Reacția polimerică în lanț. Vedeți ce este „PCR” în alte dicționare

GOU VPO „Academia Medicală de Stat Krasnoyarsk”

numit după Agenția Federală pentru Sănătate și Dezvoltare Socială Yasenetsky »

Departamentul de Genetică Medicală și Neurofiziologie Clinică IPO

PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE METODEI

REACȚIA LANȚULUI POLIMERAZEI

Manual metodologic pentru elevii de 3-4 ani

în specialităţile de medicină generală (060101) şi

Krasnoyarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Principiile de bază ale metodei reacției în lanț a polimerazei. Manual metodologic de lucru extracurricular al elevilor de 3-4 ani la specialitățile de medicină generală (060101) și pediatrie (060103). – Krasnoyarsk: Editura Instituției de Învățământ de Stat de Învățământ Profesional Superior KrasSMA, 2007. – 42 p.

Manualul didactic respectă pe deplin cerințele Standardului de stat (2000) și reflectă principalele aspecte ale metodei moderne de diagnosticare a bolilor ereditare umane - metoda reacției polimerazei în lanț, materialul educațional este adaptat la tehnologiile educaționale, ținând cont de specificul de pregătire în 3-4 ani de facultăţi de medicină şi pediatrie.

Recenzători:Șef al Departamentului de Genetică Medicală, Instituția de Învățământ de Stat de Învățământ Profesional Superior

„Universitatea Medicală de Stat Novosibirsk a Agenției Federale pentru Sănătate și Dezvoltare Socială”, doctor în științe medicale, profesor;

Replicarea ADN-ului

Obiectul de studiu al acestei metode este acidul dezoxiribonucleic (ADN). ADN-ul este purtătorul universal de informații genetice în toate organismele existente pe Pământ (cu excepția microorganismelor care conțin ARN). ADN-ul este o catenă dublă răsucită într-o spirală. Fiecare catenă constă din nucleotide conectate în secvență. Catenele de ADN au direcții opuse: capătul de 5" al unei catene corespunde capătului de 3" al celei de-a doua catene. O proprietate unică a ADN-ului este capacitatea sa de a se dubla. Acest proces se numește replicare. Replicarea moleculei de ADN are loc în perioada de sinteză a interfazei. Fiecare dintre cele două lanțuri ale moleculei „mamă” servește ca șablon pentru „fiică”. După replicare, molecula de ADN nou sintetizată conține o catenă „mamă”, iar a doua este o catenă „fiică” nou sintetizată (metoda semi-conservativă). Pentru sinteza șablonului unei noi molecule de ADN, este necesar ca vechea moleculă să fie despirată și alungită. Replicarea începe în mai multe locuri din molecula de ADN. Se numește secțiunea unei molecule de ADN de la punctul de început al unei replici până la punctul de început al alteia replicon.

Începutul replicării este activat grunduri(amorsari) formate din 100-200 de perechi de nucleotide. Enzima ADN helicaza se desfășoară și împarte helixul ADN-ului mamă în două catene, pe care, conform principiului complementarității, cu participarea enzimei ADN polimerază, sunt asamblate catenele ADN „fiice”. Pentru ca enzima să își înceapă activitatea, este necesară prezența unui bloc de pornire - un mic fragment inițial dublu catenar. Blocul de pornire este format prin interacțiunea primerului cu regiunea complementară a catenei corespunzătoare a ADN-ului părinte. În fiecare replicon, ADN polimeraza se poate deplasa de-a lungul catenei „mamă” într-o singură direcție (5`=>3`).

Pe firul principal, pe măsură ce repliconul se desfășoară, o șuviță „fiică” crește treptat continuu. Pe șuvița rămasă, șuvița fiică se sintetizează și în direcția (5`=>3`), dar în fragmente separate pe măsură ce repliconul se desfășoară.

Astfel, adăugarea de nucleotide complementare ale catenelor „fiice” are loc în direcții opuse (antiparalel). Replicarea în toate replicon-urile are loc simultan. Fragmentele și părțile catenelor „fiice” sintetizate în diferiți repliconi sunt cusute într-o singură catenă de către enzima ligază. Replicarea se caracterizează prin semi-conservativitate, antiparalelism și discontinuitate. Întregul genom al unei celule este replicat o dată într-o perioadă de timp corespunzătoare unui ciclu mitotic. Ca rezultat al procesului de replicare, dintr-o moleculă de ADN se formează două molecule de ADN, în care o catenă este din molecula de ADN-mamă, iar a doua, fiică, nou sintetizată (Fig. 1).

Orez. 1. Schema de replicare a moleculei de ADN.

Astfel, ciclul de replicare a ADN-ului include trei etape principale:

1. derularea helixului ADN și divergența catenelor (denaturare);

2. atașarea primerilor;

3. completarea lanțului firului copil.

Principiul metodei PCR

Replicarea ADN-ului este cea care formează baza PCR. În PCR, procesele de mai sus sunt efectuate într-o eprubetă într-un mod ciclic. Trecerea de la o etapă de reacție la alta se realizează prin modificarea temperaturii amestecului de incubare. Când soluția este încălzită la 93-95°C, are loc denaturarea ADN-ului. Pentru a trece la următoarea etapă - adăugarea sau „recoacerea” primerilor - amestecul de incubare este răcit la 50-65°C. Apoi, amestecul este încălzit la 70-72°C - optimul pentru taq-ADN polimeraza - în această etapă are loc construcția unei noi catene de ADN. Apoi ciclul se repetă din nou. Cu alte cuvinte metoda PCR este o creștere multiplă a numărului de copii (amplificare) o secțiune specifică de ADN catalizată de enzima ADN polimeraza.

Creșterea catenelor fiice de ADN trebuie să aibă loc simultan pe ambele catene de ADN matern, astfel încât replicarea celei de-a doua catene necesită, de asemenea, propriul său primer. Astfel, la amestecul de reacție se adaugă doi primeri: unul pentru lanțul „+”, al doilea pentru lanțul „-”. Fiind atașați de catenele opuse ale moleculei de ADN, primerii se limitează la partea din acesta care va fi ulterior duplicată sau amplificată de multe ori. Lungimea unui astfel de fragment, numit amplicon, este de obicei de câteva sute de nucleotide.

Etapele PCR

Fiecare ciclu de amplificare include 3 etape, care au loc la diferite condiții de temperatură (Fig. 2).

· Etapa 1: Denaturarea ADN-ului . Apare la 93-95° timp de 30-40 de secunde.

· Etapa 2: recoacere grund . Atașarea primerilor are loc complementar cu secvențele corespunzătoare pe catenele de ADN opuse la granițele unei regiuni specifice. Fiecare pereche de grunduri are propria sa temperatură de recoacere, ale cărei valori sunt în intervalul 50-65°C. Timp de recoacere 20-60 sec.

· Etapa 3: completarea lanțurilor ADN. Completarea complementară a lanțurilor ADN are loc de la capătul de 5" până la capătul de 3" al lanțului în direcții opuse, începând de la locurile de atașare a primerului. Materialul pentru sinteza noilor lanțuri de ADN este trifosfații dezoxiribonucleozidici adăugați în soluție. Procesul de sinteză este catalizat de enzima taq polimeraza și are loc la o temperatură de 70-72°C. Timpul de sinteză este de 20-40 de secunde.

Noile lanțuri de ADN formate în primul ciclu de amplificare servesc ca șabloane pentru al doilea ciclu de amplificare, în care se formează un fragment specific de amplicon ADN (Fig. 3). În ciclurile de amplificare ulterioare, ampliconii servesc ca șablon pentru sinteza noilor lanțuri.

Astfel, acumularea de ampliconi în soluție are loc conform formulei 2", unde n este numărul de cicluri de amplificare. Prin urmare, chiar dacă soluția inițială conținea inițial o singură moleculă de ADN dublu catenar, atunci în 30-40 de cicluri aproximativ În soluție se acumulează 108 molecule de amplicon, aceasta cantitate este suficientă pentru detectarea vizuală fiabilă a acestui fragment prin electroforeză pe gel de agaroză.

Procesul de amplificare se realizează într-un termostat programabil special ( termociclor), care, conform unui program dat, schimbă automat temperaturile în funcție de numărul de cicluri de amplificare.

Pentru a realiza amplificarea, sunt necesare următoarele componente:

· matricea ADN-ului(ADN sau o parte a acestuia conţinând fragmentul specific dorit);

· Grunduri(oligonucleotide sintetice (20-30 perechi de nucleotide), complementare cu secvențele de ADN la limitele fragmentului specific în curs de determinare). Alegerea unui fragment specific și selecția primerilor joacă un rol critic în specificitatea amplificării, ceea ce afectează calitatea analizei.

· Amestec de trifosfați deoxinucleotidici (dNTPs)(un amestec de patru dNTP, care sunt materialul pentru sinteza noilor lanțuri de ADN complementare în concentrații echivalente de 200-500 µM)

· EnzimăTaq-polimeraza(ADN polimerază termostabilă care catalizează alungirea lanțurilor de primer prin adăugarea secvențială a bazelor nucleotidice la lanțul în creștere al ADN-ului sintetizat, 2-3 mM).

· Soluție tampon(mediu de reacție care conține ioni de Mg2+ necesari menținerii activității enzimatice, pH 6,8-7,8).

Pentru a identifica regiuni specifice ale genomului virusurilor ARN, se obține mai întâi o copie ADN dintr-un șablon de ARN folosind o reacție de transcripție inversă (RT) catalizată de enzima revertază (reverse transcriptază).

Orez. 2. Amplificare (ciclul I).

Orez. 3. Amplificare (ciclul 2).

Principalele aplicații ale PCR

· Medicină clinică:

o diagnosticarea infecțiilor,

o identificarea mutațiilor, inclusiv diagnosticul bolilor ereditare,

o genotipare, inclusiv genotipare HLA,

o tehnologii celulare

· ecologie (ca modalitate de a monitoriza starea și calitatea obiectelor de mediu și a produselor alimentare)

· determinarea organismelor transgenice (OMG)

Identificare personală, stabilire a paternității, criminalistică

· biologie generală și specifică,

Principii de baza

organizarea laboratoarelor de diagnostic

Activitatea în laboratorul PCR se desfășoară în conformitate cu „Regulile de proiectare, măsuri de siguranță, salubritate industrială, regim antiepidemic și igienă personală atunci când se lucrează în laboratoarele (departamente, secții) ale instituțiilor sanitare și epidemiologice ale sistemului de sănătate.

Contaminarea probelor de ADN

Efectuarea diagnosticului PCR este asociată cu o problemă din cauza sensibilității ridicate a metodei - posibilitatea contaminare. Introducerea unor urme de ADN pozitiv în tubul de reacție (produse specifice de amplificare a ADN - ampliconi; standard ADN utilizat ca martor pozitiv; ADN pozitiv dintr-o probă clinică) duce la amplificarea unui fragment specific de ADN în timpul PCR și, ca rezultat , la apariția unor rezultate fals pozitive.

În procesul de lucru, puteți întâlni două tipuri de contaminare:

1. contaminare încrucișată de la probă la probă (în timpul prelucrării probelor clinice sau la dizolvarea amestecului de reacție), ducând la rezultate sporadice fals-pozitive;

2. contaminarea cu produse de amplificare(ampliconi), care este de cea mai mare importanță, deoarece în timpul procesului de PCR, ampliconii se acumulează în cantități uriașe și sunt produse ideale pentru reamplificare.

Contaminarea articolelor din sticlă, a pipetelor automate și a echipamentelor de laborator, a suprafeței băncilor de laborator sau chiar a suprafeței pielii lucrătorilor din laborator cu urme de ampliconi duce la rezultate sistematice fals pozitive. Determinarea sursei de contaminare poate fi foarte dificilă și necesită o investiție semnificativă de timp și bani. Experiența acumulată până în prezent în laboratoare folosind metoda PCR pentru diagnosticare ne permite să formulăm cerințele de bază pentru organizarea unor astfel de laboratoare și efectuarea analizelor în sine. Respectarea acestor cerințe elimină posibilitatea contaminării și a rezultatelor fals pozitive.

Etapele analizei PCR

Acestea sunt separate geografic prin plasarea lor în încăperi separate (Fig. 4, 5):

· Sala de pre-PCR, unde se prelucrează probele clinice, se izolează ADN-ul, se prepară un amestec de reacție pentru PCR și se efectuează PCR (dacă există condiții, se recomandă, de asemenea, să fie efectuate ultimele două etape într-o încăpere separată suplimentară). În aceste incinte, este interzisă efectuarea tuturor celorlalte tipuri de lucrări cu agenți de testare, a căror diagnosticare PCR se efectuează în acest laborator.

· Camera post-PCR, unde se realizează detectarea produselor de amplificare. În această cameră pot fi utilizate și alte metode de detectare. Este recomandabil să amplasați camera de detectare a produsului de amplificare cât mai departe de încăperile pre-PCR.

Camerele de lucru sunt echipate cu lămpi ultraviolete cu o radiație maximă în regiunea de 260 nm (tip DB-60) la o rată de 2,5 W pe 1 m3. Lămpile sunt amplasate astfel încât suprafețele meselor de lucru, echipamentelor și materialelor cu care operatorul are contact în timpul analizei PCR să fie expuse la iradiere directă. Iradierea se efectuează cu 1 oră înainte de începerea lucrului și în decurs de 1 oră după terminarea lucrării.

Medicii de laborator lucrează în îmbrăcăminte specială de laborator, care se schimbă la mutarea dintr-o cameră în alta, și în mănuși de unică folosință. Hainele din camere diferite sunt prelucrate separat. Diferiți angajați lucrează în diferite etape ale analizei PCR.

Pentru lucru se folosesc seturi separate de dozatoare, plastic și sticlă, echipamente de laborator, halate și mănuși, destinate diferitelor etape de analiză și neportabile dintr-o cameră în alta. Echipamentele, materialele și rechizitele din fiecare cameră sunt marcate corespunzător.

Toate etapele de lucru sunt efectuate numai folosind consumabile de unică folosință: vârfuri pentru pipete automate, eprubete, mănuși etc. Asigurați-vă că schimbați vârfurile când treceți de la probă la probă. Este necesar să folosiți vârfuri cu filtru - o barieră de aerosoli pentru a preveni intrarea micropicăturilor de soluție în pipetă. Tuburile și vârfurile uzate sunt aruncate în recipiente speciale sau recipiente care conțin o soluție dezinfectantă. Probele clinice sunt depozitate separat de reactivi.

Pentru procesarea și curățarea locului de muncă, fiecare cameră este dotată cu tampoane din tifon de bumbac (șervețele), pensete, soluții dezinfectante și inactivante.

Laboratorul de diagnostic PCR exclude lucrările legate de producerea (clonarea) și izolarea plasmidelor recombinante care conțin secvențe ADN sau fragmente de gene ale agenților patogeni care sunt diagnosticați în acest laborator.

Colectarea materialului clinic

Materialul care urmează a fi studiat pentru PCR poate fi răzuire ale celulelor epiteliale, sânge, plasmă, ser, lichid pleural și cefalorahidian, urină, spută, mucus și alte secreții biologice, biopsii.

Materialul este colectat într-o cameră de tratament cu profilul corespunzător. După colectare, probele trebuie livrate la laboratorul de diagnostic PCR cât mai curând posibil.

Probele trebuie prelevate folosind instrumente sterile, de preferință de unică folosință, numai în tuburi sterile de plastic de unică folosință sau tuburi de sticlă, pre-tratate timp de o oră cu un amestec de crom, spălate temeinic cu apă distilată și calcinate într-un dulap de uscare la o temperatură de 150°C. timp de 1 oră.

Zona de detectare (alt etaj sau altă clădire).

Orez. 4. Dispozitiv de laborator PCR cu detecție prin electroforeză.

Zona de detectare (alt etaj sau altă clădire)

Orez. 5. Dispozitiv de laborator PCR cu detectie fluorescenta (analiza cantitativa).

Orez. 6. Camera de extracție ADN. Este prezentată o cutie de masă cu o lampă germicidă.

Orez. 7. Sala de amplificare.

Orez. 8. Camera de detectare.

Orez. 9. Probe de sânge pentru diagnosticul ADN al bolilor ereditare.

Depozitarea și transportul probelor

Pentru a diagnostica bolile ereditare, probele de sânge sunt depozitate pe formulare speciale de hârtie sau în epindorf (tuburi de plastic) în stare înghețată pentru o perioadă lungă de timp (Fig. 9).

Pentru a diagnostica bolile infecțioase, probele sunt păstrate la temperatura camerei timp de cel mult 2 ore. Dacă este necesară o păstrare mai lungă, probele pot fi plasate într-un frigider la o temperatură de 2-8°C pentru o perioadă de cel mult o zi. Este permisă o păstrare mai lungă (până la 2 săptămâni) congelată într-un congelator la o temperatură de minus 20°C. Nu este permisă înghețarea și decongelarea repetată a probelor.

Dacă laboratorul de diagnosticare PCR și camera de procedură pentru prelevare sunt separate geografic, atunci transportul probelor trebuie efectuat în termos sau recipiente termice, în conformitate cu regulile de depozitare a probelor și regulile de transport al materialelor infecțioase.

Extragerea ADN-ului din probe

S-a răspândit metoda de sorbție în fază solidă, care constă în adăugarea unui agent de liză care conține o soluție de guanidină, sorbția ADN-ului pe un sorbent, spălarea repetată și resorbția ADN-ului cu o soluție tampon. La procesarea serului, plasmei sau sângelui integral, se utilizează de obicei metoda de extracție cu fenol. Metoda implică deproteinizarea cu fenol/cloroform urmată de precipitarea ADN (sau ARN) cu etanol sau izopropanol. Prelucrarea se realizează în tuburi de microcentrifugă Eppendor P cu un volum de 1,5 ml. Timpul de procesare este de 1,5-2 ore (Fig. 10).

Orez. 10. extragerea ADN-ului.

Efectuarea PCR

O anumită cantitate de probă din proba clinică procesată este transferată într-un tub special de microcentrifugă de tip Eppendorf cu un volum de 0,2 sau 0,5 ml.Se adaugă un amestec de amplificare format din apă, tampon PCR, soluție dNTP, soluție de primer și soluție. același tub. Taq polimerază (adăugat ultima dată la amestec). De obicei, volumul amestecului de reacție este de 25 µl. Apoi se adaugă o picătură de ulei mineral în fiecare tub pentru a preveni evaporarea amestecului de reacție în timpul procesului de amplificare. tuburile sunt transferate la un termostat programabil (amplificator), unde amplificarea se realizează automat conform unui program dat (Fig. 11).

Orez. unsprezece. Amplificator " Termociclator ».

Timpul de reacție, în funcție de programul specificat, este de 2-3 ore. În paralel cu probele experimentale, sunt plasate probe de control: controlul pozitiv include toate componentele reacției, dar în locul materialului probei clinice se adaugă un preparat ADN martor al genei studiate. Martorul negativ include toate componentele reacției, dar în locul materialului clinic sau preparatului ADN se adaugă o cantitate adecvată de apă deionizată sau un extract care nu conține ADN-ul testat. Controlul negativ este necesar pentru a verifica componentele de reacție pentru absența ADN-ului din cauza contaminării și pentru a exclude rezultatele fals pozitive.

Înregistrarea rezultatelor

Fragmentul de ADN specific amplificat este detectat prin electroforeză pe gel de agaroză în prezența bromurii de etidio. Bromura de etidio formează un compus interstițial stabil cu fragmente de ADN, care apare sub formă de benzi luminoase atunci când gelul este iradiat cu radiații UV cu o lungime de undă de 290-330 nm. În funcție de dimensiunea ampliconilor formați ca urmare a PCR, se folosește un gel cu un conținut de agaroză de 1,5% până la 2,5%. Pentru a prepara un gel de agaroză, un amestec de agaroză, tampon și apă se topește într-un cuptor cu microunde sau într-o baie de apă și se adaugă o soluție de bromură de etidio. Amestecul, răcit la 50-60°C, se toarnă în matriță într-un strat de 4-6 mm grosime și, cu ajutorul pieptenilor speciali, se fac în gel buzunare pentru aplicarea probei. Pieptenii sunt instalați în așa fel încât să rămână un strat de 0,5-1 mm de agaroză între fundul godeurilor și baza gelului. După ce gelul se întărește, amplificatorul este aplicat pe buzunare în cantitate de 5-15 μl. Se recomandă efectuarea electroforezei unui amestec de markeri de lungime a fragmentelor de ADN în paralel cu probele de control și experimentale. De obicei, un astfel de amestec conține zece fragmente de ADN cu lungimea de 100, 200, 300, etc. perechi de baze.

Utilizarea unui astfel de test face posibilă verificarea lungimii ampliconilor în probele de control și experimentale. Gelul cu proba aplicată este transferat într-o cameră de electroforeză umplută cu tampon, camera este conectată la o sursă de alimentare și se efectuează separarea electroforetică a produselor de amplificare timp de 30-45 de minute la o intensitate a câmpului electric de 10-15 V/ cm. În acest caz, partea frontală a colorantului inclus în amestecul de reacție trebuie să parcurgă cel puțin 3 cm.

După ce electroforeza este finalizată, gelul este transferat într-un transiluminator de sticlă și vizualizat sub lumină ultravioletă. Pentru documentare, gelul este fotografiat pe film Micrat 300 sau înregistrat folosind un sistem video conectat la un computer.

În primul rând, se evaluează probe de control. O bandă strălucitoare portocalie ar trebui să fie prezentă pe pista electroforetică corespunzătoare controlului pozitiv. Mobilitatea sa electroforetică trebuie să corespundă lungimii ampliconului specificată în instrucțiuni.

În pista electroforetică corespunzătoare controlului negativ, o astfel de bandă ar trebui să fie absentă. Prezența unei astfel de benzi în controlul negativ indică contaminarea - contaminarea reactivilor utilizați cu ADN-ul sau ampliconul de testare. Probele de testare sunt evaluate prin prezența unei benzi în pista corespunzătoare, care este situată la același nivel cu banda din proba de control pozitiv. Intensitatea benzii corespunde cantității de ADN testată în probă, ceea ce permite o evaluare semicantitativă a PCR. De obicei, rezultatele pozitive sunt evaluate pe o scară de patru puncte. Dacă strălucirea benzii din proba de testare este foarte slabă, atunci o astfel de probă trebuie rearanjată (Fig. 12).

Orez. 12. Electroforeza pe gel de agaroză.

Aplicații PCR pentrudiagnosticarea mutațiilor punctuale și a polimorfismelor genelor

Unul dintre principalele domenii de aplicare a PCR în asistența medicală practică este diagnosticarea mutațiilor punctuale și a polimorfismelor genelor. . Există metode directe și indirecte de diagnosticare ADN. În situațiile în care se cunoaște o genă, afectarea căreia duce la dezvoltarea unei boli ereditare, această afectare poate fi detectată prin metode genetice moleculare. Astfel de metode se numesc directe. Folosind metode directe, sunt detectate nereguli în secvența primară de nucleotide a ADN-ului (mutații și tipurile acestora). Metodele directe se caracterizează prin precizie care atinge aproape 100%.

Cu toate acestea, în practică, aceste metode pot fi utilizate în anumite condiții:

· cu localizare citogenetică cunoscută a genei responsabile de dezvoltarea unei boli ereditare;

· gena bolii trebuie donată și secvența sa de nucleotide trebuie cunoscută.

Scopul diagnosticului direct al ADN este de a identifica alelele mutante.

Astfel, în situațiile în care se știe ce fel de deteriorare a ADN-ului duce la o boală ereditară, fragmentul de ADN care conține afectarea este examinat direct, adică se utilizează metoda de diagnostic direct ADN.

Cu toate acestea, până în prezent, genele multor boli nu au fost cartografiate, organizarea lor exon-intron este necunoscută, iar multe boli ereditare sunt caracterizate printr-o eterogenitate genetică pronunțată, ceea ce nu permite utilizarea deplină a metodelor directe de diagnosticare ADN. Prin urmare, în cazurile în care localizarea leziunii este necunoscută, se utilizează o altă abordare, legată de studiul vecinătății genei responsabile de boala genică, în combinație cu analiza familiei, adică metode indirecte de diagnostic genetic molecular al se folosesc boli ereditare.

Diferite metode pot fi utilizate pentru a detecta mutațiile punctuale și micile deleții, dar toate se bazează pe metoda PCR. Această reacție vă permite să multiplicați secvența de nucleotide ADN de mai multe ori și apoi să căutați mutații. Metodele de căutare a fragmentelor de ADN purtătoare de mutații se bazează pe o analiză comparativă a secvențelor de nucleotide ADN mutante și normale.

Analiza produselor PCR

în procesul de diagnosticare directă a ADN-ului

Implica studiul caracteristicilor specifice ale regiunii genei amplificate. Astfel, în bolile cauzate de expansiunea repetițiilor trinucleotidelor, produsele de amplificare diferă în lungime (reflectând numărul diferit de tripleți din regiunea genei studiate) și, drept consecință, în viteza lor de mișcare în gel. Datorită acestui fapt, se realizează o separare electroforetică clară a alelelor normale și mutante și o determinare precisă a unui fragment alungit patologic, adică diagnosticul ADN al bolii (Fig. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

Orez. 14. Diagnosticul ștergerii GAG în genă DYT 1 la pacienții cu distonie independentă de dopa (electroforeză pe gel de poliacrilamidă). Benzile 2,3,6 – bolnavi; pistele 1,4,5 – control. Săgeata subțire indică alela normală, săgeata groasă indică alela mai scurtă mutantă (deleția a trei nucleotide).

Dacă întreaga regiune ADN studiată face parte dintr-o deleție extinsă, atunci amplificarea prin PCR a ADN-ului din această alelă ștearsă nu va fi efectuată din cauza lipsei de situsuri pentru hibridizarea primerului. În acest caz, o deleție homozigotă va fi diagnosticată pe baza absenței complete a unui produs de reacție PCR (sinteza ADN-ului este imposibilă din ambele copii ale genei). Cu o deleție heterozigotă, este posibil să se detecteze un produs PCR sintetizat dintr-o alelă normală (reținută); cu toate acestea, pentru a diagnostica în mod fiabil o astfel de mutație, este necesar să se utilizeze metode de imagistică ADN mai complexe care să permită estimarea dozei PCR-ului final. produs.

Pentru a identifica mutațiile punctuale (cel mai adesea substituții de nucleotide) în anumite situsuri, metoda PCR este utilizată în combinație cu alte metode de analiză genetică moleculară. Dacă locația și natura mutației punctuale presupuse sunt cunoscute cu precizie, atunci endonucleaze de restricție (enzime de restricție) sunt enzime celulare speciale izolate din diferite tulpini de bacterii.

Aceste enzime recunosc secvențe de nucleotide specifice cu lungime de la patru până la zece nucleotide. După aceea, se efectuează restricția (lat. (tăiere)) a acestor secvențe ca parte a unei molecule de ADN dublu catenar. Fiecare enzimă de restricție recunoaște și taie într-un loc fix o secvență de nucleotide specifică strict definită - site de restricție (site de recunoaștere).

În cazurile în care o mutație punctuală modifică locul de recunoaștere natural pentru o anumită enzimă de restricție, această enzimă nu va putea scinda fragmentul mutant amplificat prin PCR. În unele cazuri, o mutație duce la apariția unui nou loc de recunoaștere pentru o anumită enzimă de restricție care este absentă în mod normal.

În ambele situații, produsele PCR mutante și normale tratate cu enzima de restricție selectată vor produce fragmente de restricție de lungimi diferite, care pot fi ușor detectate prin electroforeză (Fig. 15).

Astfel, dacă este necesar să se detecteze rapid orice mutație punctuală specifică, sarcina este redusă la căutarea enzimei de restricție corespunzătoare, al cărei situs de recunoaștere este localizat la locul secvenței de nucleotide perturbate. Tratamentul produselor PCR cu o astfel de enzimă de restricție va face posibilă diferențierea cu ușurință a alelelor normale și mutante. Analiza de restricție simplifică foarte mult detectarea mutațiilor punctuale cunoscute și este acum utilizată pe scară largă pentru diagnosticul direct ADN al bolilor ereditare.

Etapa finală analiza genetică moleculară a mutațiilor este de a determina secvența de nucleotide a fragmentului de ADN studiat (secvențiere), care este comparată cu norma și se formulează un diagnostic genetic final. Datorită succeselor geneticii moleculare, acum au fost dezvoltate metode de diagnostic ADN pentru mai mult de 400 de boli ereditare.

Orez. 15. Detectarea mutației punctuale folosind analiza de restricție: A – regiune genică amplificată care conține un situs de restricțieAGCTpentru endonuclează de restricţieAlu eu. MutaţieG→ Amodifică această secvență de nucleotide, rezultând enzima de restricțieAluIblocat; B – electroferograma produșilor de restricție: pista 1 – homozigote pentru alela normală; pista 2 – homozgozitate pentru mutație; pista 3 – stare heterozigotă (alelă normală + mutație).

Diagnosticul bolilor ereditare, bazat pe examinarea directă a alelelor mutante la pacienți, membrii familiei acestora sau purtători heterozigoți suspectați de mutații patologice, este potrivit pentru diagnosticul pre-simptomatic și prenatal, care poate fi aplicat în primele etape ale dezvoltării fetale, înainte de apariția oricăror simptome clinice sau biochimice boli.

Indiferent de metoda de detectare a mutațiilor, caracteristicile moleculare precise ale fiecărei mutații pot fi obținute numai prin secvențiere directă. Pentru a automatiza acest proces, în ultimii ani au fost utilizate pe scară largă dispozitive speciale - secvențiere, care fac posibilă accelerarea semnificativă a procesului de citire a informațiilor ADN.

Calea către o utilizare mai largă a cercetării biologice moleculare în laboratoarele de diagnostic clinic este deschisă prin accelerarea procesului analitic prin efectuarea tuturor procedurilor într-un continuum, fără transfer de probe, creând condiții pentru prevenirea contaminării în timpul testării paralele a unui număr de analiți și prin înregistrarea obiectivă a rezultate în fiecare ciclu.

Principalele modificări ale metodei PCR

Folosit pentru a scana și a căuta rapid mutații genetice cunoscute.

PCR multiplex (multi-primer).

Această metodă se bazează pe amplificarea simultană a mai multor exoni ai genei studiate într-o singură reacție. Acest lucru permite screening-ul rapid rentabil al celor mai frecvente mutații. De exemplu, pentru a diagnostica rapid purtarea delețiilor în gena distrofinei la pacienții cu distrofie musculară Duchenne/Becker progresivă, se efectuează amplificarea simultană a unui set de exoni cei mai frecvent mutați ai acestei gene. Deoarece aceste boli sunt moștenite într-o manieră recesivă legată de X și sunt asociate cu deteriorarea singurului cromozom X la băieți, în cazul unei deleții extinse, electroforeza produselor de reacție va dezvălui absența unuia sau mai multor fragmente de ADN (exoni). ), care poate servi ca confirmare moleculară a diagnosticului. În plus, prin selectarea secțiunilor specifice de genă pentru amplificarea PCR, este posibilă o evaluare destul de precisă a lungimii totale a deleției și a punctelor de rupere a genei (până la exon).

Utilizarea combinată a mai multor reacții multiple face posibilă diagnosticarea a până la 98% din toate delețiile care apar la pacienții cu distrofie musculară Duchenne/Becker progresivă. Aceasta reprezintă aproximativ 60% din numărul total de mutații cunoscute ale genei distrofinei și indică eficiența foarte mare a acestei metode de screening pentru diagnosticul ADN al distrofinopatiilor (Fig. 16).

Orez. 16. Diagnosticul ADN direct al distrofiei musculare Duchenne folosind PCR multiplex (electroforeza pe gel de agaroză). La fiecare dintre indivizii examinați, patru exoni ai genei distrofinei au fost amplificați simultan (exonii 17, 19, 44 și 45; săgețile indică produsele de amplificare corespunzătoare). Banda 1 – control, benzile 2-5 – pacienți cu distrofie musculară Duchenne cu diverse deleții ale genei distrofinei (bandele 2 și 5 – ștergerea exonului 45, calea 3 – ștergerea exonului 44, calea 4 – ștergerea exonilor 17 și 19 ).

Amplificare specifică alelelor

Metoda se bazează pe utilizarea a două perechi independente de primeri pentru o regiune specifică a genei: un primer în ambele perechi este comun, iar al doilea primer din fiecare pereche are o structură diferită și este complementar fie unei secvențe de ADN normală, fie mutantă. Ca rezultat al unei astfel de reacții, două tipuri de produse PCR pot fi sintetizate simultan în soluție - normală și mutantă. Mai mult, designul primerilor utilizați face posibilă diferențierea clară a produselor de amplificare normale și mutante după dimensiunea lor moleculară. Această metodă este foarte vizuală și vă permite să verificați atât transportul homo- și heterozigot al alelei mutante.

Metodă pentru modificarea direcționată la situs a ADN-ului amplificat

Metoda se bazează pe utilizarea unui așa-numit primer primer de nepotrivire în PCR (nu este complet complementar cu șablonul), care diferă de secvența de ADN șablon printr-o singură nucleotidă. Ca rezultat al includerii primerului specificat în produsul PCR mutant, în acesta se formează un situs de restricție creat artificial pentru una dintre endonucleazele de restricție, care permite diagnosticarea directă a ADN-ului unei anumite mutații cunoscute folosind analiza de restricție. Crearea unui astfel de sit de restricție artificial este necesară dacă căutarea nu a relevat existența unei enzime cunoscute și disponibile, al cărei situs de restricție „natural” este afectat ca urmare a apariției mutației studiate în molecula de ADN. .

Metoda PCR a transcriptazei inverse (RT- PCR)

Această metodă este utilizată în cazurile în care este mai convenabil să se folosească nu ADN genomic ca obiect de studiu, ci un ADNc mai compact și mai bogat în informații, obținut după procesarea corespunzătoare a probelor de țesut, de exemplu, material de biopsie sau linii celulare de limfocite, fibroblaste, etc. Condiția importantă aici este expresia (cel puțin minimă) a genei dorite în țesutul studiat.

În prima etapă, se efectuează transcripția inversă a ARNm, iar moleculele de ADNc rezultate servesc ca matriță pentru PCR. Ulterior, regiunea critică a ADNc, amplificată în cantitate suficientă, este supusă secvenței și altor metode de screening al mutațiilor, studiului electroforetic direct (detecția delețiilor, inserțiilor etc.) sau integrării într-un sistem de expresie în vederea obținerii unui produs proteic. și analiza lui directă.

Această metodă este deosebit de eficientă pentru detectarea mutațiilor care duc la sinteza unei proteine ​​„trunchiate” (mutații nonsens, mutații splicing, deleții mari) - așa-numita analiză PTT (Protein Truncation Test). Analiza PTT este utilizată în mod obișnuit în studiul genelor multi-exon lungi, cum ar fi distrofia musculară Duchenne/Becker, ataxia-telangiectazia sau neurofibromatoza de tip 1.

PCR în timp real(PCR în timp real, engleză)

În fiecare an, PCR în timp real devine o metodă de diagnostic din ce în ce mai populară în asistența medicală practică. Caracteristica sa fundamentală este monitorizarea și analiza cantitativă a acumulării de produși de reacție în lanț a polimerazei și înregistrarea și interpretarea automată a rezultatelor obținute. Această metodă nu necesită o etapă de electroforeză, ceea ce reduce cerințele pentru un laborator PCR. Datorită economisirii spațiului de producție, reducerii numărului de personal și a cererii de determinare cantitativă a ADN/ARN, această metodă a fost utilizată cu succes în ultimii ani în cele mai mari centre sanitar-epidemiologice, de diagnostic și de cercetare din țările dezvoltate ale lumii, înlocuind PCR în formatul actual („clasic”).

PCR în timp real utilizează sonde de oligonucleotide marcate fluorescent pentru a detecta ADN-ul pe măsură ce este amplificat. PCR în timp real permite analiza completă a unei probe în 20-60 de minute și teoretic este capabilă să detecteze chiar și o moleculă de ADN sau ARN într-o probă.

Orez. 17. PCR în timp real.

PCR în timp real folosește un sistem TaqMan care controlează cinetica PCR direct în timpul amplificării folosind stingerea fluorescenței prin rezonanță. Pentru detectare, se folosește o sondă care poartă un fluorofor și un stingător complementar părții de mijloc a fragmentului amplificat. Când fluoroforul și stingerea sunt legate de sonda oligonucleotidică, se observă doar o emisie fluorescentă minoră. În timpul procesului de amplificare, datorită activității exonucleazei de 5" a polimerazei Taq, eticheta fluorescentă intră în soluție, eliberată de apropierea sa de stingător și generează un semnal fluorescent care crește în timp real proporțional cu acumularea amplificatorului ( Fig. 17).

Principalele avantaje ale PCR în timp real față de PCR cu electroforeză pe gel:

· Întreaga metodă se desfășoară într-o singură eprubetă;

· Metoda durează 1 oră;

· 1-2 camere de lucru sunt suficiente;

· Alături de o evaluare calitativă a rezultatului, există posibilitatea unei evaluări cantitative (de exemplu, la prescrierea terapiei antivirale pentru SIDA sau hepatită virală, este necesar să se cunoască încărcătura virală, adică cantitatea de virus pe unitate, care este furnizată de PCR în timp real);

· Riscul de contaminare este redus drastic.

Concluzie

Metoda PCR este una dintre cele mai comune metode de cercetare biologică moleculară. Această metodă ar trebui să fie folosită în mod inteligent de către clinicieni, iar un medic care decide să folosească PCR în activitatea sa trebuie să aibă anumite cunoștințe despre caracteristicile și capacitățile acestei metode. În al doilea rând, trebuie să existe un feedback strâns între clinician și laboratorul PCR, care este necesar pentru a analiza cazurile complexe și a dezvolta strategia de diagnosticare corectă. În al treilea rând, analiza PCR nu este un panaceu în diagnosticare (în primul rând boli infecțioase) și nu înlocuiește metodele de cercetare existente, ci doar le completează. Și cel mai important, PCR nu poate înlocui intuiția și gândirea analitică pe care trebuie să le aibă un medic care se așteaptă la succes.

P . S . Cercetare biologică moleculară - schimbarea ghidurilor pentru diagnostic și tratament. Utilizarea metodelor biologice moleculare este asociată cu perspectiva unei schimbări radicale a accentului în diagnosticul de laborator. Poate că nu este vorba doar despre informații oportune, ci despre primirea lor în avans. Dacă acum, în majoritatea cazurilor, testele de laborator sunt efectuate deja când boala s-a dezvoltat și tratamentul a început, atunci informațiile de laborator de biologie moleculară sunt de așteptat să permită identificarea înclinației unei persoane către anumite tipuri de patologie și a gradului de sensibilitate la anumite medicamente. , care va justifica natura predictivă, preventivă și personalizată a viitoarei medicini.

SCHIMBAREA ORIENTĂRILOR DE DIAGNOSTIC ȘI TRATAMENT

BOLI EREDITARE

Astăzi În viitor

Diagnostic Pașaport genetic

8. De câte săli de lucru sunt necesare pentru a funcționa un laborator PCR cu detecție fluorescentă (analiza cantitativă, PCR în timp real)?

9. Ce este detectarea?

10. Ce metode de diagnosticare ADN există?

11. Lucrarea cărei enzime stă la baza PCR?

12. De ce trebuie îndepărtată zona de detectare din alte zone de lucru?

13. Ce este un site de restricții?

14. Care sunt diferențele dintre metodele de diagnostic ADN direct și indirect?

15. Ce este secvențierea?

16. Ce este PCR multiplex?

17. Ce tipuri de mutații sunt determinate folosind PCR?

18. Ce este contaminarea?

19. Care este esența metodei de amplificare specifică alelelor?

20. Condiții de depozitare pentru materialul PCR?

21. În ce dispozitiv are loc amplificarea?

22. Ce este metoda PCR cu revers transcriptază (RT-PCR)?

23. Ce servește ca material pentru diagnosticarea PCR?

24. Enumerați tipurile de contaminare?

Teste pentru auto-pregătire

1. Enzime de restricție a endonucleazei:

a) enzime care „rup” ADN-ul în locuri strict specifice;

b) enzimele care unesc între ele rupturi în molecula de ADN;

c) enzime care furnizează compuși care efectuează repararea ADN-ului.

2. Amplificarea genelor:

3. Ce metodă de genetică moleculară este utilizată pentru a diagnostica bolile cauzate de o genă mutantă dintr-o secvență cunoscută?

a) utilizarea unei enzime de restricție specifice;

b) detecție directă folosind sonde moleculare specifice;

c) analiza de familie a distribuției polimorfismelor de lungime a fragmentelor de restricție normale.

4. Secvențierea ADN:

a) identificarea secvenței de baze ADN;

b) repetiții multiple ale oricărei secțiuni ADN;

c) izolarea unui fragment de ADN care conţine gena studiată.

5. Pentru a obține probe de ADN puteți utiliza :

b) vilozităţi coriale;

c) lichid amniotic;

d) celulele lichidului amniotic;

e) probe de biopsie de piele, mușchi, ficat,

e) totul este corect, cu excepția punctului „c”,

g) totul este corect, cu excepția punctului „d”,

h) toate cele de mai sus sunt adevărate.

6. Pentru a diagnostica ce mutații este utilizată metoda PCR:

a) genomic;

b) cromozomiale;

c) gena (punctul).

7. Grundul este:

a) secțiune complementară a ADN-ului;

b) o secvenţă de oligonucleotidă sintetică marcată (radioactiv sau fluorescent) complementară unei gene mutante sau normale;

c) o oligonucleotidă care acționează ca „amors” și inițiază sinteza unui lanț polinucleotidic pe o matrice ADN sau ARN.

8. Cine a dezvoltat principiul metodei PCR?

b) K. Mullis

9. Este metoda PCR utilizată pentru a diagnostica expansiunea repetărilor trinucleotidelor (un tip dinamic de mutație)?

10. În ce domenii se utilizează PCR?

a) medicina clinica;

b) determinarea organismelor transgenice (OMG)

c) identificare personală, stabilire a paternității, criminalistică

d) toate cele de mai sus,

e) niciuna dintre cele de mai sus..

Exemple de răspunsuri: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – în; 7 – în; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Principal

1.Genetica Bochkov. Moscova. GEOTAR, 2002.

Adiţional

1. , Bakharev și tratamentul bolilor congenitale și ereditare la copii. – Moscova, 2004.

2. Diagnosticare ADN și consiliere genetică medicală. – Moscova, 2004.

3. Genetica Ginter. – Moscova, 2003.

4. Fundamentele Gorbunov ale geneticii medicale. – Sankt Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Diagnosticul clinic molecular. – Lumea, 1999.

6. Menshikov - cercetare biologică în diagnosticul clinic de laborator: posibilitățile problemei (prelegeri). Diagnosticare clinică de laborator, nr. 3, 2006.

7. Munca lui Kornienko în laboratorul PCR în timpul analizei în linie a materialului biologic. Diagnosticare clinică de laborator, nr. 10, 2006.

8. Organizarea lucrului de laborator PCR. Instrucțiuni metodice. MU 1.3.1794-03. Medicul șef sanitar al Federației Ruse, 2003.

9. Tehnologia Erlich H. A. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time cantitative PCR. Genom Res. – Nr. 6, 1996.

PRINCIPIILE DE BAZĂ ALE METODEI

REACȚIA LANȚULUI POLIMERAZEI

Manual metodologic de lucru extracurricular al elevilor de 3-4 ani la specialitățile de medicină generală (060101) și pediatrie (060103).

Instituția de Învățământ de Stat de Învățământ Profesional Superior „Academia Medicală de Stat Krasnoyarsk a Agenției Federale pentru Sănătate și Dezvoltare Socială”

Rusia, Krasnoyarsk,

Principiile diagnosticului PCR

ABSTRACT

secțiuni, 34 de pagini, 5 figuri, 5 referințe

Scopul acestei lucrări este un scurt rezumat al principiilor de bază și al caracteristicilor tehnologice ale metodei PCR, aplicarea sa științifică și practică în diagnosticul bolilor infecțioase.

LISTA ABREVIERILOR CONVENȚIONALE

HCV - virusul hepatitei C

dATP - deoxiadenozin trifosfat

dGTP - deoxiguanozin trifosfat

dNTP - deoxinucleotid trifosfat

dTTP - trifosfat de deoxitimidină

dCTP - deoxicitozin trifosfat

ADN - acid dezoxiribonucleic

PCR - reacție în lanț a polimerazei

ARN - acid ribonucleic - clasa de imunoglobuline GTime PCR - metoda PCR în timp real

INTRODUCERE

PRINCIPIUL METODEI PCR

ETAPE ALE ANALIZEI PCR

METODA PCR ÎN TIMP REAL

AVANTAJELE METODEI PCR

LIMITĂRI ALE METODEI PCR

APLICAREA METODEI PCR

CONCLUZIE

LISTA REFERINȚELOR UTILIZATE

INTRODUCERE

Descoperirea metodei reacției în lanț a polimerazei (PCR) a devenit una dintre cele mai remarcabile evoluții în domeniul biologiei moleculare din ultimele decenii. Acest lucru a făcut posibilă ridicarea diagnosticului medical la un nivel calitativ nou. Principiul metodei reacției în lanț a polimerazei a fost dezvoltat de Carrie Mullis în 1983. Pentru dezvoltarea analizei PCR, K. Mullis a primit Premiul Nobel pentru Chimie în 1993.

După descoperirea PCR, acesta a fost foarte rapid introdus în practică. Metoda a devenit atât de populară încât astăzi este dificil să ne imaginăm lucrul în domeniul biologiei moleculare fără utilizarea ei. Metoda PCR a primit o dezvoltare deosebit de rapidă datorită programului internațional Genomul uman. Au fost create tehnologii moderne de secvențiere cu laser (decodificarea secvențelor de nucleotide ADN). Dacă în trecutul recent a fost nevoie de o săptămână pentru a descifra o secvență de ADN de 250 de perechi de nucleotide (bp), secvențiatoarele laser moderne pot determina până la 5000 bp. într-o zi. Aceasta, la rândul său, contribuie la creșterea semnificativă a bazelor de date de informații care conțin secvențe ADN. În prezent, au fost propuse diverse modificări ale PCR, s-a demonstrat posibilitatea creării de sisteme de testare pentru detectarea microorganismelor și identificarea mutațiilor punctuale și au fost descrise zeci de posibile aplicații ale metodei.

Apariția metodei PCR s-a datorat anumitor realizări în domeniul geneticii moleculare, în primul rând decodificarea secvenței de nucleotide a genomurilor unui număr de microorganisme. De menționat că această descoperire a fost însoțită de dezvoltarea anumitor tehnologii. În special, apariția dispozitivelor care fac posibilă sintetizarea automată a fragmentelor de ADN monocatenar (oligonucleotide). În aceeași perioadă, au fost descoperite microorganisme unice care trăiesc în gheizere. Sistemul lor enzimatic, în special ADN polimeraza, rezistă la temperaturile ridicate ale izvoarelor termale și își păstrează activitatea biologică până la 95 ° C, ceea ce este o condiție necesară pentru desfășurarea reacției în lanț a polimerazei.

Reacția în lanț a polimerazei este în prezent cea mai avansată metodă de diagnostic de biologie moleculară, genetică moleculară și diagnosticare clinică de laborator, permițând identificarea celulelor individuale ale agenților patogeni ai multor boli infecțioase în țesuturile și fluidele biologice ale corpului.

Metoda PCR se bazează pe completarea complementară a unei secțiuni de ADN sau ARN genomic a agentului patogen, efectuată in vitro folosind enzima ADN polimeraza termostabilă. Specificitatea metodei este determinată de unicitatea materialului genetic al agenților infecțioși detectați, la care sunt selectați primerii oligonucleotidici implicați în procesul de amplificare.

Diagnosticul bolilor infecțioase, inclusiv cele cauzate de agenți greu de cultivat, genotiparea microorganismelor, evaluarea virulenței acestora, determinarea rezistenței microflorei la antibiotice, diagnosticul prenatal, monitorizarea biologică a produselor din sânge - aceasta este o listă incompletă a domeniilor medicinei folosind PCR. Astăzi, analiza PCR rămâne cea mai răspândită și în dezvoltare dinamică tehnologie. În fiecare an apar pe piață zeci de noi sisteme de testare pentru analiza PCR, concepute atât pentru a identifica secvențele de nucleotide ale diferitelor microorganisme care provoacă boli, cât și pentru a studia genele umane. Costul analizei PCR este în scădere constantă, ceea ce contribuie la utilizarea tot mai răspândită a metodei în instituțiile medicale și de diagnostic. Numărul laboratoarelor PCR din țările CSI crește exponențial și, se pare, în viitorul apropiat analiza PCR va deveni una dintre cele mai comune metode de diagnostic de laborator.

1. PRINCIPIUL METODEI PCR

Reacția în lanț a polimerazei este o metodă care imită replicarea naturală a ADN-ului și permite detectarea unei singure molecule specifice de ADN în prezența a milioane de alte molecule.

Esența metodei este de a copia (amplifica) în mod repetat anumite secțiuni de ADN într-o eprubetă în timpul ciclurilor repetate de temperatură. La fiecare ciclu de amplificare, fragmentele sintetizate anterior sunt din nou copiate de ADN polimeraza. Datorită acestui fapt, există o creștere multiplă a numărului de fragmente specifice de ADN, ceea ce simplifică foarte mult analiza ulterioară.

Metoda PCR se bazează pe un proces natural - completarea complementară a matricei ADN, realizată folosind enzima ADN polimerază. Această reacție se numește replicare ADN.

Replicarea ADN-ului natural include mai multe etape:

) Denaturarea ADN (desfăşurarea dublei helix, divergenţa catenelor de ADN);

) Formarea de secțiuni scurte de ADN dublu catenar (amorsori necesari pentru inițierea sintezei ADN);

) Sinteza unei noi catene de ADN (completarea complementară a ambelor catene).

Acest proces poate fi folosit pentru a produce copii ale secțiunilor scurte de ADN care sunt specifice unor microorganisme specifice, de exemplu. efectuează o căutare țintită pentru astfel de zone specifice, care este scopul diagnosticului genetic pentru a identifica agenții patogeni ai bolilor infecțioase.

Descoperirea ADN polimerazei termostabile (polimeraza Taq) din bacterii termofile Thermisaquaticus, al cărui optim este în regiunea de 70-72°C, a făcut posibilă ca procesul de replicare a ADN-ului să fie ciclic și să-l folosească pentru lucrul in vitro. Crearea de termostate programabile (amplificatoare), care efectuează schimbări ciclice de temperatură în funcție de un program dat, a creat premisele pentru introducerea pe scară largă a metodei PCR în practica diagnosticului clinic de laborator. Cu repetări multiple ale ciclurilor de sinteză, are loc o creștere exponențială a numărului de copii ale unui anumit fragment de ADN, ceea ce face posibilă obținerea unui număr suficient de copii ADN pentru identificarea lor dintr-o cantitate mică de material analizat, care poate conține celule individuale. a microorganismelor.

Completarea lanțului complementar nu începe în niciun moment al secvenței ADN, ci numai în anumite blocuri de pornire - secțiuni scurte dublu catenare. Prin atașarea unor astfel de blocuri la secțiuni specifice ale ADN-ului, este posibil să dirijați procesul de sinteză a unui nou lanț numai în această secțiune, și nu de-a lungul întregii lungimi a lanțului ADN. Pentru a crea blocuri de pornire în anumite secțiuni de ADN, sunt utilizați doi primeri oligonucleotidici (20 de perechi de nucleotide), numiți primeri. Primerii sunt complementari secvențelor de ADN de pe granițele din stânga și din dreapta ale unui fragment specific și sunt orientați în așa fel încât finalizarea unui nou lanț de ADN are loc doar între ei.

Astfel, PCR este o creștere multiplă a numărului de copii (amplificare) unei regiuni specifice de ADN catalizată de enzima ADN polimeraza.

. ETAPE ALE ANALIZEI PCR

Metoda de analiză prin metoda PCR include trei etape:

1. Izolarea ADN-ului (ARN) dintr-o probă clinică;

2. Amplificarea fragmentelor specifice de ADN;

. Detectarea produselor de amplificare.

. Izolarea ADN-ului (ARN).

În această etapă a analizei, proba clinică este supusă unei prelucrări speciale, în urma căreia materialul celular este lizat, fracțiile proteice și polizaharide sunt îndepărtate și se obține o soluție de ADN sau ARN, lipsită de inhibitori și gata de utilizare. amplificare suplimentară. Alegerea tehnicii de extracție a ADN-ului (ARN) este determinată în principal de natura materialului clinic procesat.

2.Amplificarea fragmentelor specifice de ADN

În această etapă, fragmente scurte de ADN specifice se acumulează în cantitatea necesară pentru detectarea lor ulterioară.

Pentru a efectua o reacție în lanț a polimerazei, în amestecul de reacție trebuie să fie prezenți un număr de componente:

· Grunduri- oligonucleotide sintetizate artificial, cu dimensiuni de obicei cuprinse între 15 și 30 bp, identice cu secțiunile corespunzătoare ale ADN-ului țintă. Ele joacă un rol cheie în formarea produșilor de reacție de amplificare. Primerii selectați corect asigură specificitatea și sensibilitatea sistemului de testare.

· Taq polimeraza- enzimă termostabilă care asigură completarea a 3 - capătul celei de-a doua catene de ADN după principiul complementarității.

· Amestec de trifosfați deoxinucleotidici (dNTPs)- deoxiadenozin trifosfat (dATP), deoxiguanozin trifosfat (dGTP), deoxicitozin trifosfat (dCTP) și deoxitimidin trifosfat (dTTP) - „materialul de construcție” folosit de polimeraza Taq pentru a sintetiza cea de-a doua catenă de ADN.

· tampon -un amestec de cationi și anioni într-o anumită concentrație, oferind condiții optime pentru reacție, precum și o valoare stabilă a pH-ului.

· Probă analizată- un preparat preparat pentru adăugare la amestecul de reacție, care poate conține ADN-ul dorit, de exemplu, ADN-ul microorganismelor, care servește ca țintă pentru copierea repetată ulterioară.

Fig.1 Componentele amestecului de reacție

Fiecare ciclu de amplificare include 3 etape care au loc în diferite condiții de temperatură:

Etapa 1:Denaturarea ADN-ului (desîmpletirea dublei helix). Apare la 93-95°C timp de 30-40 de secunde.

Unul dintre circuite (+) este folosit ca matrice principală. Cele cinci capete ale sale sunt fixate de enzima ADN polimerază, care asigură construirea unei a doua catene de ADN, complementară primei, din nucleotide individuale. Același lucru, doar în direcția opusă, se întâmplă pe a doua catenă de ADN, totuși, deoarece desfășurarea moleculei de ADN are loc în ordine inversă, noua catenă este construită în fragmente mici, care sunt apoi cusute împreună. Pentru ca enzima ADN polimerază să își înceapă activitatea, este necesară prezența unei semințe sau a unui primer - un mic fragment de ADN monocatenar, care, atunci când este conectat la regiunea complementară a uneia dintre catenele de ADN părinte, formează un bloc de pornire. pentru creșterea șuviței fiice.

Etapa 2:Atașarea primerilor (recoacere). Atașarea primerilor are loc complementar cu secvențele corespunzătoare pe catenele de ADN opuse la granițele unei regiuni specifice. Fiecare pereche de grunduri are propria sa temperatură de recoacere, ale cărei valori sunt în intervalul 50-65°C. Temperatura de recoacere a primerului calculată cu precizie și verificată experimental este una dintre caracteristicile care determină specificitatea reacției, excluzând atașarea primerilor la secvențe incomplet complementare.

Deoarece creșterea catenelor de ADN fiice poate avea loc simultan pe ambele catene ale ADN-ului matern, ADN polimeraza de pe cea de-a doua catenă necesită, de asemenea, propriul său primer. Astfel, la amestecul de reacție se adaugă doi primeri. De fapt, primerii, care s-au atașat la catenele opuse ale moleculei de ADN, limitează partea din aceasta care va fi ulterior duplicată sau amplificată de multe ori. Astfel de fragmente de ADN sunt numite ampliconi. Lungimea unui amplicon poate fi de câteva sute de nucleotide. Schimbând o pereche de primeri, putem trece de la analiza unui agent patogen la analiza altuia.

Timp de recoacere -20-60 sec.

Etapa 3:Completarea lanțurilor de ADN (alungire).

Mecanismul de copiere este de așa natură încât adăugarea complementară a catenelor nu poate începe în niciun moment al secvenței ADN, ci numai în anumite blocuri de pornire (secțiuni dublu catenare scurte). Pentru a crea blocuri de pornire în secțiuni date de ADN, se folosesc primeri, care sunt oligonucleotide cu lungimea de aproximativ 20 bp, numite și primeri. Ele sunt complementare cu secvențele de ADN de pe granițele din stânga și din dreapta ale unui fragment specific și sunt orientate în așa fel încât sinteza ADN realizată de ADN polimerază să aibă loc numai între ele.

Completarea complementară a lanțurilor de ADN are loc de la capătul 5’ la capătul 3’ al lanțului în direcții opuse, pornind de la locurile de atașare a primerului. Materialul pentru sinteza noilor lanțuri de ADN este fosfatul dezoxiribonucleotid introdus. Acest proces este catalizat de enzima polimeraza Tag. Noul ADN format în primul ciclu de sinteză servește drept material de pornire pentru al doilea ciclu, în care se formează fragmentul de ADN specific dorit (ampliconul) etc.

Fig.2 Principiul amplificării ADN-ului

În prezent, sunt utilizate mai multe metode pentru a pregăti o probă pentru PCR. Procedura de pregătire a probei include liza microbiană și extracția acidului nucleic. Pentru a distruge celula microbiană, se utilizează fierbere simplă, congelare-dezghețare în prezența lizozimei, precum și soluții tampon de liză speciale care conțin detergenți și proteinază. Alegerea metodei este de obicei dictată de natura microbilor, mai precis, de natura peretelui său celular. Metoda de obținere a unui preparat de ADN pur, descrisă de B.R.Marmionetal, este considerată standard și a devenit deja clasică. (1993). Presupune proteoliza enzimatica urmata de deproteinizarea si precipitarea ADN-ului cu alcool. Această metodă vă permite să obțineți un preparat ADN pur, dar este destul de laborioasă și implică lucrul cu substanțe atât de agresive și cu miros puternic precum fenolul și cloroformul.

Una dintre cele mai populare este metoda de extracție a ADN-ului propusă de R.Boometal. (1990), bazat pe utilizarea unui agent de liză puternic - tiocianat de guanidină (GuSCN) pentru liza celulară și sorbția ulterioară a ADN-ului pe un purtător (mărgele de sticlă, pământ de diatomee, „lapte” de sticlă etc.). După spălare, ADN-ul rămâne în probă, sorbit pe purtător, din care este îndepărtat cu ușurință folosind un tampon de eluție. Metoda este convenabilă, avansată din punct de vedere tehnologic și potrivită pentru pregătirea unei probe pentru amplificare. Cu toate acestea, pierderea ADN-ului este posibilă datorită sorbției ireversibile pe purtător, precum și în timpul numeroaselor spălări. Acest lucru este deosebit de important atunci când lucrați cu cantități mici de ADN dintr-o probă. În plus, chiar și urme de GuSCN pot inhiba PCR, așa că atunci când se utilizează această metodă, alegerea corectă a sorbantului și aderarea atentă la nuanțele tehnologice sunt foarte importante. Trebuie remarcat faptul că, datorită numărului mare de etape de adăugare și îndepărtare a soluțiilor, este necesară atenție la manipularea probei, deoarece este posibilă contaminarea încrucișată între probe și aerosolul ADN rezultat.

Cu procedura clasică de extracție a ADN-ului fenol-cloroform, se realizează o bună purificare a ADN-ului, în primul rând din inhibitorii polimerazei Tag, dar pierderi mari de acid nucleic sunt inevitabile, mai ales vizibile atunci când se lucrează cu probe mici cu o concentrație scăzută de agent infecțios.

Un alt grup de metode de preparare a probelor se bazează pe utilizarea unor schimbătoare de ioni precum Chilex (SUA), care, spre deosebire de sticlă, absorb nu ADN-ul, ci impuritățile care interferează cu reacția. De regulă, această tehnologie include două etape: fierberea probei și sorbția impurităților pe un schimbător de ioni. Metoda este extrem de atractivă datorită simplității sale de execuție. În cele mai multe cazuri, este potrivit pentru lucrul cu material clinic. Din păcate, uneori există mostre cu impurități care nu pot fi îndepărtate folosind schimbătoare de ioni. În plus, unele microorganisme nu pot fi distruse prin fierbere simplă. În aceste cazuri, este necesar să se introducă etape suplimentare de prelucrare a probei.

În timpul screening-ului în masă, când este important să se obțină date statistice, este posibil să se utilizeze metode simple folosind detergenți sau tratarea materialului biologic cu alcalii și apoi neutralizarea acestora. În același timp, utilizarea unor astfel de metode pentru diagnosticarea clinică poate duce la rezultate fals negative datorită utilizării unui preparat de ADN de calitate scăzută în amestecul de reacție. Astfel, alegerea metodei de preparare a probei ar trebui luată în considerare cu o înțelegere a scopurilor analizei intenționate.

În cadrul următoarei proceduri - amplificare - o probă care conține ADN-ul agentului patogen este introdusă într-o eprubetă mică cu componente care asigură reacția polimerazei, două tipuri de primeri, două enzime (Tag polimeraza și N-uracil glicolaza) și patru tipuri de nucleotide A, G, Ts, U. Pentru a efectua reacția polimerazei, se folosește un dispozitiv special (termociclor sau amplificator ADN), care vă permite să schimbați automat temperatura amestecului de reacție conform unui anumit program. În prima rundă de PCR, proba este încălzită la o temperatură de 94°C pentru a separa cele două catene complementare de ADN. Temperatura scade apoi la 40-60°C, moment în care primerii sunt atașați la o singură catenă de ADN, după care temperatura crește din nou la 72°C, când activitatea polimerazei este cea mai pronunțată. Întregul ciclu cu schimbări de temperatură durează mai puțin de 3 minute.

Pentru a evalua corect rezultatele PCR, este important să înțelegem că această metodă nu este cantitativă. Teoretic, produșii de amplificare ai moleculelor de ADN țintă unică pot fi detectați folosind electroforeză după 30-35 de cicluri. Cu toate acestea, în practică, acest lucru se face numai în cazurile în care reacția are loc în condiții apropiate de ideale, ceea ce este rar. Gradul de puritate al preparatului de ADN are o influență deosebit de mare asupra eficienței amplificării, adică prezența în amestecul de reacție a anumitor inhibitori, de care în unele cazuri poate fi extrem de greu de scăpat. Uneori, din cauza prezenței lor, chiar și zeci de mii de molecule de ADN țintă nu pot fi amplificate. Astfel, adesea nu există o relație directă între cantitatea inițială de ADN țintă și cantitatea finală de produse de amplificare.

Sunt utilizate diferite metode pentru a vizualiza rezultatele amplificarii. Cea mai comună astăzi este electroforeza, bazată pe separarea moleculelor de ADN după mărime. Pentru a face acest lucru, pregătiți o placă de gel de agaroză, care este solidificată cu agaroză după topirea într-un tampon de electroforeză la o concentrație de 1,5-2,5% cu adăugarea unui colorant special de ADN, de exemplu bromură de etidio. Agaroza solidificată formează o rețea spațială. La turnarea folosind piepteni, în gel se formează godeuri speciale, în care se adaugă ulterior produse de amplificare. Placa de gel este plasată într-un aparat de electroforeză pe gel orizontal și este conectată o sursă de tensiune constantă. ADN-ul încărcat negativ începe să se miște în gel de la minus la plus. În acest caz, moleculele de ADN mai scurte se mișcă mai repede decât cele mai lungi. Viteza de mișcare a ADN-ului în gel este influențată de concentrația de agaroză, puterea câmpului electric, temperatură, compoziția tamponului de electroforeză și, într-o măsură mai mică, compoziția ADN-ului. Toate moleculele de aceeași dimensiune se mișcă cu aceeași viteză. Colorantul este încorporat (intercalat) de către grupări plane în moleculele de ADN. După terminarea electroforezei, care durează de la 10 minute la 1 oră, gelul este plasat pe un filtru transiluminator care emite lumină în domeniul ultraviolet (254 - 310 nm). Energia ultravioletă absorbită de ADN la 260 nm este transferată colorantului, făcându-l să fluoresce în regiunea portocalie-roșu a spectrului vizibil (590 nm).

Standardul ADN al microorganismului dorit este folosit ca „control pozitiv”. Mărimea ampliconilor nespecifici poate fi fie mai mare, fie mai mică în comparație cu „controlul pozitiv”. În cel mai rău caz, aceste dimensiuni pot coincide și sunt citite ca pozitive în electroforeză.

„Control pozitiv” vă permite să vă asigurați că toate componentele incluse în amestecul de reacție asigură progresul normal al reacției. În același timp, un preparat ADN preparat pentru PCR din material biologic poate conține impurități de inhibitori, care reduc semnificativ eficiența reacției și, în unele cazuri, conduc la absența ampliconilor specifici chiar și în prezența agentului patogen dorit. Este necesar să se monitorizeze progresul amplificării în fiecare eprubetă cu amestecul de reacție, pentru care se folosește un așa-numit „control intern” suplimentar, care este orice standard ADN care este diferit de ADN-ul microorganismului dorit.

Pentru sistemele de testare infecțioasă, uneori, de exemplu, se folosește gena p-globină, în scopul căreia, folosind manipulări de inginerie genetică, sunt cusute secțiuni de ADN omoloage primerilor incluși în sistemul de testare. Dacă se adaugă un „control intern” la amestecul de reacție, acesta va deveni aceeași țintă pentru recoacere primer ca ADN-ul cromozomial al agentului infecțios dorit. Mărimea produsului de amplificare de control intern este selectată astfel încât să fie de 2 sau mai multe ori mai mare decât ampliconii formați din amplificarea ADN-ului microorganismului dorit. Ca urmare, dacă la amestecul de reacție se adaugă ADN „control intern” împreună cu proba de testat, atunci, indiferent de prezența unui microorganism în proba biologică, „controlul intern” va provoca formarea de ampliconi specifici, dar semnificativ mai lung (mai greu) decât ampliconul microorganismului. Prezența ampliconilor grei în amestecul de reacție indică progresul normal al reacției de amplificare și absența inhibitorilor. Dacă nu se formează ampliconi de dimensiunea necesară și „control intern”, putem concluziona că există impurități nedorite în proba analizată care ar trebui eliminate, dar nu despre absența ADN-ului dorit.

În ciuda tuturor atractivității acestei abordări, are un defect semnificativ. Astfel, dacă ADN-ul dorit este prezent în amestecul de reacție, atunci eficiența amplificării sale scade brusc din cauza competiției cu „controlul intern” pentru primeri. Acest lucru este esențial important la concentrații scăzute de ADN din proba de testat și poate duce la rezultate fals negative. Cu toate acestea, cu condiția ca problema competiției pentru primeri să fie rezolvată, această metodă de monitorizare a eficienței amplificării va fi cu siguranță foarte utilă.

Fig. 3 Al doilea ciclu de amplificare a ADN-ului

. Detectarea produselor de amplificare

). Metoda electroforezei orizontale

Una dintre metodele de vizualizare a rezultatelor amplificării este metoda electroforezei, bazată pe separarea moleculelor de ADN după mărime. În majoritatea metodelor, în această etapă, amestecul de produși de amplificare obținut în etapa a 2-a este separat prin electroforeză orizontală într-un gel de agaroză. Înainte de separarea electroforetică, la amestecul de amplificare se adaugă o soluție de bromură de etidio, care formează compuși interstițiali puternici cu fragmente de ADN dublu catenar. Acești compuși sunt capabili să fluoresceze sub iradierea UV, care este înregistrată sub formă de benzi luminoase după separarea electroforetică a amestecului de amplificare într-un gel de agaroză. Luminozitatea benzilor de produs de amplificare poate varia. Prin urmare, este adesea obișnuit în laboratoarele PCR să evalueze rezultatul folosind un sistem cu trei, patru sau cinci puncte. Cu toate acestea, nu poate fi asociat cu cantitatea inițială de ADN țintă din probă. Adesea, o scădere a luminozității benzilor este asociată cu o scădere a eficienței de amplificare sub influența inhibitorilor sau a altor factori.

Fig.4 Detectarea produselor de amplificare prin electroforeză orizontală

). Metoda electroforezei verticale

Metoda electroforezei verticale este fundamental similară cu electroforeza orizontală. Diferența lor este că în acest caz se folosește poliacrilamidă în loc de agaroză. Se efectuează într-o cameră specială pentru electroforeză verticală. Electroforeza pe gel de poliacrilamidă are o rezoluție mai mare în comparație cu electroforeza cu agaroză și permite distingerea moleculelor de ADN de diferite dimensiuni cu o precizie de o nucleotidă. Prepararea gelului de poliacrilamidă este ceva mai complicată decât gelul de agaroză. În plus, acrilamida este o substanță toxică. Deoarece necesitatea de a determina dimensiunea unui produs de amplificare cu o precizie de 1 nucleotidă apare rar, această metodă nu este utilizată în munca de rutină.

3). Metoda sondei de hibridizare

Ca alternativă la metoda de detectare electroforetică, care prezintă unele dezavantaje: subiectivitate în citirea rezultatelor, limitări în determinarea ADN-ului diferitelor microorganisme într-o singură reacție, pot fi propuse scheme de detecție prin hibridizare. În aceste scheme, fragmentul de ADN format ca urmare a amplificării se hibridizează (formează complexe cu 2 catene - „hibrizi”) cu o sondă oligonucleotidă specifică. Înregistrarea unor astfel de complexe poate fi efectuată colorimetric sau fluorimetric.

3. METODA PCR ÎN TIMP REAL (PCR în timp real)

Metoda Real-Time PCR face posibilă detectarea produselor de amplificare în timpul reacției și monitorizarea cineticii acumulării ampliconilor. Pentru a detecta un produs PCR, se folosesc coloranți fluorescenți care asigură fluorescență direct proporțională cu cantitatea de produs PCR - fluorescență reporter. Mecanismele pentru generarea acestuia variază în funcție de tipul specific de PCR în timp real.

Curba cinetică din coordonatele „Nivel de fluorescență reporter - ciclu de amplificare” are o formă de S.

Poate fi împărțit în trei etape:

1.Etapa de inițiere (când produsele PCR nu sunt încă detectate de o etichetă fluorescentă).

2.Etapă exponențială (în care există o dependență exponențială a cantității de fluorescență de ciclul PCR).

.Podiș (etapa de saturație).

Fig.5 Graficul curbei cinetice de fluorescență folosind PCR în timp real

Înregistrarea semnalului fluorescent se efectuează în timpul procesului de amplificare pe un dispozitiv special - un termociclor pentru PCR în timp real. Pe baza creșterii intensității semnalului fluorescent, concentrația șablonului ADN inițial este calculată folosind software-ul furnizat cu amplificatorul.

Avantajele metodei PCR în timp real

n capacitatea de a detecta acumularea produselor de amplificare direct în timpul amplificării;

n avantajul fundamental este capacitatea de a detecta acumularea de ampliconi fără deschiderea tubului, ceea ce minimizează riscul rezultatelor fals pozitive din cauza contaminării probelor și reactivilor cu produse de amplificare;

n o reducere semnificativă a numărului de manipulări cu proba de testare reduce timpul, simplifică analiza și reduce probabilitatea erorilor;

n Această abordare face posibilă eliminarea etapei de electroforeză, ceea ce duce la o scădere bruscă a probabilității de contaminare a probelor de testat cu produse de amplificare;

n reducerea cerințelor pentru laboratoarele PCR;

n creșterea obiectivității interpretării rezultatelor unui studiu PCR, deoarece prelucrarea se realizează folosind software-ul dispozitivului;

n Timpul total de cercetare este semnificativ, aproape la jumătate, permițând obținerea rezultatelor în 1,5 - 2 ore de la sosirea materialului clinic în laborator;

n Această metodă permite pentru prima dată cuantificarea conținutului de ADN al unui microorganism dintr-o probă clinică;

n utilizarea sondelor de hibridizare împreună cu primeri mărește specificitatea analizei;

n posibilitatea înregistrării simultane independente a semnalului fluorescent de la mai multe sonde ADN de hibridizare permite identificarea într-un singur studiu a mai multor regiuni diferite ale acelorași ținte ADN sau diferite.

. AVANTAJELE METODEI PCR

n Identificarea directă a agenților patogeni ai bolilor infecțioase

Metoda PCR oferă o indicație directă a prezenței unui fragment specific de ADN al agentului patogen în materialul prelevat de la pacient.

n Specificitate ridicată a PCR

Folosind metoda PCR, un fragment de ADN este izolat în materialul studiat, care este unic pentru un anumit agent patogen - o bacterie sau un virus. Această secțiune ADN este unică și nu tipică pentru nicio infecție de pe pământ. Specificitatea este determinată de secvența de nucleotide a primerilor, ceea ce elimină posibilitatea de a obține rezultate false, spre deosebire de metoda testului imunosorbent legat de enzime, unde erorile datorate antigenelor cu reacție încrucișată sunt frecvente.

n PCR de înaltă sensibilitate

Metoda PCR vă permite să detectați chiar și celule individuale de bacterii sau viruși. Diagnosticul PCR detectează prezența agenților patogeni ai bolilor infecțioase în cazurile în care acest lucru nu se poate face prin alte metode (imunologice, bacteriologice, microscopice). Sensibilitatea analizei PCR este de 10-1000 celule per probă (sensibilitatea testelor imunologice și microscopice este de 103-105 celule).

n Versatilitatea PCR

Deoarece agentul patogen poate fi conținut în orice secreții și țesuturi biologice, cercetarea PCR poate folosi aproape orice materiale, inclusiv cele inaccesibile pentru cercetare prin alte metode - mucus, urină, sânge, ser, spută, ejaculat, răzuire a celulelor epiteliale.

n Viteză mare de obținere a rezultatelor analizei PCR

Analiza PCR nu necesită izolarea și creșterea unei culturi a agentului patogen, ceea ce necesită mult timp. O metodă unificată pentru procesarea biomaterialului și detectarea produselor de reacție și automatizarea procesului de amplificare fac posibilă efectuarea unei analize complete în 4-4,5 ore.

n Abilitatea de a diagnostica orice tip de infecție

Sensibilitatea ridicată a metodei PCR face posibilă diagnosticarea infecției nu numai în stadiul acut al bolii, ci și a infecțiilor cronice și chiar a prezenței unei singure bacterii sau viruși.

În prezent, avantajul analizei PCR față de metoda de cultură pentru detectarea microorganismelor este următorul:

O frecvență mai mare de detectare a microbilor, depășind același indicator la utilizarea metodei de cultură cu 6-7%. Aceste diferențe sunt explicate prin posibila moarte a microbilor în timpul depozitării și transportului, în timp ce PCR este capabilă să detecteze forme neviabile ale microorganismului.

Timpul necesar pentru detectarea unui agent patogen prin metoda culturii este de aproximativ 4 zile, în timp ce utilizarea PCR permite detectarea microbilor în 4-5 ore.

Utilizarea tehnologiei PCR permite detectarea agenților patogeni, cum ar fi chlamydia, în probe prelevate neinvaziv, cum ar fi urina.

Metoda PCR este eficientă în special pentru diagnosticarea formelor de microorganisme greu de cultivat, necultivabile și persistente, care sunt adesea întâlnite în infecțiile latente și cronice, deoarece această metodă evită dificultățile asociate cu creșterea unor astfel de microorganisme în condiții de laborator.

n Posibilitate de realizare monitorizarea și evaluarea eficacității terapiei, în special pentru bolile virale.

n Posibilitate de detectare subtipuri și tulpini individuale de viruși și bacterii.

n Posibilitate de definire mai multe tipuri de agenți patogeni (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) dintr-un tub cu material biologic.

Această metodă este comparabilă ca intensitate a travaliului cu metodele clasice (imunotest enzimatic, imunofluorescență etc.), dar oferă informații de diagnostic mai fiabile, permițând detectarea directă a ADN-ului sau ARN-ului unui agent infecțios în materialul clinic. Prin urmare, metoda PCR, împreună cu metoda culturii, este recunoscută drept „standardul de aur” pentru diagnosticarea bolilor infecțioase.

5. LIMITĂRI ALE METODEI PCR

· În timpul reacției, ADN-ul microorganismelor vii și moarte este amplificat

· Posibilitatea de reacție încrucișată

Selecția primerilor se bazează pe cunoștințele existente despre genomul unui anumit microorganisme și al unor microorganisme similare. Teoretic, există posibilitatea ca același fragment să fie prezent și în alte microorganisme al căror genom nu a fost în prezent descifrat și care nu au fost testate pentru posibilitatea reacției încrucișate. Prezența unor astfel de microorganisme în probă poate duce la un rezultat fals pozitiv al testului.

· Variabilitatea microorganismelor

Deși la construirea unui sistem de testare, fragmentul de genom utilizat pentru amplificare este selectat dintr-o regiune foarte conservată, variabilitatea microorganismelor poate duce la faptul că unele genotipuri sau tulpini ale agentului patogen studiat pot dobândi mutații în regiunea amplificată a genomului. , și astfel devin evaziv pentru acest sistem de testare.

Ultimele două puncte sunt importante pentru dezvoltatorii de truse de diagnosticare PCR. Au fost dezvoltate standarde pentru a reglementa cantitatea de testare (inclusiv testarea reacțiilor încrucișate, precum și testarea tulpinilor cunoscute ale agentului patogen detectat) pe care trebuie să le supună un sistem de testare înainte de a ajunge pe piață.

6. APLICAREA METODEI PCR

diagnosticarea polimerazei boli infecțioase

PCR este utilizat în multe domenii pentru analize și experimente științifice:

1. criminalistica

PCR este folosită pentru a compara așa-numitele „amprente genetice”. Este necesară o mostră de material genetic de la locul crimei - sânge, salivă, material seminal, păr etc. Aceasta este comparată cu materialul genetic al suspectului. O cantitate foarte mică de ADN este suficientă, teoretic o copie. ADN-ul este descompus în fragmente și apoi amplificat folosind PCR. Fragmentele sunt separate folosind electroforeza ADN. Modelul rezultat al aranjamentului benzilor ADN se numește amprentă genetică.

2. stabilirea paternităţii

La analiza rezultatelor electroforezei fragmentelor de ADN amplificate folosind PCR tată-copil-mamă, se descoperă că copilul va moșteni unele caracteristici ale amprentei genetice a ambilor părinți, ceea ce conferă o amprentă unică. Deși amprentele genetice sunt unice (cu excepția cazului gemenilor identici), relațiile de familie pot fi încă stabilite prin luarea mai multor amprente. Aceeași metodă poate fi aplicată, ușor modificată, pentru a stabili relația evolutivă între organisme.

3. diagnostice medicale

PCR face posibilă accelerarea semnificativă și facilitarea diagnosticului bolilor ereditare și virale. Gena de interes este amplificată prin PCR utilizând primeri adecvați și apoi secvențiată pentru a identifica mutațiile. Infecțiile virale pot fi detectate imediat după infecție, cu săptămâni sau luni înainte de apariția simptomelor.

4. clonarea genelor

Clonarea genelor este procesul de izolare a genelor și, ca urmare a manipulărilor de inginerie genetică, obținerea unei cantități mari de produs al unei anumite gene. PCR este folosită pentru a amplifica o genă, care este apoi inserată într-un vector - o bucată de ADN care transferă o genă străină în același organism sau în alt organism convenabil pentru creștere. De exemplu, plasmidele sau ADN-ul viral sunt utilizate ca vectori. Inserarea genelor într-un organism străin este de obicei folosită pentru a produce produsul acelei gene - ARN sau, cel mai adesea, o proteină. În acest fel, multe proteine ​​sunt obținute în cantități industriale pentru utilizare în agricultură, medicină etc.

5. Secvențierea ADN-ului

În metoda de secvențiere care utilizează dideoxinucleotide marcate cu o etichetă fluorescentă sau cu izotop radioactiv, PCR este o parte integrantă, deoarece în timpul polimerizării derivații de nucleotide marcate cu o etichetă fluorescentă sau radioactivă sunt inserate în lanțul de ADN. Aceasta oprește reacția, permițând ca pozițiile nucleotidelor specifice să fie determinate după ce lanțurile sintetizate sunt separate în gel.

6. mutageneza

În prezent, PCR a devenit principala metodă de efectuare a mutagenezei (modificarea secvenței de nucleotide a ADN-ului). Utilizarea PCR a făcut posibilă simplificarea și accelerarea procedurii de mutageneză, precum și să o facă mai fiabilă și reproductibilă.

7. diagnosticul bolilor infecţioase

Utilizarea metodei PCR pentru diagnosticarea bolilor infecțioase atât de natură bacteriană, cât și virală este de o importanță enormă pentru rezolvarea multor probleme de microbiologie și epidemiologie. Utilizarea acestei metode contribuie și la dezvoltarea cercetării de bază în domeniul studierii bolilor infecțioase cronice și prost înțelese.

8. diagnosticul bolilor virale

Cele mai cuprinzătoare beneficii ale PCR în diagnosticarea bolilor virale pot fi demonstrate luând în considerare procesul infecțios cauzat de virusul hepatitei C (VHC). PCR are o valoare deosebită de diagnostic pentru detectarea acestui virus din următoarele motive:

) lipsa unei metode de cultivare a VHC; 2) trusele de diagnostic antigen nu există; 3) reacția de formare a anticorpilor la HCV este atât de lentă încât diagnosticul în timpul fazei acute a infecției, de regulă, nu poate fi pus.

Prin urmare, utilizarea tehnologiei PCR pentru diagnostic, controlul calității tratamentului și analiza epidemiologică a morbidității cauzate de VHC devine acum general acceptată.

În același timp, doar tehnologia PCR permite rezolvarea următoarelor probleme: 1) diagnosticarea infecției acute cu depistarea tardivă a anticorpilor la HCV; 2) efectuarea diagnosticului etiologic al hepatitei cronice C la pacienţii imunosupresivi; 3) evaluarea eficacității terapiei antivirale; 4) detectează viremia la donatorii de sânge cu niveluri normale de aminotransferaze; 5) determinarea posibilei contaminări a produselor sanguine; 6) evaluarea prevalenței VHC.

9. aplicarea PCR în pneumologie și ftiziologie

O cauză comună a pneumoniei atipice și a bronșitei cronice recurente sunt micoplasmele și chlamydia. Diagnosticul acestor agenți patogeni folosind metode tradiționale de microscopie și cultura bacteriană este ineficientă. PCR permite nu numai diagnosticarea chlamydia și micoplasmoza, ci și identificarea speciilor de agent patogen (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Utilizarea metodei PCR poate îmbunătăți semnificativ diagnosticul precoce al tuberculozei. În prezent, truse PCR au fost dezvoltate și au apărut pe piață pentru a determina rezistența micobacteriilor la antibiotice.

10. Aplicarea PCR în practica serviciului de sânge

Examinarea sângelui donatorului pentru hepatită, sifilis, HIV prin metode serologice nu exclude pericolul folosirii sângelui infectat din cauza prezenței unei anumite perioade seronegative pentru aceste boli, care poate dura până la câteva săptămâni din momentul apariției agentului patogen în sânge. Cea mai eficientă metodă de testare a sângelui pentru prezența acestor agenți patogeni este metoda PCR.

11. aplicarea PCR în neonatologie

Un număr de microorganisme pot infecta fătul în timpul sarcinii. Acestea sunt citomegalovirusul, toxoplasma, virusul herpes, virusul rubeolei, micoplasma, chlamydia etc. Utilizarea testelor serologice pentru determinarea acestor infecții la nou-născuți este ineficientă, deoarece formarea sistemului imunitar al copilului are loc pe parcursul mai multor luni, iar prezența unui agentul infectios poate sa nu fie insotit de producerea de anticorpi specifici. Pe de altă parte, anticorpii materni din clasa IgG pot fi prezenți în sângele unui nou-născut mult timp, capabili să pătrundă în bariera placentară. Astfel, prezența IgG specifice la un copil în primele luni de viață nu indică prezența unui agent patogen. Utilizarea analizei PCR crește semnificativ posibilitățile de diagnosticare a infecțiilor neonatale, inclusiv în stadiul intrauterin.

12. aplicarea PCR în practica uroginecologică

Dintre agenții infecțioși care afectează tractul urogenital, recent s-a acordat multă atenție agenților cauzali ai infecțiilor latente și cronice - chlamydia și micoplasma. Bolile cauzate de acești agenți patogeni se caracterizează prin simptome clinice neclare și un curs cronic, ducând adesea la deteriorarea funcțiilor reproductive - avort spontan, infertilitate. Numeroase studii care examinează utilizarea metodei PCR pentru detectarea Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, efectuate în clinici mari din diferite țări, au demonstrat eficiența ridicată a acestei metode. Este recunoscut faptul că din punct de vedere al sensibilității și eficienței, PCR este superioară metodei de cultură, acceptată ca „standard de aur”.

CONCLUZIE

Astfel, tehnologia PCR este un instrument puternic care oferă capacitatea de a studia și diagnostica procesele infecțioase cronice și ecologia agenților patogeni ai bolilor infecțioase. Metoda de diagnostic PCR completează metodele deja existente de diagnostic microbiologic și modifică calitativ metodologia de rezolvare a problemelor aplicate de microbiologie și epidemiologie medicală.

Ținând cont de cele de mai sus, vom formula domenii de cercetare în patologia infecțioasă, în care PCR începe să joace un rol principal.

Diagnosticul afecțiunilor infecțioase cronice cauzate de persistența bacteriilor sau virușilor. Aceasta este cea mai evidentă aplicație a PCR în scopuri de diagnostic.

PCR este cea mai eficientă metodă de identificare și studiere a agenților patogeni care, fiind în stare „necultivată”, sunt capabili să persistă acolo, supraviețuind unor condiții externe nefavorabile.

PCR permite determinarea rezistenței la antibiotice la bacteriile cu creștere lentă și greu de cultivat.

Domeniile promițătoare pentru utilizarea practică a diagnosticului PCR sunt:

· diagnosticul bolilor oncologice;

· diagnosticul de leucemie și limfoame;

· diagnosticul cancerului mamar;

· diagnosticul altor boli maligne;

Diagnosticarea ADN a neoplasmelor benigne și maligne este limitată de o cantitate mică, dar în creștere, de informații despre genele asociate cu aceste boli;

· diagnosticul bolilor genetice.

Diagnosticul bolilor genetice se poate dezvolta numai în urma unor cercetări științifice ample asupra genomului uman. Cu toate acestea, comunitatea medicală a recunoscut deja importanța studierii bazei genetice a bolilor, precum și posibilitatea de a diagnostica și trata o boală înainte de apariția simptomelor acesteia;

· identificare personală: medicină legală, criminologie; transplant de organe și țesuturi; determinarea paternitatii. Experții evaluează această zonă a pieței de diagnosticare ADN ca fiind una dintre cele mai mari și cu cea mai rapidă creștere;

Adesea folosită ca metodă rapidă pentru indicarea și identificarea virușilor.

Această metodă a fost dezvoltată pentru prima dată de K. Mullis (SUA) în 1983. Datorită sensibilității sale ridicate, specificității și ușurinței de implementare, este utilizată pe scară largă în genetică, medicină legală, diagnosticare și alte domenii.

Esența metodei este amplificarea, adică creșterea numărului de copii ale fragmentelor strict definite ale unei molecule de ADN in vitro. Această metodă utilizează un mecanism matriceal și principiul complementarității. Două lanțuri polinucleotidice simple (acizi nucleici) pot fi legate prin legături de hidrogen într-un lanț dublu catenar dacă secvențele de nucleotide ale unuia se potrivesc exact cu secvența de nucleotide ale celuilalt, astfel încât bazele lor azotate să poată forma adenin-timină și guanină-citozină. perechi.

PCR se bazează pe amplificarea ADN-ului folosind o ADN polimerază termostabilă, care sintetizează catene de ADN complementare reciproc, începând cu doi primeri. Un primer este un fragment de ADN format din 20-30 de nucleotide. Acești primeri sunt complementari catenelor de ADN opuse. În timpul sintezei ADN, primerii sunt inserați în lanțul de molecule de ADN nou sintetizate.

De obicei, PCR se efectuează în 25-40 de cicluri. Fiecare ciclu include trei etape: prima este denaturarea la 92-95 °C. În acest caz, cele două catene de ADN diverg; al doilea este recoacere sau adăugare de primeri la 50-65 ° C; a treia este alungirea sau polimerizarea la 68-72 ° C, în timp ce ADN polimeraza realizează completarea complementară a lanțurilor șablon ADN folosind patru tipuri de nucleotide. Ca rezultat al unui ciclu, materialul genetic dorit este dublat. Lanțurile de ADN formate în primul ciclu servesc ca șabloane pentru al doilea ciclu etc. După primul ciclu, doar fragmentul dintre cei doi primeri este amplificat. Astfel, numărul de copii ale regiunii amplificate este dublat, ceea ce face posibilă sintetizarea a milioane (2 n) de fragmente de ADN în 25-40 de cicluri - o cantitate suficientă pentru indicarea lor prin diverse metode (metoda sondelor de hibridizare care conțin o anumită etichetă, electroforeză etc.) . Mai des, electroforeza pe gel de agaroză cu colorare cu bromură de etidio este utilizată în acest scop.

În PCR din secțiunile de ADN ale unui agent patogen, se folosesc primeri care au o secvență unică de nucleotide caracteristică doar unui anumit agent patogen.

Procedura de realizare a PCR se rezumă la următoarele: o matrice ADN este izolată de materialul studiat; într-o eprubetă, ADN-ul izolat este combinat cu un amestec de amplificare, care include ADN polimeraza, toate cele 4 tipuri de nucleotide, 2 tipuri de primeri, MgCl, tampon, apă deionizată și ulei mineral. Apoi tuburile sunt plasate într-un ciclor, iar amplificarea se realizează automat conform unui program dat corespunzător tipului de agent patogen. Rezultatele sunt înregistrate mai des prin electroforeză într-un gel de agaroză 1-2% în prezența bromurii de etidio, care se combină cu fragmente de ADN și se dezvăluie sub formă de benzi luminoase atunci când gelul este iradiat cu raze UV ​​pe un transiluminator. Toate procedurile PCR durează 1-2 zile lucrătoare.

Pentru a crește specificitatea și sensibilitatea PCR se folosesc diverse opțiuni: PCR imbricată; PCR cu „pornire la cald” folosind un strat de parafină sau blocând centrii activi ai polimerazei cu anticorpi monoclonali. În plus, unele companii produc truse de reactivi liofilizați pentru amplificarea ADN-ului, care accelerează procesul PCR și reduc posibilitatea unor rezultate fals pozitive.

O nouă tehnologie, Real-Time PCR, este în prezent introdusă. Caracteristica sa fundamentală este monitorizarea și analiza cantitativă a acumulării produselor de reacție în lanț a polimerazei și înregistrarea și interpretarea automată a rezultatelor obținute. Această metodă nu necesită o etapă de electroforeză, ceea ce reduce cerințele de laborator pentru PCR. PCR în timp real utilizează sonde de oligonucleotide marcate fluorescent pentru a detecta ADN-ul pe măsură ce este amplificat. PCR în timp real permite analiza completă a unei probe în 20-60 de minute și este, teoretic, o modalitate de a detecta chiar și o moleculă de ADN sau ARN într-o probă.

Sistemul de detectare a produsului în reacția în lanț a polimerazei în timp real (monitorizare PCR) vă permite să monitorizați acumularea de ADN amplificat ciclu cu ciclu. Sistemul include, de asemenea, o sondă de oligonucleotidă care este capabilă să se atașeze (hibridizarea) la segmentul intern al ADN-ului țintă. Sonda este marcată la capătul 5′ cu un colorant reporter fluorescent, iar la capătul 3′ cu un colorant blocant (colorant de stingere). Pe măsură ce produsul PCR se acumulează, sonda se hibridizează cu acesta, dar nu apare nicio luminiscență datorită apropierii dintre raportor și blocant. Ca rezultat al copierii secvenței, polimeraza ajunge la capătul 5′ al sondei. Activitatea exonucleazei 5’-3’ a polimerazei detașează eticheta fluorescentă de la capătul 3’ al sondei, eliberând astfel reporterul fluorescent de conexiunea sa cu blocantul de semnal, ceea ce duce la o creștere a fluorescenței. Nivelul de fluorescență este astfel proporțional cu cantitatea de produs de reacție specific. Este important ca rezultatele PCR să fie înregistrate prin prezența fluorescenței în tuburi închise și, astfel, se rezolvă o altă dintre principalele probleme ale acestei metode - problema contaminării cu ampliconi.

Avantajele PCR: viteza de analiză; sensibilitate și specificitate ridicate; cantitatea minimă de material de testat; simplitatea executiei si posibilitatea de automatizare completa.

Datorită faptului că sensibilitatea PCR poate ajunge până la detectarea unei copii a matriței ADN, există un grad ridicat de pericol de a obține rezultate fals pozitive. Prin urmare, atunci când efectuează testarea PCR, un laborator de diagnostic genetic trebuie să respecte cu strictețe cerințele speciale pentru aspect și modul de funcționare.

PCR este una dintre metodele complementare existente în diagnosticul virologic. Această reacție este foarte importantă pentru diagnosticul infecțiilor virale atunci când antigenele virale sau anticorpii specifici virusului nu pot fi detectați și când prezența acidului nucleic viral poate fi singura dovadă de infecție, mai ales în infecțiile latente și mixte.

Dacă găsiți o eroare, evidențiați o bucată de text și faceți clic Ctrl+Enter.

Reacția în lanț a polimerazei este cunoscută de 30 de ani. Este utilizat pe scară largă în multe domenii, de la arheologie la genetică.

Este metoda PCR care ajută la stabilirea paternității, dar este folosită cel mai adesea pentru identificarea diferitelor boli infecțioase din corpul uman.

Cum se efectuează analiza PCR și ce este? Vom încerca să răspundem în detaliu la aceste întrebări.

Analiza PCR - ce este?

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) este o metodă de înaltă precizie de diagnostic genetic molecular care vă permite să identificați diferite boli infecțioase și ereditare la om, atât în ​​stadiul acut, cât și în cel cronic, și cu mult înainte ca boala să se manifeste.

Metoda PCR este absolut specifică și, dacă este efectuată corect, nu poate da un rezultat fals pozitiv. Adică, dacă nu există infecție, atunci analiza nu va arăta niciodată că există. Prin urmare, acum foarte des, pentru a confirma diagnosticul, ei fac suplimentar un test PCR pentru a determina agentul patogen și natura acestuia.

Reacția în lanț a polimerazei (PCR) a fost dezvoltată de Kary Mullis (SUA) în 1983, pentru care a fost distins cu Premiul Nobel pentru Chimie în 1993.

Care este avantajul acestei metode?

Diagnosticarea prin această metodă vă permite să găsiți agentul patogen direct în genă, care este conținută în materialele studiate. Acesta este cel mai precis test pentru infecțiile cu transmitere sexuală, infecțiile ascunse și diferite boli cu transmitere sexuală.

Diferențele dintre diagnosticul PCR și alte metode de cercetare de laborator sunt după cum urmează:

• metoda are ca scop identificarea agentului patogen în sine;
• Diagnosticarea folosind metoda PCR se distinge prin versatilitatea sa: pentru detectarea mai multor agenți patogeni;
• boli, este suficientă o singură probă biologică a pacientului;
• metoda este foarte sensibilă și nu este însoțită de alte reacții încrucișate.

În plus, avantajul diagnosticului PCR este că orice material biologic al pacientului este potrivit pentru analiză: sânge, secreții genitale, urină, material seminal.

Ce infecții poate detecta un frotiu PCR?

Un număr mare de agenți infecțioși pot fi prezenți în organism, inclusiv cei „ascunși” care nu se manifestă mult timp.

Analiza frotiului PCR vă permite să detectați astfel de infecții:

• ureplasmoza organelor genitale;
• candidoza();
• herpes;
• prezența celulelor canceroase;
• evaluează starea hormonală;

Materialul de testat pentru PCR este de obicei spută, saliva, urină și sânge. Înainte de a efectua analiza, trebuie să vă pregătiți cu atenție pentru aceasta, consultand mai întâi un medic.

Sângele pentru PCR este de obicei donat pe stomacul gol. Rezultate bune se arată prin analiză atunci când materialul pentru cercetare este luat din canalul cervical sau din uretră. În acest caz, cel mai bine este să efectuați diagnosticul PCR nu mai târziu de o zi după actul sexual.

Tipuri de PCR

PCR este utilizat în multe domenii pentru testare și experimente științifice. Există diferite metode de analiză:

1. PCR cu transcriere inversă(PCR cu transcriere inversă, RT-PCR) - folosit pentru a amplifica, izola sau identifica o secvență cunoscută dintr-o bibliotecă de ARN.
2. PCR inversat(PCR inversă) - utilizat atunci când este cunoscută doar o mică regiune din secvența dorită. Această metodă este deosebit de utilă atunci când vine vorba de determinarea secvențelor învecinate după ce ADN-ul a fost inserat în genom.
3. PCR imbricat este utilizat pentru a reduce numărul de produse secundare de reacție. Se folosesc două perechi de primeri și se efectuează două reacții secvențiale.
4. PCR asimetric(ing. PCR asimetrică) - se efectuează atunci când este necesară amplificarea predominant a uneia dintre catenele ADN-ului original. Folosit în unele tehnici de analiză de secvențiere și hibridizare.
5. PCR cantitativ(PCR cantitativ, Q-PCR (engleză)) sau PCR în timp real - utilizate pentru a monitoriza direct măsurarea cantității de produs PCR specific în fiecare ciclu de reacție.
6. PCR pas cu pas (Touchdown PCR) - folosind această abordare, influența legării nespecifice a primerului este redusă.
7. PCR specifică grupului(ing. PCR specifică grupului) - PCR pentru secvențe înrudite în cadrul aceleiași specii sau între diferite specii, folosind primeri conservatori pentru aceste secvențe.

Dacă secvența de nucleotide a matriței este parțial cunoscută sau necunoscută deloc, pot fi utilizați primeri degenerați, a căror secvență conține poziții degenerate în care poate fi localizată orice bază. De exemplu, secvența primerului ar putea fi: ...ATH..., unde H este A, T sau C.

Ce materiale biologice sunt studiate?

Diverse medii biologice și fluide umane pot servi drept material pentru cercetarea PCR, în care poate fi detectat ADN bacterian străin sau ADN sau ARN viral:

1. Urină. Poate fi utilizat pentru infecții ale tractului genito-urinar la bărbați și ale organelor urinare la femei (la bărbați, utilizarea urinei ca material înlocuiește răzuirea epitelială).
2. Spută. Este folosit pentru a diagnostica tuberculoza și, mai rar, pentru a diagnostica formele respiratorii de chlamydia și micoplasmoză. Sputa în cantitate de 15-20 ml se colectează într-o sticlă sterilă (de unică folosință).
3. Fluide biologice. Sucul de prostată, pleural, rahidian, lichid amniotic, lichid articular, lavaj bronhoalveolar, saliva se recoltează conform indicațiilor.
4. Razuri epiteliale de la mucoase. Folosit de obicei pentru a diagnostica boli cu transmitere sexuală (BTS), cum ar fi gonoreea, chlamydia, micoplasmoza, ureaplasmoza, trichomonaza, gardnereloza, herpesul și alte infecții care afectează mucoasele.
5. Biopsii. Cel mai adesea, biopsiile stomacului și duodenului sunt folosite pentru a detecta infecția cu Helicobacter pylori.
6. Sânge, plasmă, ser. Folosit pentru analiza PCR a hepatitei B, C, D, G, herpesului, CMV, virusurilor HIV și cercetarea genelor umane.

Cum să te pregătești pentru test?

Fiabilitatea rezultatului PCR depinde direct de transmiterea corectă a materialului pentru examinare. Materialul nu trebuie contaminat, altfel rezultatul studiului nu va fi obiectiv. Cele mai importante recomandări înainte de a face un test PCR includ următoarele cerințe:

1. Urina este colectată dimineața într-un recipient steril.
2. Un test de sânge pentru infecții trebuie făcut dimineața pe stomacul gol.
3. Nu trebuie să fii activ sexual cu o zi înainte de test.

Rezultatul analizei va fi gata la 1,5-2 zile de la procedura în cauză. Există situații în care rezultatul poate fi pregătit în aceeași zi.

Decodificarea analizei OPC

Procesul de interpretare a cercetării prezentate se remarcă prin simplitatea sa. Rezultatele analizei PCR pot fi obținute la 1,5-2 zile de la depunerea materialului. În unele cazuri, rezultatul este gata în prima zi și iată ce pot însemna:

• Rezultat negativ arată că materialul de diagnostic nu conține agentul infecțios dorit.
• PCR pozitivînseamnă că ADN-ul sau ARN-ul agentului patogen este prezent în corpul uman.

În unele cazuri, microorganismele sunt cuantificate. Acest lucru este valabil mai ales pentru bolile cauzate de microorganisme oportuniste. Deoarece aceste bacterii își manifestă efectele negative numai în cantități în exces.

De asemenea, analiza PCR cantitativă este importantă pentru alegerea tacticilor terapeutice și în scopul monitorizării tratamentului infecțiilor virale precum virusurile HIV și hepatite.

Cât de precis este diagnosticul PCR al infecțiilor?

Metoda PCR se caracterizează prin precizie, specificitate și sensibilitate ridicate. Aceasta înseamnă că această analiză este capabilă să:

• determinați cu precizie prezența sau absența infecției;
• indicați exact ce fel de infecție este (specificitate);
• detectează infecția chiar și cu un conținut foarte scăzut de ADN microbian în materialul biologic,
• care a fost testat (sensibilitate).

Analiza PCR: preț și calendar

Prețul unui anumit test va depinde de infecția pentru care veți fi testat. Prețuri și condiții aproximative:

1. STI: 300-500 de ruble, termene – 1 zi;
2. Virusul Epstein-Barr, papilomavirus uman, herpes, citomegalovirus: 300-500 ruble, termeni - 1 zi;
3. Hepatita A, B, C, D, G: analiză calitativă 650 de ruble, analiză cantitativă 2000 de ruble. Termeni – până la 5 zile;
4. Anticorpi împotriva virusului hepatitei C, total (Anti-HCV) – 420 de ruble;
5. Anticorpi împotriva virusului hepatitei C, IgM (IgM anti-HCV) – 420 de ruble;
6. Helicobacter pylori: 300-400 ruble, termene – 1 zi;
7. HIV (anticorpi și antigeni) – 380 de ruble;
8. ARN HIV, de înaltă calitate – 3.500 de ruble;
9. ARN HIV, cantitativ – 11.000 de ruble.

Pentru a economisi bani, puteți alege un pachet de analiză fix. Acest serviciu este oferit de majoritatea clinicilor unde vă puteți testa prin metoda PRC (invitro, onclinic etc.).

Efectuarea analizei PCR (diagnostic PCR) începe cu colectarea materialului pentru examinare de către un ginecolog, urolog sau dermatovenerolog. Calitatea și fiabilitatea rezultatelor obținute ulterior este asigurată de cele mai înalte calificări și experiență vastă a medicilor centrului medical Euromedprestige, care respectă toate regulile necesare pentru efectuarea analizelor PCR: sterilitate completă, utilizarea numai a materialelor de unică folosință.

Materialul colectat din perie se pune într-un recipient cu soluție salină. După colectare, probele trebuie livrate la laboratorul PCR cât mai curând posibil.

Analiza PCR se efectuează în laborator în trei etape:

1. extragerea ADN-ului
2. Amplificarea fragmentelor de ADN
3. Detectarea produselor de amplificare a ADN-ului

Extracția ADN-ului este etapa inițială a diagnosticului PCR, a cărei esență este următoarea: medicul preia material pentru cercetare de la pacient și îl supune unei prelucrări speciale. În timpul procesării, spirala dublă ADN este împărțită în catene individuale. La materialul pacientului se adaugă un lichid special, care dizolvă substanțele organice care interferează cu „puritatea” reacției. Acest lucru elimină lipidele, aminoacizii, peptidele, carbohidrații, proteinele și polizaharidele. Ca rezultat, se formează ADN sau ARN.

Principiul metodei PCR este „construcția” de noi infecții cu ADN sau ARN. Acest lucru nu se poate face fără îndepărtarea materialului celular.

Timpul petrecut pentru extracția ADN-ului depinde de agentul cauzal al infecției și de tipul de material utilizat pentru cercetarea PCR. De exemplu, este nevoie de 1,5-2 ore pentru a pregăti sângele pentru etapa următoare.

0Matrice ( => Analize) Matrice ( => 2) Matrice ( =>.html) 2

Amplificarea ADN-ului

Pentru a efectua următoarea etapă a diagnosticului ADN - amplificarea ADN-ului - medicii folosesc așa-numitele matrici ADN - molecule de ADN ale infecțiilor, pe care va avea loc ulterior „clonarea” ADN-ului. S-a menționat deja că prezența ADN-ului complet al infecției nu este necesară; pentru a efectua această etapă, este suficientă o mică bucată din molecula de ADN, care este caracteristică doar unui anumit microb (infectie).

Baza amplificării ADN-ului și, în consecință, baza întregului principiu al reacției PCR este procesul natural de completare a ADN-ului pentru toate ființele vii - replicarea ADN-ului, care se realizează prin dublarea unui singur lanț de ADN.

Începând cu un singur fragment de ADN, medicul de laborator îl copiază și crește numărul de copii într-un mod de reacție în lanț: după primul ciclu aveți deja 2 fragmente, după al doilea ciclu - 4, după al treilea - 8, după al patrulea - 16, apoi 32 , 64, 128, 256... Cu fiecare ciclu numărul de copii se dublează, iar după douăzeci de cicluri numărul ajunge deja la milioane, iar după treizeci - la miliarde. Ciclul durează câteva minute și se reduce la o anumită schimbare a temperaturii într-un reactor chimic foarte mic. Aici, în soluție, toate componentele necesare sintezei sunt prezente în cantități suficiente, în primul rând, nucleotidele A, G, T și C și, de asemenea, se efectuează operații chimice pregătitoare delicate, astfel încât o copie exactă să fie luată imediat din fiecare segmentul de ADN terminat, apoi din această copie - din nou o copie, aceasta este reacția în lanț ramificat.

Prin atașarea primerilor la lanțul de ADN – „bucăți” de ADN (perechi de nucleotide) sintetizate artificial, similare cu ADN-ul microbilor (infecții) – se formează două elice scurte formate din două catene de secțiuni de ADN, care sunt necesare pentru sinteza viitorului. ADN.

Sinteza unui nou lanț are loc prin completarea fiecăreia dintre cele două catene de ADN. Procesul de amplificare are loc cu ajutorul unei regiuni specifice - ADN polimeraza, care dă denumirea metodei de laborator. Polimeraza acționează ca un catalizator pentru reacție și monitorizează atașarea secvențială a bazelor nucleotidice la noua catenă de ADN în creștere.

Astfel, amplificarea ADN-ului este o creștere multiplă a numărului de copii ADN care sunt specifice, adică inerente doar unui anumit organism. Nu este nevoie să completați întregul lanț ADN pentru a vedea agentul infecțios. Este necesară doar zona care este caracteristică unei anumite bacterii ca individ.

5360 rub. Costul unui program cuprinzător cu un gastroenterolog

REDUCERE 25% LA O PROGRAMARE CU UN CARDIOLOG

- 25%primar
Vizita la medic
terapeut în weekend

5.160 RUB în loc de 5.420 de ruble. Screening-ul bărbaților pentru infecții urologice

ALERGOLOGIE 5.120 RUB în loc de 5.590 de ruble.

Toate etapele de amplificare foarte repetitive au loc la temperaturi diferite. Pentru efectuarea analizei PCR se folosesc echipamente special programabile - PCR - termostat sau amplificator, care schimba automat temperaturile. Amplificarea se realizează conform unui program dat corespunzător tipului de infecție detectată. În funcție de programul și tipul de infecție detectată, procesul automat de PCR durează de la 2 la 3 ore.

Calificările medicului de laborator care efectuează analizele joacă un rol important în diagnosticul PCR; de el depind setările corecte ale echipamentului PCR și interpretarea rezultatelor. Medicii de la Centrul Medical Euromedprestige au o vastă experiență în efectuarea diagnosticelor ADN, care asigură fiabilitatea rezultatelor cercetării și garantează succesul pozitiv în tratamentul bolilor infecțioase. Pentru a efectua teste PCR și a efectua un diagnostic complet și un tratament al bolilor infecțioase la centrul nostru medical Euromedprestige.

În timpul detectării produselor de amplificare, amestecul rezultat de produse de amplificare este separat. La amestec se adaugă soluții speciale, care dau fragmentelor de ADN capacitatea de a fluoresce - reflectate în dungi luminoase portocalii-roșii. Strălucirea rezultată indică prezența ADN-ului de viruși, microbi sau bacterii în materialul prelevat de la pacient pentru analiza PCR.