتم إجراء النسخ العكسي للmRNA، وتكون جزيئات cDNA الناتجة بمثابة قالب لـ PCR. بعد ذلك، تخضع المنطقة الحرجة من [كدنا]، التي يتم تضخيمها بكمية كافية، للتسلسل وطرق أخرى لفحص الطفرات، أو الدراسة الكهربية المباشرة (الكشف عن عمليات الحذف، والإدراج، وما إلى ذلك) أو التكامل في نظام التعبير من أجل الحصول على منتج بروتيني. وتحليلها المباشر.

تعتبر هذه الطريقة فعالة بشكل خاص في اكتشاف الطفرات التي تؤدي إلى تخليق البروتين "المقطوع" (الطفرات الهراء، طفرات الربط، عمليات الحذف الكبيرة) - ما يسمى بتحليل PTT (اختبار اقتطاع البروتين). يُستخدم تحليل PTT بشكل شائع في دراسة الجينات الطويلة متعددة الإكسونات، مثل الحثل العضلي الدوشيني/بيكر، أو ترنح توسع الشعيرات، أو الورم الليفي العصبي من النوع 1.

في الوقت الحقيقي PCR(في الوقت الحقيقي PCR، الإنجليزية)

في كل عام، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في الوقت الحقيقي وسيلة تشخيصية شائعة بشكل متزايد في مجال الرعاية الصحية العملية. وتتمثل ميزتها الأساسية في المراقبة والتحليل الكمي لتراكم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسجيل التلقائي وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها. لا تتطلب هذه الطريقة مرحلة الرحلان الكهربائي، مما يقلل من متطلبات مختبر PCR. بفضل توفير مساحة الإنتاج، وتقليل عدد الموظفين والطلب على التحديد الكمي للحمض النووي/الحمض النووي الريبي (DNA)، تم استخدام هذه الطريقة بنجاح في السنوات الأخيرة في أكبر مراكز الصحة الوبائية والتشخيصية والبحثية في البلدان المتقدمة في العالم، لتحل محل PCR في شكله الحالي ("الكلاسيكي").

يستخدم PCR في الوقت الحقيقي تحقيقات قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت للكشف عن الحمض النووي أثناء تضخيمه. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي بإجراء تحليل كامل للعينة خلال 20 إلى 60 دقيقة، وهو قادر نظريًا على اكتشاف حتى جزيء DNA أو RNA واحد في العينة.

أرز. 17. في الوقت الحقيقي PCR.

يستخدم PCR في الوقت الحقيقي نظام TaqMan الذي يتحكم في حركية PCR مباشرة أثناء التضخيم باستخدام إخماد مضان الرنين. للكشف، يتم استخدام مسبار يحمل فلوروفور ومخمد مكمل للجزء الأوسط من الجزء المضخم. عندما يرتبط الفلوروفور والمخمد بمسبار قليل النوكليوتيد، يتم ملاحظة انبعاث فلورسنت بسيط فقط. أثناء عملية التضخيم، بسبب نشاط نوكلياز خارجي 5 بوصات من بوليميراز طق، تدخل علامة الفلورسنت في المحلول، وتحرر من قربها من المخمد، وتولد إشارة فلورية تزداد في الوقت الفعلي بما يتناسب مع تراكم مكبر الصوت ( الشكل 17).

المزايا الرئيسية لـ PCR في الوقت الحقيقي مقارنة بـ PCR مع الفصل الكهربائي للهلام:

· تتم الطريقة بأكملها في أنبوب اختبار واحد؛

· تستغرق الطريقة ساعة واحدة.

· 1-2 غرف عمل كافية.

· إلى جانب التقييم النوعي للنتيجة، هناك إمكانية إجراء تقييم كمي (على سبيل المثال، عند وصف العلاج المضاد للفيروسات لمرض الإيدز أو التهاب الكبد الفيروسي، من الضروري معرفة الحمل الفيروسي، أي كمية الفيروس لكل وحدة، والتي يتم توفيرها بواسطة PCR في الوقت الحقيقي)؛

· يتم تقليل خطر التلوث بشكل حاد.

خاتمة

تعد طريقة PCR إحدى الطرق الأكثر شيوعًا للبحث البيولوجي الجزيئي. يجب أن يستخدم الأطباء هذه الطريقة بذكاء، ويجب أن يكون لدى الطبيب الذي يقرر استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في عمله معرفة معينة حول ميزات وإمكانيات هذه الطريقة. ثانياً، يجب أن يكون هناك تفاعل وثيق بين الطبيب ومختبر PCR، وهو أمر ضروري لتحليل الحالات المعقدة ووضع استراتيجية التشخيص الصحيحة. ثالثا، تحليل PCR ليس حلا سحريا في التشخيص (الأمراض المعدية في المقام الأول) ولا يحل محل طرق البحث الحالية، ولكنه يكملها فقط. والأهم من ذلك، لا يمكن لتفاعل البوليميراز المتسلسل أن يحل محل الحدس والتفكير التحليلي الذي يجب أن يتمتع به الطبيب الذي يتوقع النجاح.

ص . س . البحوث البيولوجية الجزيئية - تغيير المبادئ التوجيهية للتشخيص والعلاج. يرتبط استخدام الأساليب البيولوجية الجزيئية باحتمال حدوث تغيير جذري في التركيز على التشخيص المختبري. قد لا يتعلق الأمر فقط بالحصول على المعلومات في الوقت المناسب، بل يتعلق بتلقيها مسبقًا. إذا تم إجراء الاختبارات المعملية الآن في معظم الحالات بالفعل بعد تطور المرض وبدء العلاج، فمن المتوقع أن تتيح المعلومات المخبرية البيولوجية الجزيئية إمكانية تحديد ميل الشخص إلى أنواع معينة من الأمراض ودرجة الحساسية لبعض الأدوية ، والتي سوف تبرر طبيعة الطب المستقبلي التنبؤية والوقائية والشخصية.

تغيير التوجهات التشخيصية والعلاجية

الأمراض الوراثية

اليوم في المستقبل

تشخيص جواز السفر الوراثي

8. ما هو عدد غرف العمل اللازمة لتشغيل مختبر تفاعل البوليميراز المتسلسل مع الكشف الفلوريسنت (التحليل الكمي، تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي)؟

9. ما هو الكشف؟

10. ما هي طرق تشخيص الحمض النووي الموجودة؟

11. عمل أي إنزيم يقوم عليه PCR؟

12. لماذا يجب إزالة منطقة الكشف من مناطق العمل الأخرى؟

13. ما هو موقع التقييد؟

14. ما هي الاختلافات بين طرق تشخيص الحمض النووي المباشرة وغير المباشرة؟

15. ما هو التسلسل؟

16. ما هو PCR المتعدد؟

17. ما هي أنواع الطفرات التي يتم تحديدها باستخدام PCR؟

18. ما هو التلوث؟

19. ما هو جوهر طريقة التضخيم الخاصة بالأليل؟

20. شروط تخزين مادة PCR؟

21. في أي جهاز يتم التضخيم؟

22. ما هي طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل العكسي (RT-PCR)؟

23. ما هي المواد المستخدمة في تشخيص PCR؟

24. اذكر أنواع التلوث؟

اختبارات الإعداد الذاتي

1. إنزيمات تقييد نوكلياز:

أ) الإنزيمات التي "تكسر" الحمض النووي في أماكن محددة بدقة؛

ب) الإنزيمات التي تترابط مع بعضها البعض تتكسر في جزيء الحمض النووي؛

ج) الإنزيمات التي توفر المركبات التي تقوم بإصلاح الحمض النووي.

2. تضخيم الجينات:

3. ما هي طريقة علم الوراثة الجزيئية المستخدمة لتشخيص الأمراض التي تسببها جينة متحورة ذات تسلسل معروف؟

أ) استخدام إنزيم تقييد محدد؛

ب) الكشف المباشر باستخدام مجسات جزيئية محددة؛

ج) تحليل الأسرة لتوزيع الأشكال الطبيعية لطول جزء القيد.

4. تسلسل الحمض النووي:

أ) تحديد تسلسل قاعدة الحمض النووي؛

ب) التكرار المتعدد لأي قسم من الحمض النووي؛

ج) عزل جزء من الحمض النووي يحتوي على الجين قيد الدراسة.

5. للحصول على عينات الحمض النووي يمكنك استخدامها :

ب) الزغابات المشيمية.

ج) السائل الأمنيوسي.

د) خلايا السائل الأمنيوسي.

ه) عينات خزعة من الجلد والعضلات والكبد،

هـ) كل شيء صحيح باستثناء النقطة "ج"،

ز) كل شيء صحيح باستثناء النقطة "د"،

ح) كل ما سبق صحيح.

6. لتشخيص الطفرات التي يتم استخدام طريقة PCR:

أ) الجينومية؛

ب) الكروموسومات.

ج) الجين (نقطة).

7. التمهيدي هو:

أ) القسم التكميلي من الحمض النووي؛

ب) تسلسل قليل النوكليوتيد الاصطناعي المسمى (بنشاط إشعاعي أو فلورسنتي) مكمل لجين متحول أو طبيعي؛

ج) قليل النوكليوتيد الذي يعمل بمثابة "تمهيد" ويبدأ في تصنيع سلسلة متعدد النوكليوتيد على مصفوفة DNA أو RNA.

8. من الذي طور مبدأ طريقة PCR؟

ب) ك. موليس

9. هل يتم استخدام طريقة PCR لتشخيص توسع تكرارات ثلاثي النوكليوتيد (نوع ديناميكي من الطفرات)؟

10. في أي المجالات يتم استخدام PCR؟

أ) الطب السريري؛

ب) تحديد الكائنات المعدلة وراثيا (GMOs)

ج) تحديد الهوية الشخصية، وإثبات الأبوة، والطب الشرعي

د. كل ما ورداعلاه،

ه) لا شيء مما سبق..

الإجابات النموذجية: 1 - أ؛ 2 - ب؛ 3 - ب؛ 4 ا؛ 5 - ه؛ 6 - في؛ 7 - في؛ 8 - ب؛ 9 – أ، 10 – ز.

رئيسي

1. علم الوراثة بوشكوف. موسكو. جوتار، 2002.

إضافي

1. بالخاريف وعلاج الأمراض الخلقية والوراثية عند الأطفال. – موسكو، 2004.

2. تشخيص الحمض النووي والاستشارات الوراثية الطبية. – موسكو، 2004.

3. جينتر الوراثة. – موسكو، 2003.

4. أساسيات جوربونوف في علم الوراثة الطبية. – سانت بطرسبرغ: إنترميديكا، 1999.

5. جي ماكجي. التشخيص السريري الجزيئي. - العالم، 1999.

6. مينشيكوف - البحث البيولوجي في التشخيص المختبري السريري: إمكانيات المشكلة (محاضرات). التشخيص المختبري السريري، رقم 3، 2006.

7. عمل كورنينكو في مختبر PCR أثناء التحليل المباشر للمواد البيولوجية. التشخيص المختبري السريري، رقم 10، 2006.

8. تنظيم العمل المعملي PCR. تعليمات منهجية. مو 1.3.1794-03. كبير أطباء الصحة في الاتحاد الروسي، 2003.

9. تقنية Erlich H. A. PCR. – بيرسين إلمر سيتوس، 1993.

10. هيد C. A.، ستيفنز J. في الوقت الحقيقي PCR الكمي. دقة الجينوم. - العدد 6، 1996.

المبادئ الأساسية للطريقة

تفاعل البوليميراز المتسلسل

الدليل المنهجي للعمل اللامنهجي لطلاب السنوات 3-4 في تخصصات الطب العام (060101) وطب الأطفال (060103).

GOU VPO "أكاديمية ولاية كراسنويارسك الطبية التابعة للوكالة الفيدرالية للصحة والتنمية الاجتماعية"

روسيا، كراسنويارسك،

مبادئ تشخيص PCR

خلاصة

الأقسام، 34 صفحة، 5 أشكال، 5 مراجع

الغرض من هذا العمل هو ملخص موجز للمبادئ الأساسية والميزات التكنولوجية لطريقة PCR وتطبيقها العلمي والعملي في تشخيص الأمراض المعدية.

قائمة الاختصارات التقليدية

HCV - فيروس التهاب الكبد C

dATP - ثلاثي فوسفات ديوكسيادينوسين

dGTP - ثلاثي فوسفات ديوكسيجوانوسين

dNTP - ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد

dTTP - ديوكسيثيميدين ثلاثي الفوسفات

dCTP - ديوكسي سيتوزين ثلاثي الفوسفات

الحمض النووي - حمض الديوكسي ريبونوكلييك

PCR - تفاعل البلمرة المتسلسل

RNA - حمض الريبونوكليك - فئة الغلوبولين المناعي GTime PCR - طريقة PCR في الوقت الحقيقي

مقدمة

مبدأ طريقة PCR

مراحل تحليل PCR

طريقة PCR في الوقت الحقيقي

مزايا طريقة PCR

القيود المفروضة على طريقة PCR

تطبيق طريقة PCR

خاتمة

قائمة المراجع المستخدمة

مقدمة

أصبح اكتشاف طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) أحد أبرز التطورات في مجال البيولوجيا الجزيئية في العقود الأخيرة. هذا جعل من الممكن رفع التشخيص الطبي إلى مستوى جديد نوعياً. تم تطوير مبدأ طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل بواسطة كاري موليس في عام 1983. لتطوير تحليل PCR، حصل K. Mullis على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 1993.

بعد اكتشاف PCR، تم تطبيقه بسرعة كبيرة. أصبحت هذه الطريقة شائعة جدًا لدرجة أنه من الصعب اليوم تخيل العمل في مجال البيولوجيا الجزيئية دون استخدامها. لقد شهدت طريقة PCR تطورًا سريعًا بشكل خاص بفضل برنامج الجينوم البشري الدولي. تم إنشاء تقنيات تسلسل الليزر الحديثة (فك تشفير تسلسل نيوكليوتيدات الحمض النووي). إذا كان الأمر في الماضي القريب يستغرق أسبوعًا لفك تشفير تسلسل الحمض النووي المكون من 250 زوجًا من النيوكليوتيدات (bp)، فإن أجهزة تسلسل الليزر الحديثة يمكنها تحديد ما يصل إلى 5000 زوج زوج من النيوكليوتيدات (bp). في يوم. وهذا بدوره يساهم في النمو الكبير لقواعد بيانات المعلومات التي تحتوي على تسلسلات الحمض النووي. حاليًا، تم اقتراح تعديلات مختلفة على PCR، وتم عرض إمكانية إنشاء أنظمة اختبار للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة وتحديد الطفرات النقطية، وتم وصف العشرات من التطبيقات المحتملة لهذه الطريقة.

يعود ظهور طريقة PCR إلى بعض الإنجازات في مجال علم الوراثة الجزيئية، وفي المقام الأول فك تشفير تسلسل النيوكليوتيدات في جينومات عدد من الكائنات الحية الدقيقة. وتجدر الإشارة إلى أن هذا الاكتشاف رافقه تطور تقنيات معينة. على وجه الخصوص، ظهور الأجهزة التي تجعل من الممكن توليف شظايا الحمض النووي المفرد الذين تقطعت بهم السبل (أليغنوكليوتيدات) تلقائيا. خلال نفس الفترة، تم اكتشاف الكائنات الحية الدقيقة الفريدة التي تعيش في السخانات. يتحمل نظامهم الأنزيمي، وخاصة بوليميراز الحمض النووي، درجات الحرارة المرتفعة للينابيع الساخنة ويحتفظ بنشاطه البيولوجي حتى 95 درجة مئوية، وهو شرط ضروري لتنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل.

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل حاليًا أكثر طرق التشخيص تقدمًا في البيولوجيا الجزيئية وعلم الوراثة الجزيئية والتشخيص المختبري السريري، مما يسمح بتحديد الخلايا المفردة لمسببات الأمراض للعديد من الأمراض المعدية في الأنسجة والسوائل البيولوجية للجسم.

تعتمد طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على الإكمال التكميلي لقسم من الحمض النووي الجينومي أو الحمض النووي الريبي (RNA) للعامل الممرض، ويتم إجراؤه في المختبر باستخدام إنزيم بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة. يتم تحديد خصوصية الطريقة من خلال تفرد المادة الوراثية للعوامل المعدية المكتشفة، والتي يتم اختيار بادئات قليل النوكليوتيد المشاركة في عملية التضخيم.

تشخيص الأمراض المعدية، بما في ذلك تلك التي تسببها عوامل يصعب زراعتها، والتنميط الجيني للكائنات الحية الدقيقة، وتقييم ضراوتها، وتحديد مقاومة البكتيريا للمضادات الحيوية، والتشخيص قبل الولادة، والمراقبة البيولوجية لمنتجات الدم - هذه قائمة غير كاملة من مجالات الطب باستخدام PCR. واليوم، يظل تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو التكنولوجيا الأكثر انتشارًا وتطورًا ديناميكيًا. في كل عام، تظهر في السوق العشرات من أنظمة الاختبار الجديدة لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، وهي مصممة لتحديد تسلسل النيوكليوتيدات لمختلف الكائنات الحية الدقيقة التي تسبب الأمراض، ولدراسة الجينات البشرية. تكلفة تحليل PCR تتناقص بشكل مطرد، مما يساهم في الاستخدام المتزايد على نطاق واسع لهذه الطريقة في المؤسسات الطبية والتشخيصية. يتزايد عدد مختبرات تفاعل البوليميراز المتسلسل في بلدان رابطة الدول المستقلة بشكل كبير، ويبدو أن تحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل سيصبح في المستقبل القريب أحد أكثر طرق التشخيص المختبري شيوعًا.

1. مبدأ طريقة PCR

تفاعل البوليميراز المتسلسل هو طريقة تحاكي تكاثر الحمض النووي الطبيعي وتسمح باكتشاف جزيء واحد محدد من الحمض النووي في وجود ملايين الجزيئات الأخرى.

جوهر هذه الطريقة هو نسخ (تضخيم) أجزاء معينة من الحمض النووي بشكل متكرر في أنبوب اختبار أثناء دورات الحرارة المتكررة. في كل دورة تضخيم، يتم نسخ الأجزاء التي تم تصنيعها مسبقًا مرة أخرى بواسطة بوليميراز الحمض النووي. ونتيجة لهذا، هناك زيادة متعددة في عدد شظايا الحمض النووي المحددة، مما يبسط إلى حد كبير إجراء مزيد من التحليل.

تعتمد طريقة PCR على عملية طبيعية - إكمال تكميلي لمصفوفة الحمض النووي، ويتم تنفيذها باستخدام إنزيم بوليميريز الحمض النووي. ويسمى هذا التفاعل تكرار الحمض النووي.

يتضمن تكرار الحمض النووي الطبيعي عدة مراحل:

) تمسخ الحمض النووي (تفكيك الحلزون المزدوج، انحراف خيوط الحمض النووي)؛

) تشكيل مقاطع قصيرة من الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل (البادئات اللازمة لبدء تخليق الحمض النووي)؛

) تصنيع شريط DNA جديد (إكمال تكميلي لكلا الشريطين).

يمكن استخدام هذه العملية لإنتاج نسخ من مقاطع قصيرة من الحمض النووي خاصة بكائنات دقيقة معينة، مثل: إجراء بحث مستهدف لمثل هذه المجالات المحددة، وهو هدف التشخيص الجيني لتحديد مسببات الأمراض المعدية.

اكتشاف بوليميريز الحمض النووي القابل للحرارة (بوليميريز طق) من البكتيريا المحبة للحرارة ثيرميساكواتيكوس، والتي تكون درجة الحرارة المثلى لها في حدود 70-72 درجة مئوية، جعلت من الممكن جعل عملية تكرار الحمض النووي دورية واستخدامها للعمل في المختبر. إن إنشاء منظمات الحرارة القابلة للبرمجة (مكبرات الصوت)، والتي تنفذ تغيرات دورية في درجات الحرارة وفقًا لبرنامج معين، قد خلق المتطلبات الأساسية لإدخال طريقة PCR على نطاق واسع في ممارسة التشخيص السريري المختبري. مع التكرار المتعدد لدورات التوليف، تحدث زيادة هائلة في عدد نسخ جزء معين من الحمض النووي، مما يجعل من الممكن الحصول على عدد كافٍ من نسخ الحمض النووي للتعرف عليها من كمية صغيرة من المواد التي تم تحليلها، والتي قد تحتوي على خلايا مفردة. من الكائنات الحية الدقيقة.

لا يبدأ إكمال السلسلة التكميلية عند أي نقطة في تسلسل الحمض النووي، ولكن فقط في كتل بداية معينة - مقاطع قصيرة مزدوجة الجديلة. من خلال ربط هذه الكتل بأجزاء معينة من الحمض النووي، من الممكن توجيه عملية تصنيع سلسلة جديدة فقط في هذا القسم، وليس على طول سلسلة الحمض النووي بأكملها. لإنشاء كتل البداية في أقسام معينة من الحمض النووي، يتم استخدام اثنين من بادئات قليل النوكليوتيد (20 زوجًا من النوكليوتيدات)، تسمى البادئات. تعتبر البادئات مكملة لتسلسلات الحمض النووي على الحدود اليسرى واليمنى لجزء معين ويتم توجيهها بطريقة بحيث يتم إكمال سلسلة الحمض النووي الجديدة بينهما فقط.

وبالتالي، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل عبارة عن زيادة متعددة في عدد النسخ (التضخيم) لمنطقة محددة من الحمض النووي يتم تحفيزها بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي.

. مراحل تحليل PCR

تشتمل طريقة التحليل باستخدام طريقة PCR على ثلاث مراحل:

1. عزل الحمض النووي (RNA) من عينة سريرية؛

2. تضخيم شظايا معينة من الحمض النووي؛

. الكشف عن منتجات التضخيم.

. عزل الحمض النووي (RNA).

في هذه المرحلة من التحليل، تخضع العينة السريرية لمعالجة خاصة، ونتيجة لذلك يتم تحلل المادة الخلوية وإزالة أجزاء البروتين والسكاريد، ويتم الحصول على محلول الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي (RNA)، خاليًا من المثبطات وجاهزًا للتحليل. مزيد من التضخيم. يتم تحديد اختيار تقنية استخراج الحمض النووي (RNA) بشكل أساسي حسب طبيعة المادة السريرية التي تتم معالجتها.

2. تضخيم أجزاء محددة من الحمض النووي

في هذه المرحلة، تتراكم أجزاء الحمض النووي القصيرة المحددة بالكمية اللازمة لمزيد من الكشف عنها.

لإجراء تفاعل البلمرة المتسلسل، يجب أن يتواجد عدد من المكونات في خليط التفاعل:

· الاشعال- أليغنوكليوتيدات مُصنَّعة، يتراوح حجمها عادة من 15 إلى 30 نقطة أساس، مطابقة للأجزاء المقابلة من الحمض النووي المستهدف. أنها تلعب دورا رئيسيا في تشكيل منتجات رد فعل التضخيم. تضمن البادئات المختارة بشكل صحيح خصوصية وحساسية نظام الاختبار.

· بوليميريز طق- إنزيم قابل للحرارة يضمن اكتمال 3 - نهاية الشريط الثاني من DNA وفق مبدأ التكامل.

· خليط من ثلاثي فوسفات ديوكسينوكليوتيد (dNTPs)- ديوكسيادينوسين ثلاثي الفوسفات (dATP)، ديوكسيجوانوسين ثلاثي الفوسفات (dGTP)، ديوكسي سيتوزين ثلاثي الفوسفات (dCTP) وديوكسي ثيميدين ثلاثي الفوسفات (dTTP) - "مادة البناء" التي يستخدمها بوليميريز طق لتجميع الشريط الثاني من الحمض النووي.

· متعادل -خليط من الكاتيونات والأنيونات بتركيز معين، مما يوفر الظروف المثالية للتفاعل، بالإضافة إلى قيمة pH ثابتة.

· العينة التي تم تحليلها- مستحضر معد للإضافة إلى خليط التفاعل، والذي قد يحتوي على الحمض النووي المطلوب، على سبيل المثال، الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة، والذي يعمل كهدف للنسخ المتكرر اللاحق.

الشكل 1: مكونات خليط التفاعل

تشتمل كل دورة تضخيم على ثلاث مراحل تحدث في ظروف درجات حرارة مختلفة:

المرحلة 1:تمسخ الحمض النووي (فك ضفيرة الحلزون المزدوج). يحدث عند 93-95 درجة مئوية لمدة 30-40 ثانية.

يتم استخدام إحدى الدوائر (+) كمصفوفة رئيسية. يتم تثبيت نهاياتها الخمسة بواسطة إنزيم بوليميراز الحمض النووي، والذي يضمن بناء شريط DNA ثانٍ، مكمل للأول، من النيوكليوتيدات الفردية. نفس الشيء، فقط في الاتجاه المعاكس، يحدث على الشريط الثاني من الحمض النووي، ومع ذلك، نظرًا لأن تفكيك جزيء الحمض النووي يتم بترتيب عكسي، يتم بناء الشريط الجديد في أجزاء صغيرة، والتي يتم بعد ذلك خياطةها معًا. لكي يبدأ إنزيم بوليميريز الحمض النووي عمله، يلزم وجود بذرة أو مادة أولية - جزء صغير من الحمض النووي المفرد الذي تقطعت به السبل، والذي، عند توصيله بالمنطقة التكميلية لأحد خيوط الحمض النووي الأصلية، يشكل كتلة البداية لتنمية حبلا الابنة.

المرحلة 2:إرفاق الاشعال (التليين). يحدث ارتباط البادئات بشكل مكمل للتسلسلات المقابلة على خيوط الحمض النووي المتقابلة عند حدود منطقة معينة. كل زوج من البادئات له درجة حرارة التلدين الخاصة به، والتي تتراوح قيمها بين 50-65 درجة مئوية. تعد درجة حرارة التلدين الأولية المحسوبة بدقة والتحقق منها تجريبيًا إحدى الخصائص التي تحدد خصوصية التفاعل، باستثناء ارتباط الاشعال بتسلسلات تكميلية غير كاملة.

وبما أن نمو خيوط الحمض النووي الابنة يمكن أن يحدث في وقت واحد على كلا شريطي الحمض النووي للأم، فإن بوليميراز الحمض النووي الموجود على الشريط الثاني يتطلب أيضًا جهاز تمهيدي خاص به. وهكذا، تتم إضافة اثنين من البادئات إلى خليط التفاعل. في الواقع، فإن البادئات، التي تعلق على الخيوط المقابلة لجزيء الحمض النووي، تحد من الجزء الذي سيتم تكراره أو تضخيمه عدة مرات لاحقًا. تسمى شظايا الحمض النووي هذه amplicons. يمكن أن يصل طول الأمبليكون إلى عدة مئات من النيوكليوتيدات. ومن خلال تغيير زوج من البادئات، يمكننا الانتقال من تحليل أحد العوامل المسببة للأمراض إلى تحليل آخر.

وقت التلدين -20-60 ثانية.

المرحلة 3:استكمال سلاسل الحمض النووي (الاستطالة).

آلية النسخ هي أن الإضافة التكميلية للخيوط لا يمكن أن تبدأ عند أي نقطة في تسلسل الحمض النووي، ولكن فقط في كتل بداية معينة (مقاطع قصيرة مزدوجة الجديلة). لإنشاء كتل البداية في أقسام معينة من الحمض النووي، يتم استخدام البادئات، وهي عبارة عن أليغنوكليوتيدات يبلغ طولها حوالي 20 نقطة أساس، وتسمى أيضًا البادئات. وهي مكملة لتسلسلات الحمض النووي الموجودة على الحدود اليمنى واليسرى لجزء معين ويتم توجيهها بطريقة تجعل تخليق الحمض النووي الذي يقوم به بوليميراز الحمض النووي يحدث بينهما فقط.

يبدأ الإكمال التكميلي لسلاسل الحمض النووي من النهاية 5' إلى النهاية 3' من السلسلة في اتجاهين متعاكسين، بدءًا من مواقع الارتباط الأولية. المادة المستخدمة في تصنيع سلاسل الحمض النووي الجديدة هي فوسفات ديوكسيريبونوكليوتيد الذي تم إدخاله. يتم تحفيز هذه العملية بواسطة إنزيم Tag Polymerase. يعمل الحمض النووي الجديد المتكون في الدورة الأولى من التوليف كمواد أولية للدورة الثانية، حيث يتم تشكيل جزء الحمض النووي المحدد المطلوب (الأمبليكون)، وما إلى ذلك.

الشكل 2: مبدأ تضخيم الحمض النووي

حاليًا، يتم استخدام عدة طرق لإعداد عينة لـ PCR. يتضمن إجراء تحضير العينة التحلل الميكروبي واستخلاص الحمض النووي. من أجل تدمير الخلية الميكروبية، يتم استخدام الغليان البسيط والتجميد والذوبان في وجود الليزوزيم، بالإضافة إلى مخازن التحلل الخاصة التي تحتوي على المنظفات والبروتيناز. عادة ما يتم تحديد اختيار الطريقة حسب طبيعة الميكروب، وبشكل أكثر دقة، طبيعة جدار الخلية. تعتبر طريقة الحصول على تحضير الحمض النووي النقي، التي وصفها B. R. Marmionetal، قياسية وقد أصبحت كلاسيكية بالفعل. (1993). وهو ينطوي على تحلل البروتينات الأنزيمية يليه إزالة البروتين وترسيب الحمض النووي بالكحول. تتيح لك هذه الطريقة الحصول على إعداد حمض نووي نقي، ولكنها تتطلب عمالة كثيفة وتتضمن العمل مع مواد عدوانية وقوية الرائحة مثل الفينول والكلوروفورم.

واحدة من أكثر الطرق شيوعًا هي طريقة استخراج الحمض النووي التي اقترحتها شركة R.Boometal. (1990)، استنادًا إلى استخدام عامل تحلل قوي - جوانيدين ثيوسيانات (GuSCN) لتحلل الخلايا وامتصاص الحمض النووي لاحقًا على حامل (خرز زجاجي، تراب دياتومي، "حليب" زجاجي، وما إلى ذلك). بعد الغسيل، يبقى الحمض النووي في العينة، ويتم امتصاصه على الناقل، والذي يمكن إزالته منه بسهولة باستخدام محلول شطف. هذه الطريقة مريحة ومتقدمة تقنيًا ومناسبة لإعداد عينة للتضخيم. ومع ذلك، فإن فقدان الحمض النووي ممكن بسبب الامتصاص الذي لا رجعة فيه على الناقل، وكذلك أثناء عمليات الغسيل العديدة. وهذا مهم بشكل خاص عند العمل مع كميات صغيرة من الحمض النووي في العينة. بالإضافة إلى ذلك، حتى الكميات الضئيلة من GuSCN يمكن أن تمنع PCR، لذلك عند استخدام هذه الطريقة، يعد الاختيار الصحيح للمواد الماصة والالتزام الدقيق بالفروق التكنولوجية أمرًا مهمًا للغاية. تجدر الإشارة إلى أنه بسبب العدد الكبير من خطوات إضافة وإزالة المحاليل، يلزم الحذر عند التعامل مع العينة، حيث أن التلوث المتبادل بين العينات ورذاذ الحمض النووي الناتج ممكن.

مع الإجراء الكلاسيكي لاستخراج الحمض النووي الفينول كلوروفورم، يتم تحقيق تنقية جيدة للحمض النووي، في المقام الأول من مثبطات بوليميراز العلامة، ولكن الخسائر الكبيرة في الحمض النووي أمر لا مفر منه، وخاصة ملحوظة عند العمل مع عينات صغيرة مع تركيز منخفض من العامل المعدي.

تعتمد مجموعة أخرى من طرق تحضير العينات على استخدام المبادلات الأيونية مثل تشيليكس (الولايات المتحدة الأمريكية)، والتي، على عكس الزجاج، لا تمتص الحمض النووي، ولكن الشوائب التي تتداخل مع التفاعل. كقاعدة عامة، تتضمن هذه التقنية مرحلتين: غليان العينة وامتصاص الشوائب في مبادل أيوني. هذه الطريقة جذابة للغاية بسبب بساطتها في التنفيذ. في معظم الحالات يكون مناسبًا للعمل مع المواد السريرية. لسوء الحظ، في بعض الأحيان توجد عينات بها شوائب لا يمكن إزالتها باستخدام المبادلات الأيونية. بالإضافة إلى ذلك، لا يمكن تدمير بعض الكائنات الحية الدقيقة عن طريق الغليان البسيط. وفي هذه الحالات، من الضروري إدخال مراحل إضافية لمعالجة العينات.

أثناء الفحص الشامل، عندما يكون من المهم الحصول على بيانات إحصائية، من الممكن استخدام طرق بسيطة باستخدام المنظفات أو معالجة المواد البيولوجية بالقلويات ثم تحييدها. وفي الوقت نفسه، فإن استخدام مثل هذه الأساليب للتشخيص السريري يمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة بسبب استخدام تحضير الحمض النووي منخفض الجودة في خليط التفاعل. وبالتالي، ينبغي أن يؤخذ في الاعتبار اختيار طريقة تحضير العينة مع فهم أغراض التحليل المقصود.

خلال الإجراء التالي - التضخيم - يتم إدخال عينة تحتوي على الحمض النووي للعامل الممرض في أنبوب اختبار صغير يحتوي على مكونات تضمن تفاعل البلمرة، ونوعين من البادئات، واثنين من الإنزيمات (Tag بوليميريز وN-uracil غليكولاز) وأربعة أنواع من النوكليوتيدات A، G، Ts، U. لتنفيذ تفاعل البلمرة، يتم استخدام جهاز خاص (الدورة الحرارية أو مضخم الحمض النووي)، والذي يسمح لك بتغيير درجة حرارة خليط التفاعل تلقائيًا وفقًا لبرنامج معين. في الجولة الأولى من تفاعل البوليميراز المتسلسل، يتم تسخين العينة إلى درجة حرارة 94 درجة مئوية لفصل شريطي الحمض النووي التكميليين. تنخفض درجة الحرارة بعد ذلك إلى 40-60 درجة مئوية، وعند هذه النقطة يتم ربط البادئات بحبل واحد من الحمض النووي، وبعد ذلك ترتفع درجة الحرارة مرة أخرى إلى 72 درجة مئوية، عندما يكون نشاط البوليميراز أكثر وضوحًا. تستمر الدورة بأكملها مع تغيرات درجة الحرارة أقل من 3 دقائق.

لتقييم نتائج PCR بشكل صحيح، من المهم أن نفهم أن هذه الطريقة ليست كمية. من الناحية النظرية، يمكن اكتشاف منتجات التضخيم لجزيئات الحمض النووي المستهدفة باستخدام الرحلان الكهربائي بعد 30-35 دورة. ومع ذلك، من الناحية العملية، يتم ذلك فقط في الحالات التي يحدث فيها التفاعل في ظل ظروف قريبة من المثالية، وهو أمر نادر. درجة نقاء إعداد الحمض النووي لها تأثير كبير بشكل خاص على كفاءة التضخيم، أي. وجود مثبطات معينة في خليط التفاعل، والتي قد يكون من الصعب للغاية التخلص منها في بعض الحالات. في بعض الأحيان، بسبب وجودها، حتى عشرات الآلاف من جزيئات الحمض النووي المستهدفة لا يمكن تضخيمها. وبالتالي، غالبًا لا توجد علاقة مباشرة بين الكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف والكمية النهائية لمنتجات التضخيم.

يتم استخدام طرق مختلفة لتصور نتائج التضخيم. الأكثر شيوعا اليوم هو الكهربائي، على أساس فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم. للقيام بذلك، إعداد لوحة من هلام الاغاروز، الذي هو الاغاروز توطيد بعد ذوبان في المخزن المؤقت الكهربائي بتركيز 1.5-2.5٪ مع إضافة صبغة DNA خاصة، على سبيل المثال بروميد إيثيديوم. يشكل الاغاروز المتصلب شبكة مكانية. عند الصب باستخدام الأمشاط، يتم تشكيل آبار خاصة في الجل، والتي تضاف إليها فيما بعد منتجات التضخيم. يتم وضع لوحة الهلام في جهاز الرحلان الكهربي الأفقي ويتم توصيل مصدر جهد ثابت. يبدأ الحمض النووي المشحون سالبًا بالتحرك في الجل من ناقص إلى زائد. في هذه الحالة، تتحرك جزيئات الحمض النووي الأقصر بشكل أسرع من الجزيئات الأطول. تتأثر سرعة حركة الحمض النووي في الجل بتركيز الاغاروز، وقوة المجال الكهربائي، ودرجة الحرارة، وتكوين المخزن المؤقت للرحلان الكهربائي، وبدرجة أقل، تكوين الحمض النووي. جميع الجزيئات ذات الحجم نفسه تتحرك بنفس السرعة. يتم دمج الصبغة (مقحم) بواسطة مجموعات مستوية في جزيئات الحمض النووي. بعد الانتهاء من الرحلان الكهربائي، الذي يستمر من 10 دقائق إلى ساعة واحدة، يتم وضع الجل على مرشح ناقل الإضاءة الذي ينبعث الضوء في نطاق الأشعة فوق البنفسجية (254 - 310 نانومتر). يتم نقل الطاقة فوق البنفسجية التي يمتصها الحمض النووي عند 260 نانومتر إلى الصبغة، مما يؤدي إلى تألقها في المنطقة البرتقالية الحمراء من الطيف المرئي (590 نانومتر).

يتم استخدام معيار الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المرغوبة كـ "تحكم إيجابي". يمكن أن يكون حجم الأمبليكونات غير المحددة أكبر أو أصغر مقارنة بـ "التحكم الإيجابي". في أسوأ الحالات، قد تتطابق هذه الأحجام ويتم قراءتها على أنها إيجابية في الترحيل الكهربائي.

يتيح لك "التحكم الإيجابي" التأكد من أن جميع المكونات الموجودة في خليط التفاعل تضمن التقدم الطبيعي للتفاعل. في الوقت نفسه، قد يحتوي تحضير الحمض النووي المحضر لـ PCR من مادة بيولوجية على شوائب مثبطات، مما يقلل بشكل كبير من كفاءة التفاعل، وفي بعض الحالات يؤدي إلى عدم وجود أمبليكونات محددة حتى في وجود العامل الممرض المطلوب. من الضروري مراقبة تقدم التضخيم في كل أنبوب اختبار مع خليط التفاعل، حيث يتم استخدام ما يسمى "التحكم الداخلي" الإضافي، وهو أي معيار DNA يختلف عن الحمض النووي للكائن الحي الدقيق المطلوب.

بالنسبة لأنظمة الاختبار المعدية، في بعض الأحيان، على سبيل المثال، يتم استخدام جين p-globin، وفي نهايته، باستخدام التلاعب بالهندسة الوراثية، يتم خياطة أقسام الحمض النووي المتماثلة مع البادئات المدرجة في نظام الاختبار. إذا تمت إضافة "تحكم داخلي" إلى خليط التفاعل، فإنه سيصبح نفس الهدف للتليين التمهيدي مثل الحمض النووي الصبغي للعامل المعدي المطلوب. يتم تحديد حجم منتج تضخيم التحكم الداخلي بحيث يكون أكبر بمرتين أو أكثر من الأمبليكونات المتكونة من تضخيم الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المطلوبة. ونتيجة لذلك، إذا تمت إضافة الحمض النووي "للتحكم الداخلي" إلى خليط التفاعل مع عينة الاختبار، فبغض النظر عن وجود كائن حي دقيق في العينة البيولوجية، فإن "التحكم الداخلي" سوف يتسبب في تكوين أمبليكونات محددة، ولكن أطول (أثقل) بكثير من أمبليكون الكائنات الحية الدقيقة. يشير وجود الأمبليكونات الثقيلة في خليط التفاعل إلى التقدم الطبيعي لتفاعل التضخيم وغياب المثبطات. إذا لم يتم تشكيل أمبليكونات بالحجم المطلوب و"التحكم الداخلي"، فيمكننا أن نستنتج أن هناك شوائب غير مرغوب فيها في العينة التي تم تحليلها ويجب التخلص منها، ولكن ليس حول غياب الحمض النووي المطلوب.

وعلى الرغم من كل جاذبية هذا النهج، فإنه لا يخلو من عيب كبير. وبالتالي، إذا كان الحمض النووي المطلوب موجودًا في خليط التفاعل، فإن كفاءة تضخيمه تنخفض بشكل حاد بسبب المنافسة مع "التحكم الداخلي" على الاشعال. وهذا مهم بشكل أساسي عند تركيزات الحمض النووي المنخفضة في عينة الاختبار ويمكن أن يؤدي إلى نتائج سلبية كاذبة. ومع ذلك، بشرط حل مشكلة المنافسة على البادئات، فإن هذه الطريقة لرصد كفاءة التضخيم ستكون بالتأكيد مفيدة للغاية.

الشكل 3: الدورة الثانية لتضخيم الحمض النووي

. الكشف عن منتجات التضخيم

). طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي

إحدى طرق تصور نتائج التضخيم هي طريقة الرحلان الكهربائي، التي تعتمد على فصل جزيئات الحمض النووي حسب الحجم. في معظم الطرق، في هذه المرحلة، يتم فصل خليط منتجات التضخيم التي تم الحصول عليها في المرحلة الثانية عن طريق الرحلان الكهربائي الأفقي في هلام الاغاروز. قبل الفصل الكهربي، يضاف محلول بروميد الإيثيديوم إلى خليط التضخيم، والذي يشكل مركبات خلالية قوية مع شظايا الحمض النووي المزدوج تقطعت بهم السبل. هذه المركبات قادرة على التألق تحت الأشعة فوق البنفسجية، والتي يتم تسجيلها على شكل أشرطة مضيئة بعد الفصل الكهربي لخليط التضخيم في هلام الاغاروز. قد يختلف سطوع نطاقات منتج التضخيم. لذلك، غالبًا ما يكون من المعتاد في مختبرات PCR تقييم النتيجة باستخدام نظام ثلاثي أو أربعة أو خمس نقاط. ومع ذلك، لا يمكن ربطه بالكمية الأولية من الحمض النووي المستهدف في العينة. في كثير من الأحيان، يرتبط انخفاض سطوع النطاقات بانخفاض كفاءة التضخيم تحت تأثير المثبطات أو العوامل الأخرى.

الشكل 4: الكشف عن منتجات التضخيم عن طريق الرحلان الكهربائي الأفقي

). طريقة الرحلان الكهربائي العمودي

طريقة الرحلان الكهربائي العمودي تشبه بشكل أساسي طريقة الرحلان الكهربائي الأفقي. الفرق بينهما هو أنه في هذه الحالة يتم استخدام بولي أكريلاميد بدلاً من الاغاروز. يتم تنفيذه في غرفة خاصة للرحلان الكهربائي العمودي. يتمتع الفصل الكهربائي للهلام متعدد الأكريلاميد بدقة أكبر مقارنة بالرحلان الكهربائي للاغاروز ويسمح للمرء بتمييز جزيئات الحمض النووي ذات الأحجام المختلفة بدقة نيوكليوتيد واحد. يعد تحضير هلام بولي أكريلاميد أكثر تعقيدًا إلى حد ما من هلام الاغاروز. بالإضافة إلى ذلك، تعتبر مادة الأكريلاميد مادة سامة. نظرًا لأن الحاجة إلى تحديد حجم منتج التضخيم بدقة 1 نيوكليوتيد نادرًا ما تنشأ، فلا يتم استخدام هذه الطريقة في العمل الروتيني.

3). طريقة مسبار التهجين

كبديل لطريقة الكشف الكهربي، التي لها بعض العيوب: الذاتية في قراءة النتائج، والقيود في تحديد الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة المختلفة في تفاعل واحد، يمكن اقتراح مخططات الكشف عن التهجين. في هذه المخططات، يتم تهجين جزء الحمض النووي الناتج عن التضخيم (يشكل مجمعات ثنائية الجديلة - "الهجينة") مع مسبار قليل النوكليوتيد محدد. يمكن إجراء تسجيل هذه المجمعات بطريقة قياس الألوان أو قياس الفلور.

3. طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي (تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي)

تتيح طريقة PCR في الوقت الحقيقي اكتشاف منتجات التضخيم أثناء التفاعل ومراقبة حركية تراكم الأمبليكون. للكشف عن منتج PCR، يتم استخدام الأصباغ الفلورية التي توفر مضانًا يتناسب بشكل مباشر مع كمية منتج PCR - مضان مراسل. تختلف آليات توليدها تبعًا لنوع Real-Time PCR المحدد.

المنحنى الحركي في إحداثيات "مستوى مضان المراسل - دورة التضخيم" له شكل S.

ويمكن تقسيمها إلى ثلاث مراحل:

1.مرحلة البدء (عندما لم يتم اكتشاف منتجات PCR بعد بواسطة ملصق الفلورسنت).

2.المرحلة الأسية (التي يوجد فيها اعتماد أسي لكمية التألق على دورة PCR).

.الهضبة (مرحلة التشبع).

الشكل 5. رسم بياني للمنحنى الحركي الفلوري باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي

يتم تسجيل إشارة الفلورسنت أثناء عملية التضخيم على جهاز خاص - جهاز تدوير حراري لـ Real-Time PCR. استناداً إلى الزيادة في شدة إشارة الفلورسنت، يتم حساب تركيز قالب الحمض النووي الأولي باستخدام البرنامج المرفق مع مكبر الصوت.

مزايا طريقة PCR في الوقت الحقيقي

ن القدرة على اكتشاف تراكم منتجات التضخيم مباشرة أثناء التضخيم؛

ن الميزة الأساسية هي القدرة على اكتشاف تراكم الأمبليكونات دون فتح الأنبوب، مما يقلل من خطر النتائج الإيجابية الكاذبة بسبب تلوث العينات والكواشف بمنتجات التضخيم؛

ن يؤدي الانخفاض الكبير في عدد عمليات التلاعب في عينة الاختبار إلى تقليل الوقت وتبسيط التحليل وتقليل احتمالية حدوث أخطاء؛

ن هذا النهج يجعل من الممكن القضاء على مرحلة الكهربائي، الأمر الذي يؤدي إلى انخفاض حاد في احتمال تلوث عينات الاختبار بمنتجات التضخيم؛

ن تخفيض المتطلبات لمختبرات تفاعل البوليميراز المتسلسل؛

ن زيادة موضوعية تفسير نتائج دراسة PCR، حيث تتم المعالجة باستخدام برنامج الجهاز؛

ن انخفض إجمالي وقت البحث بشكل كبير إلى النصف تقريبًا، مما يسمح بالحصول على النتائج في غضون 1.5 إلى ساعتين بعد وصول المادة السريرية إلى المختبر؛

ن تسمح هذه الطريقة لأول مرة بتحديد محتوى الحمض النووي للكائنات الحية الدقيقة في عينة سريرية؛

ن استخدام تحقيقات التهجين جنبا إلى جنب مع الاشعال يزيد من خصوصية التحليل؛

ن تتيح إمكانية التسجيل المتزامن المستقل لإشارة الفلورسنت من عدة تحقيقات تهجين الحمض النووي التعرف في دراسة واحدة على عدة مناطق مختلفة لنفس أهداف الحمض النووي أو أهداف مختلفة.

. مزايا طريقة PCR

ن التعرف المباشر على مسببات الأمراض المعدية

تعطي طريقة PCR إشارة مباشرة إلى وجود جزء محدد من الحمض النووي للعامل الممرض في المادة المأخوذة من المريض.

ن خصوصية عالية من PCR

باستخدام طريقة PCR، يتم عزل جزء من الحمض النووي في المادة قيد الدراسة والذي يكون فريدًا لمسبب مرض محدد - بكتيريا أو فيروس. يعتبر قسم الحمض النووي هذا فريدًا وغير نموذجي لأي عدوى على وجه الأرض. يتم تحديد النوعية من خلال تسلسل النيوكليوتيدات للبادئات، مما يلغي إمكانية الحصول على نتائج خاطئة، على عكس طريقة مقايسة الامتصاص المناعي المرتبط بالإنزيم، حيث تكون الأخطاء الناجمة عن المستضدات المتفاعلة شائعة.

ن حساسية عالية PCR

تسمح لك طريقة PCR باكتشاف الخلايا المفردة من البكتيريا أو الفيروسات. يكتشف تشخيص PCR وجود مسببات الأمراض للأمراض المعدية في الحالات التي لا يمكن فيها القيام بذلك بطرق أخرى (مناعية، بكتريولوجية، مجهرية). حساسية تحليل PCR هي 10-1000 خلية لكل عينة (حساسية الاختبارات المناعية والمجهرية هي 103-105 خلية).

ن تعدد استخدامات PCR

نظرًا لأنه يمكن احتواء العامل الممرض في أي إفرازات وأنسجة بيولوجية، يمكن لأبحاث PCR استخدام أي مواد تقريبًا، بما في ذلك تلك التي يتعذر الوصول إليها للبحث بطرق أخرى - المخاط والبول والدم والمصل والبلغم والقذف وكشط الخلايا الظهارية.

ن سرعة عالية في الحصول على نتائج تحليل PCR

لا يتطلب تحليل PCR عزل وزراعة ثقافة العامل الممرض، الأمر الذي يستغرق الكثير من الوقت. تتيح الطريقة الموحدة لمعالجة المواد الحيوية واكتشاف منتجات التفاعل وأتمتة عملية التضخيم إجراء تحليل كامل خلال 4-4.5 ساعات.

ن القدرة على تشخيص أي نوع من العدوى

إن الحساسية العالية لطريقة PCR تجعل من الممكن تشخيص العدوى ليس فقط في المرحلة الحادة من المرض، ولكن أيضًا في حالات العدوى المزمنة وحتى وجود بكتيريا أو فيروسات منفردة.

حاليًا، تتمثل ميزة تحليل PCR على الطريقة الثقافية للكشف عن الكائنات الحية الدقيقة في ما يلي:

ارتفاع وتيرة اكتشاف الميكروب، يتجاوز نفس المؤشر عند استخدام طريقة الاستزراع بنسبة 6-7%. يتم تفسير هذه الاختلافات من خلال احتمال موت الميكروب أثناء التخزين والنقل، في حين أن تفاعل البوليميراز المتسلسل قادر على اكتشاف الأشكال غير القابلة للحياة من الكائنات الحية الدقيقة.

الوقت اللازم للكشف عن العامل الممرض باستخدام طريقة الاستنبات هو حوالي 4 أيام، في حين أن استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل يسمح بالكشف عن الميكروب خلال 4-5 ساعات.

يسمح استخدام تقنية PCR باكتشاف مسببات الأمراض، مثل الكلاميديا، في العينات المأخوذة بطريقة غير جراحية، مثل البول.

تعتبر طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل فعالة بشكل خاص في تشخيص الأشكال المستمرة وغير القابلة للزراعة والتي يصعب زراعتها من الكائنات الحية الدقيقة، والتي غالبًا ما يتم مواجهتها في حالات العدوى الكامنة والمزمنة، لأن هذه الطريقة تتجنب الصعوبات المرتبطة بزراعة مثل هذه الكائنات الحية الدقيقة في ظروف المختبر.

ن إمكانية التنفيذ مراقبة وتقييم فعالية العلاج، وخاصة بالنسبة للأمراض الفيروسية.

ن إمكانية الكشف الأنواع الفرعية الفردية وسلالات الفيروسات والبكتيريا.

ن إمكانية التعريف عدة أنواع من مسببات الأمراض (Chlamydiatrachomatis، Mycoplasmahominis، Mycoplasmagenitalium، Trichomonas Vaginalis، Ureaplasmaurealyticum) من أنبوب واحد يحتوي على مادة بيولوجية.

هذه الطريقة قابلة للمقارنة من حيث كثافة اليد العاملة مع الطرق الكلاسيكية (المقايسة المناعية الإنزيمية، التألق المناعي، وما إلى ذلك)، ولكنها توفر معلومات تشخيصية أكثر موثوقية، مما يسمح بالكشف المباشر عن الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي (RNA) للعامل المعدي في المواد السريرية. ولذلك، فإن طريقة PCR، إلى جانب طريقة الثقافة، تعتبر "المعيار الذهبي" لتشخيص الأمراض المعدية.

5. القيود المفروضة على طريقة PCR

· أثناء التفاعل، يتم تضخيم الحمض النووي لكل من الكائنات الحية الدقيقة الحية والميتة

· إمكانية رد الفعل المتبادل

يعتمد اختيار البادئات على المعرفة الموجودة حول جينوم كائنات دقيقة معينة ومماثلة. من الناحية النظرية، هناك احتمال لوجود نفس الجزء في الكائنات الحية الدقيقة الأخرى التي لم يتم فك رموز جينومها حاليًا والتي لم يتم اختبارها لإمكانية التفاعل المتبادل. قد يؤدي وجود مثل هذه الكائنات الحية الدقيقة في العينة إلى نتيجة اختبار إيجابية كاذبة.

· تقلب الكائنات الحية الدقيقة

على الرغم من أنه عند إنشاء نظام اختبار، يتم اختيار جزء الجينوم المستخدم للتضخيم من منطقة محفوظة للغاية، إلا أن تباين الكائنات الحية الدقيقة يمكن أن يؤدي إلى حقيقة أن بعض الأنماط الجينية أو سلالات العامل الممرض قيد الدراسة قد تكتسب طفرات في المنطقة المتضخمة من الجينوم ، وبالتالي تصبح بعيدة المنال بالنسبة لنظام الاختبار هذا.

النقطتان الأخيرتان مهمتان لمطوري مجموعات تشخيص PCR. وقد تم الآن تطوير معايير لتنظيم مقدار الاختبارات (بما في ذلك اختبار التفاعلات المتصالبة، فضلاً عن اختبار السلالات المعروفة من مسببات الأمراض التي يتم اكتشافها) التي يجب أن يخضع لها نظام الاختبار قبل أن يصل إلى السوق.

6. تطبيق طريقة PCR

بوليميريز تشخيص الأمراض المعدية

يستخدم PCR في العديد من المجالات للتحليل والتجارب العلمية:

1. الطب الشرعي

يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) لمقارنة ما يسمى بـ "البصمات الجينية". مطلوب عينة من المادة الوراثية من مسرح الجريمة - الدم، اللعاب، السائل المنوي، الشعر، إلخ. ويتم مقارنتها بالمادة الوراثية للمشتبه به. كمية صغيرة جدًا من الحمض النووي تكفي نظريًا، نسخة واحدة. يتم تقسيم الحمض النووي إلى أجزاء ثم يتم تضخيمه باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل. يتم فصل الأجزاء باستخدام الرحلان الكهربائي للحمض النووي. ويسمى النمط الناتج لترتيب نطاقات الحمض النووي بالبصمة الجينية.

2. إثبات الأبوة

عند تحليل نتائج الترحيل الكهربائي لشظايا الحمض النووي المضخم باستخدام تقنية PCR الأب-الطفل-الأم، تم اكتشاف أن الطفل سوف يرث بعض ملامح البصمة الوراثية لكلا الوالدين، مما يعطي بصمة فريدة. على الرغم من أن البصمات الجينية فريدة من نوعها (باستثناء حالة التوائم المتطابقة)، إلا أنه لا يزال من الممكن إنشاء العلاقات الأسرية عن طريق أخذ عدة بصمات أصابع. ويمكن تطبيق نفس الطريقة، مع تعديل طفيف، لإثبات الارتباط التطوري بين الكائنات الحية.

3. التشخيص الطبي

يجعل PCR من الممكن تسريع وتسهيل تشخيص الأمراض الوراثية والفيروسية بشكل كبير. يتم تضخيم الجين محل الاهتمام بواسطة PCR باستخدام الاشعال المناسبة ومن ثم تسلسله لتحديد الطفرات. يمكن اكتشاف العدوى الفيروسية مباشرة بعد الإصابة، قبل أسابيع أو أشهر من ظهور الأعراض.

4. استنساخ الجينات

استنساخ الجينات هو عملية عزل الجينات، ونتيجة لتلاعب الهندسة الوراثية، يتم الحصول على كمية كبيرة من منتج جين معين. يُستخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الجين، ثم يتم إدخاله بعد ذلك في ناقل - قطعة من الحمض النووي تنقل جينًا غريبًا إلى نفس الكائن أو إلى كائن آخر مناسب للنمو. على سبيل المثال، يتم استخدام البلازميدات أو الحمض النووي الفيروسي كنواقل. عادة ما يتم استخدام إدخال الجينات في كائن غريب لإنتاج منتج ذلك الجين - RNA أو البروتين في أغلب الأحيان. وبهذه الطريقة يتم الحصول على العديد من البروتينات بكميات صناعية لاستخدامها في الزراعة والطب وغيرها.

5. تسلسل الحمض النووي

في طريقة التسلسل باستخدام الديديوكسينوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو النظائر المشعة، يعد PCR جزءًا لا يتجزأ، لأنه أثناء البلمرة يتم إدراج مشتقات النيوكليوتيدات الموسومة بعلامة الفلورسنت أو المشعة في سلسلة الحمض النووي. يؤدي هذا إلى إيقاف التفاعل، مما يسمح بتحديد مواقع نيوكليوتيدات معينة بعد فصل السلاسل المركبة في الجل.

6. الطفرات

حاليًا، أصبح تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو الطريقة الرئيسية لإجراء الطفرات (تعديل تسلسل النيوكليوتيدات في الحمض النووي). لقد أتاح استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) تبسيط وتسريع إجراء الطفرات، فضلاً عن جعله أكثر موثوقية وقابلية للتكرار.

7. تشخيص الأمراض المعدية

إن استخدام طريقة PCR لتشخيص الأمراض المعدية ذات الطبيعة البكتيرية والفيروسية له أهمية كبيرة في حل العديد من مشاكل علم الأحياء الدقيقة وعلم الأوبئة. يساهم استخدام هذه الطريقة أيضًا في تطوير الأبحاث الأساسية في مجال دراسة الأمراض المعدية المزمنة وغير المفهومة جيدًا.

8. تشخيص الأمراض الفيروسية

يمكن إثبات الفوائد الأكثر شمولاً لتفاعل البوليميراز المتسلسل في تشخيص الأمراض الفيروسية من خلال النظر في العملية المعدية التي يسببها فيروس التهاب الكبد الوبائي (HCV). يعتبر تفاعل البوليميراز المتسلسل ذو قيمة تشخيصية خاصة للكشف عن هذا الفيروس للأسباب التالية:

) عدم وجود طريقة لزراعة فيروس التهاب الكبد الوبائي. 2) لا توجد مجموعات تشخيص المستضد؛ 3) يكون تفاعل تكوين الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد الوبائي بطيئًا جدًا بحيث لا يمكن عادةً إجراء التشخيص أثناء المرحلة الحادة من العدوى.

ولذلك، فإن استخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للتشخيص ومراقبة جودة العلاج والتحليل الوبائي للمراضة الناجمة عن فيروس التهاب الكبد الوبائي (سي) أصبح الآن مقبولاً بشكل عام.

في الوقت نفسه، تسمح تقنية PCR فقط بحل المشكلات التالية: 1) تشخيص العدوى الحادة مع الكشف المتأخر عن الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد الوبائي (HCV)؛ 2) إجراء التشخيص المسبب لمرض التهاب الكبد الوبائي المزمن لدى المرضى الذين يعانون من ضعف المناعة. 3) تقييم فعالية العلاج المضاد للفيروسات. 4) الكشف عن تفير الدم لدى المتبرعين بالدم ذوي مستويات ناقلة الأمين الطبيعية؛ 5) تحديد التلوث المحتمل لمنتجات الدم. 6) تقييم مدى انتشار فيروس التهاب الكبد الوبائي.

9. تطبيق PCR في أمراض الرئة والسل

السبب الشائع للالتهاب الرئوي غير النمطي والتهاب الشعب الهوائية المزمن المتكرر هو الميكوبلازما والكلاميديا. إن تشخيص مسببات الأمراض هذه باستخدام الطرق التقليدية للفحص المجهري والزراعة البكتيرية غير فعال. لا يسمح PCR بتشخيص الكلاميديا ​​وداء المفطورات فحسب، بل يسمح أيضًا بتحديد أنواع العامل الممرض (C. pneumoniae، C. trachomatis، M. hominis، M. pneumoniae). إن استخدام طريقة PCR يمكن أن يحسن بشكل كبير التشخيص المبكر لمرض السل. حاليًا، تم تطوير مجموعات PCR وظهرت في السوق لتحديد مقاومة المتفطرات للمضادات الحيوية.

10. تطبيق PCR في ممارسة خدمة الدم

إن فحص دم المتبرع بحثًا عن التهاب الكبد والزهري وفيروس نقص المناعة البشرية بالطرق المصلية لا يستبعد خطورة استخدام الدم الملوث بسبب وجود فترة مصلية معينة لهذه الأمراض والتي يمكن أن تصل إلى عدة أسابيع من لحظة ظهور العامل الممرض في الجسم. دم. الطريقة الأكثر فعالية لفحص الدم لوجود هذه العوامل الممرضة هي طريقة PCR.

11. تطبيق PCR في حديثي الولادة

يمكن لعدد من الكائنات الحية الدقيقة أن تصيب الجنين أثناء الحمل. هذه هي الفيروس المضخم للخلايا، التوكسوبلازما، فيروس الهربس، فيروس الحصبة الألمانية، الميكوبلازما، الكلاميديا، إلخ. إن استخدام الاختبارات المصلية لتحديد هذه الالتهابات عند الأطفال حديثي الولادة غير فعال، لأن تكوين الجهاز المناعي للطفل يحدث على مدى عدة أشهر، ووجود قد لا يكون العامل المعدي مصحوبًا بإنتاج أجسام مضادة محددة . من ناحية أخرى، قد تكون الأجسام المضادة الأمومية من فئة IgG موجودة في دم الوليد لفترة طويلة، وتكون قادرة على اختراق حاجز المشيمة. وبالتالي، فإن وجود IgG محدد لدى الطفل في الأشهر الأولى من الحياة لا يشير إلى وجود العامل الممرض. استخدام تحليل PCR يزيد بشكل كبير من إمكانيات تشخيص التهابات الأطفال حديثي الولادة، بما في ذلك في مرحلة داخل الرحم.

12. تطبيق PCR في ممارسة أمراض الجهاز البولي التناسلي

من بين العوامل المعدية التي تؤثر على الجهاز البولي التناسلي، تم مؤخرا إيلاء الكثير من الاهتمام للعوامل المسببة للعدوى الكامنة والمزمنة - الكلاميديا ​​والميكوبلازما. تتميز الأمراض التي تسببها مسببات الأمراض هذه بأعراض سريرية غير واضحة ومسار مزمن، مما يؤدي في كثير من الأحيان إلى تلف الوظائف الإنجابية - الإجهاض والعقم. أظهرت العديد من الدراسات التي تدرس استخدام طريقة PCR للكشف عن Chlamydiatrachomatis، Mycoplasmahominis، Mycoplasmagenitalium، Ureaplasmaurealiticum، التي أجريت في عيادات كبيرة في بلدان مختلفة، الكفاءة العالية لهذه الطريقة. ومن المسلم به أنه من حيث الحساسية والكفاءة، فإن تفاعل البوليميراز المتسلسل يتفوق على طريقة الاستنبات المقبولة باعتبارها "المعيار الذهبي".

خاتمة

وبالتالي، فإن تقنية PCR هي أداة قوية توفر القدرة على دراسة وتشخيص العمليات المعدية المزمنة وبيئة مسببات الأمراض المعدية. تكمل طريقة التشخيص PCR الطرق الموجودة بالفعل للتشخيص الميكروبيولوجي وتغير منهجية حل المشكلات التطبيقية في علم الأحياء الدقيقة الطبية وعلم الأوبئة نوعيًا.

مع الأخذ في الاعتبار ما ورد أعلاه، سنقوم بصياغة مجالات البحث في علم الأمراض المعدية، والتي بدأ فيها تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) يلعب دورًا رائدًا.

تشخيص الحالات المعدية المزمنة الناتجة عن بقاء البكتيريا أو الفيروسات. هذا هو التطبيق الأكثر وضوحًا لـ PCR لأغراض التشخيص.

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) الطريقة الأكثر فعالية لتحديد ودراسة مسببات الأمراض التي تكون قادرة على البقاء هناك، في حالة "غير مزروعة"، والبقاء على قيد الحياة في الظروف الخارجية غير المواتية.

يسمح PCR بتحديد مقاومة المضادات الحيوية في البكتيريا بطيئة النمو والتي يصعب زراعتها.

المجالات الواعدة للاستخدام العملي لتشخيص PCR هي:

· تشخيص أمراض الأورام.

· تشخيص سرطان الدم والأورام اللمفاوية.

· تشخيص سرطان الثدي.

· تشخيص الأمراض الخبيثة الأخرى.

إن تشخيص الحمض النووي للأورام الحميدة والخبيثة محدود بكمية صغيرة ولكن متزايدة من المعلومات حول الجينات المرتبطة بهذه الأمراض؛

· تشخيص الأمراض الوراثية.

لا يمكن تشخيص الأمراض الوراثية إلا بعد إجراء بحث علمي واسع النطاق في الجينوم البشري. إلا أن المجتمع الطبي قد أدرك بالفعل أهمية دراسة الأساس الجيني للأمراض، وكذلك إمكانية تشخيص المرض وعلاجه قبل ظهور أعراضه؛

· تحديد الهوية الشخصية: الطب الشرعي، وعلم الجريمة. زرع الأعضاء والأنسجة. تحديد الأبوة. يقوم الخبراء بتقييم هذا المجال من سوق تشخيص الحمض النووي باعتباره واحدًا من أكبر وأسرع المجالات نموًا؛

غالبًا ما يستخدم كوسيلة سريعة للإشارة إلى الفيروسات وتحديد هويتها.

تم تطوير هذه الطريقة لأول مرة بواسطة ك. موليس (الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983. ونظرًا لحساسيتها العالية وخصوصيتها وسهولة تنفيذها، فإنها تستخدم على نطاق واسع في علم الوراثة والطب الشرعي والتشخيص وغيرها من المجالات.

جوهر الطريقة هو التضخيم، أي زيادة عدد نسخ الأجزاء المحددة بدقة من جزيء الحمض النووي في المختبر. تستخدم هذه الطريقة آلية المصفوفة ومبدأ التكامل. يمكن ربط سلسلتين متعدد النوكليوتيدات (الأحماض النووية) بروابط هيدروجينية في سلسلة واحدة مزدوجة إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات في إحداهما يتطابق تمامًا مع تسلسل النيوكليوتيدات في الأخرى بحيث يمكن لقواعدها النيتروجينية أن تشكل الأدينين - الثيمين والجوانين - السيتوزين أزواج.

يعتمد تفاعل البوليميراز المتسلسل على تضخيم الحمض النووي باستخدام بوليميراز الحمض النووي القابل للحرارة، والذي يقوم بتجميع خيوط الحمض النووي التكميلية المتبادلة، بدءًا من اثنين من البادئات. التمهيدي هو جزء من الحمض النووي يتكون من 20-30 نيوكليوتيدات. هذه الاشعال مكملة لسلاسل الحمض النووي المعاكسة. أثناء تخليق الحمض النووي، يتم إدخال البادئات في سلسلة جزيئات الحمض النووي المركبة حديثًا.

عادة يتم إجراء PCR في 25-40 دورة. تشتمل كل دورة على ثلاث مراحل: الأولى هي التسخين عند درجة حرارة 92-95 درجة مئوية. في هذه الحالة، يتباعد شريطا الحمض النووي؛ والثاني هو الصلب، أو إضافة الاشعال عند 50-65 درجة مئوية؛ والثالث هو الاستطالة، أو البلمرة عند 68-72 درجة مئوية، بينما ينفذ بوليميراز الحمض النووي إكمالًا تكميليًا لسلاسل قالب الحمض النووي باستخدام أربعة أنواع من النيوكليوتيدات. ونتيجة لدورة واحدة، يتم مضاعفة المادة الوراثية المطلوبة. تعمل سلاسل الحمض النووي المتكونة في الدورة الأولى كقوالب للدورة الثانية، وما إلى ذلك. وبعد الدورة الأولى، يتم تضخيم الجزء الموجود بين البادئين فقط. وبالتالي، يتم مضاعفة عدد نسخ المنطقة المضخمة، مما يجعل من الممكن تصنيع ملايين (2 ن) من شظايا الحمض النووي في 25-40 دورة - وهي كمية كافية للإشارة إليها بطرق مختلفة (طريقة تحقيقات التهجين التي تحتوي على نسبة معينة التسمية ، الكهربائي ، وما إلى ذلك). في كثير من الأحيان، يتم استخدام هلام الاغاروز الكهربائي مع تلطيخ بروميد إيثيديوم لهذا الغرض.

في تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من أقسام الحمض النووي لمسبب المرض، يتم استخدام البادئات التي تحتوي على تسلسل فريد من النيوكليوتيدات المميزة فقط لمسبب مرض معين.

يتلخص الإجراء الخاص بإجراء PCR فيما يلي: يتم عزل مصفوفة الحمض النووي عن المادة قيد الدراسة؛ في أنبوب اختبار، يتم دمج الحمض النووي المعزول مع خليط التضخيم، والذي يتضمن بوليميراز الحمض النووي، وجميع أنواع النيوكليوتيدات الأربعة، ونوعين من البادئات، وMgCl، والمخزن المؤقت، والماء منزوع الأيونات، والزيوت المعدنية. ثم يتم وضع الأنابيب في جهاز التدوير، ويتم التضخيم تلقائيًا وفقًا لبرنامج معين يتوافق مع نوع العامل الممرض. يتم تسجيل النتائج في كثير من الأحيان عن طريق الرحلان الكهربائي في هلام الاغاروز 1-2٪ في وجود بروميد الإيثيديوم، الذي يتحد مع شظايا الحمض النووي ويتم الكشف عنه في شكل أشرطة مضيئة عندما يتم تشعيع الجل بالأشعة فوق البنفسجية على ناقل الضوء. تستغرق جميع إجراءات PCR من يوم إلى يومين عمل.

من أجل زيادة خصوصية وحساسية PCR، يتم استخدام خيارات مختلفة: PCR المتداخل؛ PCR مع "بداية ساخنة" باستخدام طبقة البارافين أو حجب المراكز النشطة للبوليميراز بأجسام مضادة وحيدة النسيلة. بالإضافة إلى ذلك، تنتج بعض الشركات مجموعات كاشفة مجففة بالتجميد لتضخيم الحمض النووي، مما يؤدي إلى تسريع عملية تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) وتقليل احتمالية الحصول على نتائج إيجابية كاذبة.

ويجري حاليًا تقديم تقنية جديدة، Real-Time PCR. وتتمثل ميزتها الأساسية في المراقبة والتحليل الكمي لتراكم منتجات تفاعل البوليميراز المتسلسل والتسجيل التلقائي وتفسير النتائج التي تم الحصول عليها. لا تتطلب هذه الطريقة خطوة الرحلان الكهربائي، مما يقلل من متطلبات المختبر لـ PCR. يستخدم PCR في الوقت الحقيقي تحقيقات قليل النوكليوتيد المسمى بالفلورسنت للكشف عن الحمض النووي أثناء تضخيمه. يسمح تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الحقيقي بإجراء تحليل كامل للعينة في غضون 20 إلى 60 دقيقة، وهو من الناحية النظرية وسيلة للكشف حتى عن جزيء DNA أو RNA واحد في العينة.

يتيح لك نظام الكشف عن المنتج في تفاعل البوليميراز المتسلسل في الوقت الفعلي (مراقبة PCR) مراقبة تراكم دورة الحمض النووي المضخمة بدورة. يشتمل النظام أيضًا على مسبار قليل النوكليوتيد قادر على الارتباط (التهجين) بالجزء الداخلي من الحمض النووي المستهدف. يتم تمييز المسبار عند الطرف 5' بصبغة مراسل الفلورسنت، وعند الطرف 3' بصبغة مانعة (صبغة التبريد). ومع تراكم منتج PCR، يهجن المسبار معه، ولكن لا يحدث أي تلألؤ بسبب القرب بين المراسل والحاجز. ونتيجة لنسخ التسلسل، يصل البوليميراز إلى الطرف 5′ من المسبار. يقوم نشاط نوكلياز خارجي 5'-3' من البوليميراز بفصل علامة الفلورسنت من نهاية المسبار 3'، وبالتالي تحرير مراسل الفلورسنت من اتصاله بمانع الإشارة، مما يؤدي إلى زيادة في التألق. وبالتالي فإن مستوى التألق يتناسب مع كمية منتج التفاعل المحدد. من المهم أن يتم تسجيل نتائج تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من خلال وجود مضان في أنابيب مغلقة، وبالتالي يتم حل مشكلة أخرى من المشاكل الرئيسية لهذه الطريقة - مشكلة التلوث بالأمبليكونات.

مزايا PCR: سرعة التحليل؛ حساسية وخصوصية عالية. الحد الأدنى من مواد الاختبار؛ بساطة التنفيذ وإمكانية الأتمتة الكاملة.

نظرًا لأن حساسية تفاعل البوليميراز المتسلسل قد تصل إلى اكتشاف نسخة واحدة من قالب الحمض النووي، فإن هناك درجة عالية من خطر الحصول على نتائج إيجابية كاذبة. لذلك، عند إجراء اختبار PCR، يجب أن يلتزم مختبر التشخيص الوراثي بشكل صارم بالمتطلبات الخاصة للتخطيط ووضع التشغيل.

يعد تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) إحدى الطرق التكميلية الموجودة في التشخيص الفيروسي. يعد هذا التفاعل مهمًا جدًا لتشخيص العدوى الفيروسية عندما لا يمكن اكتشاف المستضدات الفيروسية أو الأجسام المضادة الخاصة بالفيروس وعندما يكون وجود الحمض النووي الفيروسي هو الدليل الوحيد على الإصابة، خاصة في حالات العدوى الكامنة والمختلطة.

إذا وجدت خطأ، يرجى تحديد جزء من النص والنقر عليه السيطرة + أدخل.

إن تفاعل البوليميراز المتسلسل معروف منذ 30 عامًا. ويستخدم على نطاق واسع في العديد من المجالات، من علم الآثار إلى علم الوراثة.

إنها طريقة PCR التي تساعد في إثبات الأبوة، ولكنها تستخدم في أغلب الأحيان لتحديد الأمراض المعدية المختلفة في جسم الإنسان.

كيف يتم إجراء تحليل PCR وما هو؟ سنحاول الإجابة على هذه الأسئلة بالتفصيل.

تحليل PCR - ما هو؟

تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) هو طريقة تشخيص وراثية جزيئية عالية الدقة تسمح لك بتحديد العديد من الأمراض المعدية والوراثية لدى البشر، سواء في المراحل الحادة أو المزمنة، وقبل وقت طويل من ظهور المرض.

إن طريقة تفاعل البوليميراز المتسلسل محددة تمامًا، وإذا تم إجراؤها بشكل صحيح، فلا يمكن أن تعطي نتيجة إيجابية كاذبة. أي أنه إذا لم تكن هناك عدوى، فلن يظهر التحليل وجودها أبدًا. لذلك، الآن في كثير من الأحيان، لتأكيد التشخيص، يقومون بالإضافة إلى ذلك بإجراء اختبار PCR لتحديد العامل الممرض وطبيعته.

تم تطوير تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على يد كاري موليس (الولايات المتحدة الأمريكية) في عام 1983، وحصل على جائزة نوبل في الكيمياء في عام 1993.

ما هي ميزة هذه الطريقة؟

يتيح لك التشخيص بهذه الطريقة العثور على العامل الممرض مباشرة في الجين الموجود في المواد قيد الدراسة. هذا هو الاختبار الأكثر دقة للأمراض المنقولة جنسيا، والالتهابات الخفية، والأمراض المنقولة جنسيا المختلفة.

الاختلافات بين تشخيص PCR وطرق البحث المختبرية الأخرىهم كالآتي:

• وتهدف هذه الطريقة إلى تحديد العامل الممرض نفسه؛
• يتميز التشخيص باستخدام طريقة PCR بتعدد استخداماته: للكشف عن العديد من مسببات الأمراض؛
• الأمراض، عينة بيولوجية واحدة فقط من المريض تكفي؛
• هذه الطريقة حساسة للغاية ولا تترافق مع ردود فعل متصالبة أخرى.

بالإضافة إلى ذلك، فإن ميزة تشخيص PCR هي أن أي مادة بيولوجية للمريض مناسبة للتحليل: الدم، الإفرازات التناسلية، البول، السائل المنوي.

ما هي أنواع العدوى التي يمكن لمسحة PCR اكتشافها؟

قد يكون هناك عدد كبير من العوامل المعدية في الجسم، بما في ذلك العوامل "المخفية" التي لا تظهر لفترة طويلة.

تحليل مسحة PCR يسمح لك باكتشاف مثل هذه العدوى:

• ureplasmosis في الأعضاء التناسلية.
• داء المبيضات ()؛
• الهربس.
• وجود الخلايا السرطانية.
• تقييم الحالة الهرمونية.

عادة ما تكون مادة اختبار PCR هي البلغم واللعاب والبول والدم. قبل إجراء التحليل، يجب عليك الاستعداد له بعناية من خلال استشارة الطبيب أولاً.

عادةً ما يتم التبرع بالدم لإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) على معدة فارغة. يتم عرض نتائج جيدة من خلال التحليل عندما يتم أخذ المادة المخصصة للبحث من قناة عنق الرحم أو مجرى البول. في هذه الحالة، من الأفضل إجراء تشخيص PCR في موعد لا يتجاوز يوم واحد بعد الجماع.

أنواع PCR

يستخدم PCR في العديد من المجالات للاختبار والتجارب العلمية. هناك طرق مختلفة للتحليل:

1. عكس النسخ PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - يُستخدم لتضخيم أو عزل أو تحديد تسلسل معروف من مكتبة RNA.
2. PCR مقلوب(معكوس PCR) - يستخدم عند معرفة منطقة صغيرة فقط ضمن التسلسل المطلوب. هذه الطريقة مفيدة بشكل خاص عندما يتعلق الأمر بتحديد التسلسلات المجاورة بعد إدخال الحمض النووي في الجينوم.
3. يتم استخدام PCR المتداخل لتقليل عدد منتجات التفاعل الثانوية. يتم استخدام زوجين من البادئات ويتم تنفيذ تفاعلين متسلسلين.
4. PCR غير المتماثل(eng. PCR غير المتماثل) - يتم إجراؤه عندما يكون من الضروري تضخيم أحد خيوط الحمض النووي الأصلي في الغالب. يستخدم في بعض تقنيات تحليل التسلسل والتهجين.
5. PCR الكمي(PCR الكمي، Q-PCR (الإنجليزية)) أو PCR في الوقت الحقيقي - يستخدم للمراقبة المباشرة لقياس كمية منتج PCR معين في كل دورة تفاعل.
6. خطوة بخطوة PCR (Touchdown PCR) - باستخدام هذا النهج، يتم تقليل تأثير الارتباط التمهيدي غير المحدد.
7. مجموعة محددة PCR(eng. PCR خاص بالمجموعة) - PCR للتسلسلات ذات الصلة داخل نفس الأنواع أو بين الأنواع المختلفة، باستخدام الاشعال المحافظ لهذه التسلسلات.

إذا كان تسلسل النيوكليوتيدات في القالب معروفًا جزئيًا أو غير معروف على الإطلاق، فيمكن استخدام البادئات المتحللة، والتي يحتوي تسلسلها على مواضع متحللة يمكن تحديد موقع أي قاعدة فيها. على سبيل المثال، يمكن أن يكون التسلسل التمهيدي: ...ATH...، حيث H هي A أو T أو C.

ما هي المواد البيولوجية التي تتم دراستها؟

يمكن أن تكون الوسائط البيولوجية المختلفة والسوائل البشرية بمثابة مواد لأبحاث PCR، حيث يمكن اكتشاف الحمض النووي البكتيري الغريب أو الحمض النووي الفيروسي أو الحمض النووي الريبي (RNA):

1. البول. يمكن استخدامه لعلاج التهابات الجهاز البولي التناسلي لدى الرجال والأعضاء البولية لدى النساء (عند الرجال، يحل استخدام البول كمادة محل كشط الظهارة).
2. اللعاب. يتم استخدامه لتشخيص مرض السل، وبشكل أقل شيوعًا، لتشخيص أشكال الجهاز التنفسي من الكلاميديا ​​وداء المفطورات. يتم جمع البلغم بكمية 15-20 مل في زجاجة معقمة (يمكن التخلص منها).
3. السوائل البيولوجية. يتم جمع عصير البروستاتا، والسائل الجنبي، والنخاعي، والسائل الأمنيوسي، وسائل المفاصل، وغسل القصبات الهوائية، واللعاب وفقًا للمؤشرات.
4. كشط ظهاري من الأغشية المخاطية. يُستخدم عادةً لتشخيص الأمراض المنقولة جنسيًا (STDs)، مثل السيلان، والكلاميديا، وداء المفطورات، وداء اليوريابلازما، وداء المشعرات، وداء الغاردنريلات، والهربس وغيرها من الالتهابات التي تؤثر على الأغشية المخاطية.
5. الخزعات. في أغلب الأحيان، يتم استخدام خزعات المعدة والاثني عشر للكشف عن عدوى هيليكوباكتر بيلوري.
6. الدم، البلازما، المصل. يستخدم لتحليل PCR لالتهاب الكبد B وC وD وG والهربس والفيروس المضخم للخلايا (CMV) وفيروسات فيروس نقص المناعة البشرية (HIV) وأبحاث الجينات البشرية.

كيف تستعد للاختبار؟

تعتمد موثوقية نتيجة PCR بشكل مباشر على التقديم الصحيح للمادة للفحص. يجب ألا تكون المادة ملوثة، وإلا فإن نتيجة الدراسة لن تكون موضوعية. ومن أهم التوصيات قبل إجراء اختبار PCR المتطلبات التالية:

1. يتم جمع البول في الصباح في وعاء معقم.
2. يجب إجراء فحص الدم للعدوى على معدة فارغة في الصباح.
3. يجب ألا تكون نشطًا جنسيًا في اليوم السابق للاختبار.

ستكون نتيجة التحليل جاهزة بعد 1.5 إلى يومين من الإجراء المعني. هناك حالات يمكن فيها تحضير النتيجة في نفس اليوم.

فك تشفير تحليل OPC

تتميز عملية تفسير البحث المقدم بالبساطة. يمكن الحصول على نتائج تحليل PCR بعد 1.5-2 يوم من تقديم المادة. في بعض الحالات، تكون النتيجة جاهزة في اليوم الأول، وإليك ما يمكن أن تعنيه:

• نتيجة سلبيةيوضح أن المادة التشخيصية لا تحتوي على العامل المعدي المطلوب.
• PCR إيجابييعني أن الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي (RNA) للعامل الممرض موجود في جسم الإنسان.

في بعض الحالات، يتم تحديد كمية الكائنات الحية الدقيقة. وهذا ينطبق بشكل خاص على الأمراض التي تسببها الكائنات الحية الدقيقة الانتهازية. حيث أن هذه البكتيريا لا تظهر آثارها السلبية إلا بكميات زائدة.

كما أن تحليل PCR الكمي مهم لاختيار التكتيكات العلاجية ولغرض مراقبة علاج الالتهابات الفيروسية مثل فيروس نقص المناعة البشرية وفيروسات التهاب الكبد.

ما مدى دقة تشخيص PCR للعدوى؟

وتتميز طريقة PCR بالدقة والنوعية والحساسية العالية. وهذا يعني أن هذا التحليل قادر على:

• تحديد بدقة وجود أو عدم وجود العدوى.
• الإشارة بالضبط إلى نوع العدوى (الخصوصية)؛
• اكتشاف العدوى حتى مع وجود محتوى منخفض للغاية من الحمض النووي الميكروبي في المواد البيولوجية،
• الذي تم اختباره (الحساسية).

تحليل PCR: السعر والشروط

يعتمد سعر اختبار معين على نوع العدوى التي سيتم اختبارك لها. الأسعار والشروط التقريبية:

1. الأمراض المنقولة جنسيا: 300-500 روبل، حيث - يوم واحد؛
2. فيروس ابشتاين بار، فيروس الورم الحليمي البشري، الهربس، الفيروس المضخم للخلايا: 300-500 روبل، حيث - 1 يوم؛
3. التهاب الكبد A، B، C، D، G: التحليل النوعي 650 روبل، التحليل الكمي 2000 روبل. الشروط - ما يصل إلى 5 أيام؛
4. الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد C، المجموع (Anti-HCV) – 420 روبل؛
5. الأجسام المضادة لفيروس التهاب الكبد C، IgM (Anti-HCV IgM) - 420 روبل؛
6. هيليكوباكتر بيلوري: 300-400 روبل، حيث - 1 يوم؛
7. فيروس نقص المناعة البشرية (الأجسام المضادة والمستضدات) - 380 روبل.
8. فيروس نقص المناعة البشرية RNA، جودة عالية – 3500 روبل؛
9. فيروس نقص المناعة البشرية RNA، كميا – 11000 روبل.

لتوفير المال، يمكنك اختيار حزمة تحليل ثابتة. يتم توفير هذه الخدمة في معظم العيادات حيث يمكنك إجراء الاختبار باستخدام طريقة PRC (المختبر، عيادة الأورام، وما إلى ذلك).

يبدأ إجراء تحليل PCR (تشخيص PCR) بجمع المواد لفحصها من قبل طبيب أمراض النساء أو طبيب المسالك البولية أو طبيب الأمراض الجلدية والتناسلية. يتم ضمان جودة وموثوقية النتائج التي تم الحصول عليها لاحقًا من خلال أعلى المؤهلات والخبرة الواسعة لأطباء المركز الطبي Euromedprestige، الذين يلتزمون بجميع القواعد اللازمة لإجراء تحليل PCR: العقم الكامل، واستخدام المواد التي يمكن التخلص منها فقط.

توضع المادة المجمعة من الفرشاة في وعاء به محلول ملحي. بعد جمع العينات، ينبغي تسليمها إلى مختبر PCR في أقرب وقت ممكن.

يتم إجراء تحليل PCR في المختبر على ثلاث مراحل:

1. استخراج الحمض النووي
2. تضخيم شظايا الحمض النووي
3. الكشف عن منتجات تضخيم الحمض النووي

استخراج الحمض النووي هو المرحلة الأولى من تشخيص PCR، وجوهرها هو كما يلي: يأخذ الطبيب مادة للبحث من المريض ويخضعها لمعالجة خاصة. أثناء المعالجة، يتم تقسيم الحلزون المزدوج للحمض النووي إلى خيوط فردية. تتم إضافة سائل خاص إلى مادة المريض، والذي يقوم بإذابة المواد العضوية التي تتعارض مع "نقاوة" التفاعل. هذا يزيل الدهون والأحماض الأمينية والببتيدات والكربوهيدرات والبروتينات والسكريات. ونتيجة لذلك، يتم تشكيل DNA أو RNA.

مبدأ طريقة PCR هو "بناء" عدوى DNA أو RNA الجديدة. لا يمكن القيام بذلك دون إزالة المادة الخلوية.

يعتمد مقدار الوقت المستغرق في استخراج الحمض النووي على العامل المسبب للعدوى وعلى نوع المادة المستخدمة في أبحاث تفاعل البوليميراز المتسلسل. على سبيل المثال، يستغرق إعداد الدم للمرحلة التالية من 1.5 إلى 2 ساعة.

0Array ( => التحليلات) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

تضخيم الحمض النووي

لتنفيذ المرحلة التالية من تشخيص الحمض النووي - تضخيم الحمض النووي - يستخدم الأطباء ما يسمى بمصفوفات الحمض النووي - جزيئات الحمض النووي للعدوى، والتي سيتم "استنساخ" الحمض النووي عليها لاحقًا. لقد سبق أن ذكرنا أن وجود الحمض النووي الكامل للعدوى ليس ضروريا، ولتنفيذ هذه المرحلة، تكفي قطعة صغيرة من جزيء الحمض النووي، الذي يميز فقط ميكروب معين (العدوى).

أساس تضخيم الحمض النووي، وبالتالي أساس مبدأ تفاعل PCR بأكمله هو العملية الطبيعية لإكمال الحمض النووي لجميع الكائنات الحية - تكرار الحمض النووي، والذي يتم عن طريق مضاعفة سلسلة DNA واحدة.

بدءًا من قطعة واحدة من الحمض النووي، يقوم طبيب المختبر بنسخها وزيادة عدد النسخ في وضع التفاعل المتسلسل: بعد الدورة الأولى يكون لديك بالفعل شظيتين، بعد الدورة الثانية - 4، بعد الثالثة - 8، بعد الدورة الأولى - 8، بعد الدورة الثانية - 4، بعد الدورة الثالثة - 8، بعد الدورة الأولى - 2 جزء. الرابع - 16، ثم 32، 64، 128، 256... مع كل دورة يتضاعف عدد النسخ، وبعد عشرين دورة يصل العدد بالفعل إلى الملايين، وبعد ثلاثين إلى المليارات. تستمر الدورة بضع دقائق وتتلخص في تغير معين في درجة الحرارة في مفاعل كيميائي صغير جدًا. هنا، في المحلول، توجد جميع المكونات الضرورية للتوليف بكميات كافية، أولاً وقبل كل شيء، النيوكليوتيدات A وG وT وC، وكذلك يتم تنفيذ العمليات الكيميائية التحضيرية الدقيقة بحيث يتم أخذ نسخة طبق الأصل من كل منها على الفور قطعة الحمض النووي النهائية، ثم من هذه النسخة - مرة أخرى نسخة، هذا هو التفاعل المتسلسل المتفرع.

من خلال ربط البادئات بسلسلة الحمض النووي - "قطع" من الحمض النووي (أزواج النوكليوتيدات) مُصنَّعة بشكل مصطنع تشبه الحمض النووي للميكروبات (العدوى) - يتم تشكيل حلزونين قصيرين يتكونان من شريطين من أقسام الحمض النووي، وهما ضروريان لتخليق المستقبل. الحمض النووي.

يتم تصنيع سلسلة جديدة من خلال استكمال كل من شريطي الحمض النووي. تتم عملية التضخيم بمساعدة منطقة معينة - بوليميريز الحمض النووي، والتي تعطي الاسم للطريقة المختبرية. يعمل البوليميراز كمحفز للتفاعل ويراقب الارتباط المتسلسل لقواعد النيوكليوتيدات مع شريط الحمض النووي الجديد المتنامي.

وبالتالي، فإن تضخيم الحمض النووي هو زيادة متعددة في عدد نسخ الحمض النووي المحددة، أي المتأصلة فقط في كائن حي معين. ليست هناك حاجة لإكمال سلسلة الحمض النووي بأكملها لرؤية العامل المعدي. هناك حاجة فقط إلى المنطقة التي تتميز بها بكتيريا معينة كفرد.

5360 فرك. تكلفة البرنامج الشامل مع طبيب الجهاز الهضمي

خصم 25% في موعد مع طبيب القلب

- 25%أساسي
زيارة الطبيب
المعالج في عطلة نهاية الأسبوع

5160 روبل روسي بدلا من 5420 فرك. فحص الرجال لالتهابات المسالك البولية

الحساسية 5120 روبل روسي بدلا من 5590 فرك.

تحدث جميع خطوات التضخيم المتكررة للغاية عند درجات حرارة مختلفة. لإجراء تحليل PCR، يتم استخدام معدات قابلة للبرمجة خصيصا - PCR - ترموستات أو مكبر للصوت، والذي يغير درجات الحرارة تلقائيا. ويتم التضخيم وفق برنامج معين يتوافق مع نوع العدوى التي يتم اكتشافها. اعتمادًا على البرنامج ونوع العدوى التي يتم اكتشافها، تستغرق عملية PCR الآلية من 2 إلى 3 ساعات.

تلعب مؤهلات طبيب المختبر الذي يقوم بالتحليل دورًا مهمًا في تشخيص تفاعل البوليميراز المتسلسل، حيث تعتمد عليه الإعدادات الصحيحة لأجهزة تفاعل البوليميراز المتسلسل وتفسير النتائج. يتمتع الأطباء في مركز يوروميدبريستيج الطبي بخبرة واسعة في إجراء تشخيصات الحمض النووي، مما يضمن موثوقية نتائج البحث ويضمن النجاح الإيجابي في علاج الأمراض المعدية. لإجراء اختبارات PCR وإجراء تشخيص وعلاج كاملين للأمراض المعدية في مركزنا الطبي Euromedprestige.

أثناء الكشف عن منتجات التضخيم، يتم فصل الخليط الناتج من منتجات التضخيم. تتم إضافة محاليل خاصة إلى الخليط، مما يمنح أجزاء الحمض النووي القدرة على التألق - وهو ما ينعكس في خطوط برتقالية حمراء مضيئة. ويشير التوهج الناتج إلى وجود الحمض النووي للفيروسات أو الميكروبات أو البكتيريا في المادة المأخوذة من المريض لتحليل PCR.