תגובת שרשרת פולימר. ראה מה זה "PCR" במילונים אחרים

GOU VPO "האקדמיה הרפואית הממלכתית של קרסנויארסק"

על שם הסוכנות הפדרלית לבריאות וחברתית יאסנצקי »

הנפקה של המחלקה לגנטיקה רפואית ונוירופיזיולוגיה קלינית

עקרונות בסיסיים של השיטה

תגובת שרשרת פולימראז

מדריך מתודולוגי לתלמידי 3-4 שנים

בהתמחויות הרפואה הכללית (060101) ו

קרסנויארסק - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. עקרונות בסיסיים של שיטת תגובת שרשרת הפולימראז. מדריך מתודולוגי לעבודה חוץ כיתתית של סטודנטים בני 3-4 בהתמחויות רפואה כללית (060101) ורפואת ילדים (060103). – Krasnoyarsk: בית ההוצאה לאור של המוסד החינוכי הממלכתי להשכלה מקצועית גבוהה KrasSMA, 2007. – 42 עמ'.

מדריך ההוראה תואם באופן מלא לדרישות תקן המדינה (2000) ומשקף את ההיבטים העיקריים של השיטה המודרנית לאבחון מחלות אנושיות תורשתיות - שיטת תגובת שרשרת הפולימראז, החומר החינוכי מותאם לטכנולוגיות חינוכיות, תוך התחשבות בפרטים הספציפיים של הכשרה ב-3-4 שנים של פקולטות רפואיות וילדים.

סוקרים:ראש המחלקה לגנטיקה רפואית, המוסד החינוכי הממלכתי להשכלה מקצועית גבוהה

"האוניברסיטה הרפואית הממלכתית של נובוסיבירסק של הסוכנות הפדרלית לבריאות ופיתוח חברתי", דוקטור למדעי הרפואה, פרופסור;

שכפול הדנ"א

מושא המחקר של שיטה זו הוא חומצה Deoxyribonucleic (DNA). DNA הוא הנשא האוניברסלי של מידע גנטי בכל האורגניזמים הקיימים על פני כדור הארץ (למעט מיקרואורגניזמים המכילים RNA). DNA הוא גדיל כפול המעוות לתוך סליל. כל גדיל מורכב מנוקלאוטידים המחוברים ברצף. לגדילי DNA יש כיוונים מנוגדים: קצה 5 אינץ' של גדיל אחד מתאים לקצה 3 אינץ' של הגדיל השני. תכונה ייחודית של ה-DNA הוא יכולתו להכפיל. תהליך זה נקרא שכפול. שכפול של מולקולת ה-DNA מתרחש במהלך התקופה הסינתטית של האינטרפאזה. כל אחת משתי השרשראות של מולקולת "האם" משמשת תבנית ל"בת". לאחר השכפול, מולקולת ה-DNA שסונתזה לאחרונה מכילה גדיל "אם" אחד, והשני הוא גדיל "בת" שסונתז לאחרונה (שיטה שמרנית למחצה). עבור סינתזת תבנית של מולקולת DNA חדשה, יש צורך שהמולקולה הישנה תהיה מיואש ומוארך. שכפול מתחיל במספר מקומות במולקולת ה-DNA. הקטע של מולקולת DNA מנקודת ההתחלה של שכפול אחד לנקודת ההתחלה של אחר נקרא רפליקון.

התחלת השכפול מופעלת פריימרים(פריימרים) המורכבים מ-100-200 זוגות נוקלאוטידים. אנזים ה-DNA helicase מתפרק ומחלק את סליל ה-DNA האם לשני גדילים, שעליהם, על פי עקרון ההשלמה, בהשתתפות האנזים DNA פולימראז, מורכבים גדילי DNA "בת". על מנת שהאנזים יתחיל את עבודתו, נדרשת נוכחות של בלוק התחלתי - שבר דו-גדילי ראשוני קטן. הבלוק ההתחלתי נוצר על ידי האינטראקציה של הפריימר עם האזור המשלים של הגדיל המקביל של ה-DNA האב. בכל רפליקון, DNA פולימראז יכול לנוע לאורך גדיל "האם" בכיוון אחד בלבד (5`=>3`).

על הגדיל המוביל, כשהרפליקון מתפרק, גדיל "בת" גדל בהדרגה ברציפות. על הגדיל המשכי, גם גדיל הבת מסנתז בכיוון (5`=>3`), אך בשברים נפרדים כשהרפליקון מתפרק.

לפיכך, תוספת של נוקלאוטידים משלימים של גדילי "הבת" מתרחשת בכיוונים מנוגדים (אנטי מקביל). שכפול בכל העתקים מתרחש בו זמנית. שברים וחלקים של גדילי "בת" המסונתזים בהעתקים שונים נתפרים לגדיל בודד על ידי האנזים ליגאז. שכפול מאופיין בשמרנות למחצה, אנטי-מקביליות וחוסר המשכיות. כל הגנום של התא משוכפל פעם אחת במהלך פרק זמן המקביל למחזור מיטוטי אחד. כתוצאה מתהליך השכפול נוצרות שתי מולקולות DNA ממולקולת DNA אחת, שבה גדיל אחד הוא ממולקולת האם של DNA, והשני, בת, מסונתזת לאחרונה (איור 1).

אורז. 1. ערכת שכפול מולקולת DNA.

לפיכך, מחזור שכפול ה-DNA כולל שלושה שלבים עיקריים:

1. התנתקות של סליל ה-DNA והתפצלות של גדילים (דנטורציה);

2. הצמדת פריימרים;

3. השלמת השרשרת של חוט הילד.

עקרון שיטת PCR

שכפול DNA הוא שמהווה את הבסיס ל-PCR. ב-PCR, התהליכים הנ"ל מבוצעים במבחנה במצב מחזורי. המעבר משלב תגובה אחד למשנהו מושג על ידי שינוי הטמפרטורה של תערובת הדגירה. כאשר התמיסה מחוממת ל-93-95 מעלות צלזיוס, מתרחשת דנטורציה של DNA. כדי להמשיך לשלב הבא - הוספה או "חישול" של פריימרים - תערובת הדגירה מקוררת ל-50-65 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, התערובת מחוממת ל-70-72 מעלות צלזיוס - האופטימלי לפולימראז של taq-DNA - בשלב זה מתרחשת בניית גדיל DNA חדש. ואז המחזור חוזר שוב. במילים אחרות שיטת PCR היא עלייה מרובה במספר העותקים (הַגבָּרָה) קטע ספציפי של DNA המזרז על ידי האנזים DNA פולימראז.

צמיחת גדילי ה-DNA הבת חייבת להתרחש בו-זמנית על שני הגדילים של ה-DNA האימהי, ולכן שכפול של הגדיל השני דורש גם פריימר משלו. לפיכך, שני פריימרים מתווספים לתערובת התגובה: אחד עבור שרשרת "+", השני עבור שרשרת "-". לאחר חיבור לגדילים המנוגדים של מולקולת ה-DNA, הפריימרים מגבילים את עצמם לחלק שלה שישוכפל או יוגבר לאחר מכן פעמים רבות. אורכו של קטע כזה, הנקרא אמפליקון, הוא בדרך כלל כמה מאות נוקלאוטידים.

שלבי PCR

כל מחזור הגברה כולל 3 שלבים, המתרחשים בתנאי טמפרטורה שונים (איור 2).

· שלב 1:דנטורציה של DNA . מתרחש ב-93-95° למשך 30-40 שניות.

· שלב 2:חישול פריימר . ההתקשרות של פריימרים מתרחשת משלימה לרצפים המתאימים על גדילי DNA מנוגדים בגבולות של אזור ספציפי. לכל זוג פריימרים יש טמפרטורת חישול משלו, שערכיה הם בטווח של 50-65 מעלות צלזיוס. זמן חישול 20-60 שניות.

· שלב 3:השלמה של שרשראות דנ"א. השלמה משלימה של שרשראות דנ"א מתרחשת מקצה 5" עד קצה 3" של השרשרת בכיוונים מנוגדים, החל מאתרי ההתקשרות של הפריימר. החומר לסינתזה של שרשראות DNA חדשות הוא טריפוספטים מסוג deoxyribonucleoside שנוספו לתמיסה. תהליך הסינתזה מזורז על ידי האנזים taq polymerase ומתרחש בטמפרטורה של 70-72 מעלות צלזיוס. זמן הסינתזה הוא 20-40 שניות.

שרשראות ה-DNA החדשות שנוצרו במחזור ההגברה הראשון משמשות כתבניות למחזור ההגברה השני, בו נוצר קטע אמפליקון DNA ספציפי (איור 3). במחזורי ההגברה הבאים, האמפליקונים משמשים כתבנית לסינתזה של שרשראות חדשות.

לפיכך, הצטברות האמפליקונים בתמיסה מתרחשת לפי הנוסחה 2", כאשר n הוא מספר מחזורי ההגברה. לכן, גם אם התמיסה הראשונית הכילה בתחילה רק מולקולת DNA דו-גדילית אחת, הרי שב-30-40 מחזורים בערך 108 מולקולות אמפליקון מצטברות בתמיסה. הכמות הזו מספיקה לזיהוי ויזואלי אמין של שבר זה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

תהליך ההגברה מתבצע בתרמוסטט מיוחד הניתן לתכנות ( מחזור תרמי), שלפי תוכנית נתונה משנה טמפרטורות אוטומטית בהתאם למספר מחזורי ההגברה.

כדי לבצע הגברה, נדרשים הרכיבים הבאים:

· מטריצת DNA(DNA או חלק ממנו המכיל את הפרגמנט הספציפי הרצוי);

· פריימרים(אוליגונוקלאוטידים סינתטיים (20-30 זוגות נוקלאוטידים), משלימים לרצפי DNA בגבולות הפרגמנט הספציפי הנקבע). הבחירה של מקטע ספציפי ובחירת הפריימרים ממלאת תפקיד קריטי בספציפיות של הגברה, המשפיעה על איכות הניתוח.

· תערובת של דיאוקסינוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs)(תערובת של ארבעה dNTPs, שהם החומר לסינתזה של שרשראות DNA משלימות חדשות בריכוזים שווים של 200-500 מיקרומטר)

· אֶנזִיםטאק-פולימראז(פולימראז DNA יציב תרמי המזרז את התארכות שרשראות הפריימר על ידי הוספה רציפה של בסיסי נוקלאוטידים לשרשרת הגדלה של DNA מסונתז, 2-3 מ"מ).

· פתרון מאגר(מדיום תגובה המכיל יוני Mg2+ הנחוצים לשמירה על פעילות האנזים, pH 6.8-7.8).

כדי לזהות אזורים ספציפיים בגנום של נגיפי RNA, עותק DNA מתקבל תחילה מתבנית RNA באמצעות תגובת שעתוק לאחור (RT) המזוזת על ידי האנזים revertase (reverse transcriptase).

אורז. 2. הגברה (מחזור ראשון).

אורז. 3. הגברה (מחזור שני).

יישומים עיקריים של PCR

· תרופה קלינית:

o אבחון של זיהומים,

o זיהוי מוטציות, כולל אבחון של מחלות תורשתיות,

o גנוטיפ, כולל גנוטיפ HLA,

o טכנולוגיות סלולריות

· אקולוגיה (כדרך לנטר את המצב והאיכות של חפצים סביבתיים ומוצרי מזון)

· קביעת אורגניזמים מהונדסים (GMO)

זיהוי אישי, הקמת אבהות, זיהוי פלילי

· ביולוגיה כללית וספציפית,

עקרונות בסיסיים

ארגון מעבדות אבחון

העבודה במעבדת PCR מתבצעת בהתאם ל"כללי התכנון, אמצעי זהירות, תברואה תעשייתית, משטר אנטי-מגיפה והיגיינה אישית בעבודה במעבדות (מחלקות, מחלקות) של מוסדות סניטריים ואפידמיולוגיים של מערכת הבריאות.

זיהום דגימות DNA

ביצוע אבחון PCR קשור לבעיה בשל הרגישות הגבוהה של השיטה – האפשרות נְגִיעוּת. כניסת כמויות עקבות של DNA חיובי לצינור התגובה (מוצרי הגברה ספציפיים של DNA - אמפליקונים; תקן DNA המשמש כבקרה חיובית; DNA חיובי מדגימה קלינית) מובילה להגברה של שבר DNA ספציפי במהלך PCR וכתוצאה מכך , להופעת תוצאות חיוביות שגויות.

בתהליך העבודה אתה עלול להיתקל שני סוגי זיהום:

1. זיהום צולבמדגימה לדגימה (במהלך עיבוד דגימות קליניות או בעת המסת תערובת התגובה), מה שמוביל לתוצאות חיוביות שגויות ספורדיות;

2. זיהום עם מוצרי הגברה(אמפליקונים), שהוא בעל החשיבות הגדולה ביותר, מכיוון שבמהלך תהליך ה-PCR, אמפליקונים מצטברים בכמויות אדירות והם מוצרים אידיאליים להגברה מחדש.

זיהום של כלי זכוכית, פיפטות אוטומטיות וציוד מעבדה, פני השטח של ספסלי מעבדה, או אפילו פני העור של עובדי המעבדה עם כמויות עקבות של אמפליקונים מובילים לתוצאות חיוביות-שגויות שיטתיות. קביעת מקור הזיהום יכולה להיות קשה מאוד ודורשת השקעה משמעותית של זמן וכסף. הניסיון שנצבר עד כה במעבדות בשיטת PCR לאבחון מאפשר לנו לגבש את הדרישות הבסיסיות לארגון מעבדות כאלו ולביצוע הניתוחים עצמם. עמידה בדרישות אלו מבטלת את האפשרות של זיהום ותוצאות חיוביות כוזבות.

שלבי ניתוח PCR

הם מופרדים גיאוגרפית על ידי הצבתם בחדרים נפרדים (איור 4, 5):

· חדר טרום PCR,כאשר מעבדים דגימות קליניות, מבודדים DNA, מכינים תערובת תגובה ל-PCR ומבצעים PCR (אם קיימים תנאים, מומלץ גם לבצע את שני השלבים האחרונים בחדר נפרד נוסף). בחצרים אלו חל איסור לבצע את כל שאר סוגי העבודות עם סוכני בדיקה, אשר אבחון PCR מבוצע במעבדה זו.

· חדר לאחר PCR,שבו מתבצע זיהוי של מוצרי הגברה. ניתן להשתמש בשיטות זיהוי אחרות בחדר זה. רצוי למקם את חדר זיהוי מוצרי ההגברה רחוק ככל האפשר מחדרי הקדם-PCR.

חדרי העבודה מצוידים במנורות אולטרה סגול בעלות קרינה מרבית באזור 260 ננומטר (סוג DB-60) בקצב של 2.5 W ל-1 מ"ק. המנורות ממוקמות כך שמשטחי שולחנות עבודה, ציוד וחומרים עימם יש למפעיל מגע במהלך ניתוח PCR חשופים לקרינה ישירה. ההקרנה מתבצעת תוך שעה לפני תחילת העבודה ותוך שעה לאחר סיום העבודה.

רופאי מעבדה עובדים בבגדי מעבדה מיוחדים, המוחלפים במעבר מחדר אחד לשני, ובכפפות חד פעמיות. בגדים מחדרים שונים מעובדים בנפרד. עובדים שונים עובדים בשלבים שונים של ניתוח PCR.

לעבודה משתמשים בסטים נפרדים של מכשירי פלסטיק וזכוכית, ציוד מעבדה, חלוקים וכפפות המיועדים לשלבי ניתוח שונים ואינם ניידים מחדר אחד לשני. ציוד, חומרים ואספקה ​​בכל חדר מסומנים כראוי.

כל שלבי העבודה מתבצעים רק באמצעות חומרים מתכלים חד-פעמיים: טיפים לפיפטות אוטומטיות, מבחנות, כפפות וכו'. הקפידו להחליף טיפים בעת מעבר מדגימה לדגימה. יש צורך להשתמש בקצות עם מסנן - מחסום אירוסול כדי למנוע מיקרוטיפות של התמיסה להיכנס לפיפטה. צינורות וטיפים משומשים מושלכים למכלים מיוחדים או למיכלים המכילים תמיסת חיטוי. דגימות קליניות מאוחסנות בנפרד מגיבים.

כדי לעבד ולנקות את מקום העבודה, כל חדר מצויד במגבונים (מגבונים), פינצטה, חומרי חיטוי ותמיסות מנטרלות.

מעבדת האבחון PCR אינה כוללת עבודה הקשורה לייצור (שיבוט) ובידוד של פלסמידים רקומביננטיים המכילים רצפי DNA או שברי גנים של פתוגנים המאובחנים במעבדה זו.

איסוף חומר קליני

החומר שיש לחקור עבור PCR יכול להיות גרידה של תאי אפיתל, דם, פלזמה, סרום, נוזלי פלאורלים ומוחי השדרה, שתן, כיח, ריר והפרשות ביולוגיות אחרות, ביופסיות.

החומר נאסף בחדר טיפולים בפרופיל המתאים. לאחר האיסוף, יש להעביר את הדגימות למעבדת האבחון PCR בהקדם האפשרי.

יש לקחת דגימות באמצעות מכשירים סטריליים, עדיף חד פעמיים, רק בשפופרות פלסטיק סטריליות חד פעמיות או צינורות זכוכית, מטופלים מראש במשך שעה בתערובת כרום, שטפו היטב במים מזוקקים וסולחנו בארון ייבוש בטמפרטורה של 150 מעלות צלזיוס. במשך שעה 1.

אזור גילוי (קומה אחרת או בניין אחר).

אורז. 4. מכשיר מעבדת PCR עם זיהוי באמצעות אלקטרופורזה.

אזור זיהוי (קומה אחרת או בניין אחר)

אורז. 5. מכשיר מעבדה PCR עם זיהוי פלורסנט (ניתוח כמותי).

אורז. 6. חדר חילוץ DNA.מוצגת קופסת שולחן עם מנורה קוטל חיידקים.

אורז. 7. חדר הגברה.

אורז. 8. חדר איתור.

אורז. 9. דגימות דם לאבחון DNA של מחלות תורשתיות.

אחסון והובלה לדוגמא

כדי לאבחן מחלות תורשתיות, דגימות דם מאוחסנות על טפסי נייר מיוחדים או באפינדורפים (שפופרות פלסטיק) במצב קפוא למשך זמן רב (איור 9).

כדי לאבחן מחלות זיהומיות, דגימות נשמרות בטמפרטורת החדר למשך לא יותר משעתיים. אם נדרש אחסון ארוך יותר, ניתן להכניס דגימות למקרר בטמפרטורה של 2-8 מעלות צלזיוס לתקופה של לא יותר מיממה. אחסון ארוך יותר (עד שבועיים) מותר בהקפאה במקפיא בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס. הקפאה והפשרה חוזרת של דגימות אסורה.

אם מעבדת האבחון PCR וחדר ההליכים לדגימה מופרדים גיאוגרפית, יש לבצע את הובלת הדגימות בתרמוסים או במיכלים תרמיים בהתאם לכללי אחסון הדגימות ולכללי הובלת חומרים מדבקים.

מיצוי DNA מדגימות

שיטת הספיחה המוצקה הפכה לנפוצה, המורכבת מהוספת חומר תמוגה המכיל תמיסת גואנידין, ספיגה של DNA על סורבנט, שטיפה חוזרת וספיגת DNA בתמיסת חיץ. בעת עיבוד סרום, פלזמה או דם מלא, בדרך כלל משתמשים בשיטת מיצוי הפנול. השיטה כוללת דה-פרוטאין עם פנול/כלורופורם ואחריו משקעים של DNA (או RNA) עם אתנול או איזופרפנול. העיבוד מתבצע בשפופרות מיקרוצנטריפוגות של Eppendor P בנפח 1.5 מ"ל. זמן העיבוד הוא 1.5-2 שעות (איור 10).

אורז. 10. מיצוי DNA.

ביצוע PCR

כמות מסוימת של דגימה מהדגימה הקלינית המעובדת מועברת לשפופרת מיקרוצנטריפוגה מיוחדת מסוג אפנדורף בנפח של 0.2 או 0.5 מ"ל. מוסיפים תערובת הגברה המורכבת ממים, חוצץ PCR, תמיסת dNTP, תמיסת פריימר ותמיסה. אותה שפופרת. Taq פולימראז (נוסף לתערובת אחרון). בדרך כלל, נפח תערובת התגובה הוא 25 μl. לאחר מכן מוסיפים טיפה אחת של שמן מינרלי לכל שפופרת כדי למנוע אידוי של תערובת התגובה במהלך תהליך ההגברה. צינורות מועברים לתרמוסטט הניתן לתכנות (מגבר), שבו ההגברה מתבצעת באופן אוטומטי לפי תוכנית נתונה (איור 11).

אורז. אחד עשר. מגבר" טרמוסייקלר ».

זמן התגובה, בהתאם לתוכנית שצוינה, הוא 2-3 שעות. במקביל לדגימות הניסוי ממוקמות דגימות בקרה: הבקרה החיובית כוללת את כל מרכיבי התגובה, אך במקום חומר הדגימה הקליני מתווספת תכשיר DNA בקרה של הגן הנחקר. הבקרה השלילית כוללת את כל מרכיבי התגובה, אך במקום חומר קליני או תכשיר DNA, מוסיפים כמות מתאימה של מים מופחתים או תמצית שאינה מכילה את ה-DNA הנבדק. יש צורך בקרה שלילית כדי לבדוק את מרכיבי התגובה על היעדר DNA עקב זיהום וכדי למנוע תוצאות חיוביות שגויות.

רישום תוצאות

קטע ה-DNA הספציפי המוגבר מזוהה על ידי אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז בנוכחות אתידיום ברומיד. אתידיום ברומיד יוצר תרכובת אינטרסטיציאלית יציבה עם שברי DNA, המופיעה בצורת פסים זוהרים כאשר הג'ל מוקרן בקרינת UV באורך גל של 290-330 ננומטר. בהתאם לגודל האמפליקונים שנוצרו כתוצאה מ-PCR, נעשה שימוש בג'ל עם תכולת אגרוז של 1.5% עד 2.5%. להכנת ג'ל אגרוז ממיסים תערובת של אגרוז, חוצץ ומים במיקרוגל או באמבט מים ומוסיפים תמיסה של אתידיום ברומיד. את התערובת, שמקורה ל-50-60 מעלות צלזיוס, יוצקים לתוך התבנית בשכבה בעובי 4-6 מ"מ ובעזרת מסרקים מיוחדים יוצרים כיסים בג'ל למריחת הדוגמא. המסרקים מותקנים בצורה כזו שנשארת שכבה של 0.5-1 מ"מ של אגרוז בין תחתית הבארות לבסיס הג'ל. לאחר שהג'ל מתקשה, מורחים את המגבר על הכיסים בכמות של 5-15 μl. מומלץ לבצע אלקטרופורזה של תערובת של סמני אורך שברי DNA במקביל לדגימות בקרה וניסויים. בדרך כלל, תערובת כזו מכילה עשרה שברי DNA באורך 100, 200, 300 וכו' זוגות בסיסים.

שימוש בבדיקה כזו מאפשר לאמת את אורך האמפליקונים בדגימות בקרה וניסויים. הג'ל עם המדגם המיושם מועבר לתא אלקטרופורזה מלא במאגר, החדר מחובר למקור מתח והפרדה אלקטרופורטית של מוצרי ההגברה מתבצעת למשך 30-45 דקות בעוצמת שדה חשמלי של 10-15 V/ ס"מ. במקרה זה, החלק הקדמי של הצבע הכלול בתערובת התגובה חייב לעבור לפחות 3 ס"מ.

לאחר השלמת האלקטרופורזה, הג'ל מועבר ל-transilluminator זכוכית ונצפה תחת אור אולטרה סגול. לתיעוד הג'ל מצולם על סרט Micrat 300 או מוקלט באמצעות מערכת וידאו המחוברת למחשב.

קודם כל, דגימות בקרה מוערכות. פס זוהר כתום צריך להיות נוכח במסלול האלקטרופורטי התואם לבקרה החיובית. הניידות האלקטרופורטית שלו חייבת להתאים לאורך האמפליקון המצוין בהוראות.

במסלול האלקטרופורטי המקביל לבקרה השלילית, פס כזה צריך להיעדר. נוכחות של פס כזה בבקרה השלילית מעידה על זיהום - זיהום של הריאגנטים המשמשים עם ה-DNA או האמפליקון של הבדיקה. דגימות הבדיקה מוערכות על ידי נוכחות של פס במסלול המקביל, הממוקם באותה רמה כמו הרצועה בדגימת הביקורת החיובית. עוצמת הרצועה מתאימה לכמות ה-DNA הנבדקת בדגימה, מה שמאפשר הערכה חצי כמותית של PCR. בדרך כלל, תוצאות חיוביות מוערכות בסולם של ארבע נקודות. אם זוהר הלהקה בדגימת הבדיקה חלש מאוד, יש לארגן מחדש דגימה כזו (איור 12).

אורז. 12. אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז.

יישומים של PCR עבוראבחון של מוטציות נקודתיות ופולימורפיזם של גנים

אחד מתחומי היישום המובילים של PCR בטיפול רפואי מעשי הוא אבחון מוטציות נקודתיות ופולימורפיזם של גנים . ישנן שיטות ישירות ועקיפות לאבחון DNA. במצבים בהם ידוע על גן שפגיעה בו מביאה להתפתחות מחלה תורשתית, ניתן לאתר נזק זה בשיטות גנטיות מולקולריות. שיטות כאלה נקראות ישירות. באמצעות שיטות ישירות, מתגלות אי-סדירות ברצף הנוקלאוטידים הראשוני של ה-DNA (מוטציות וסוגיהם). שיטות ישירות מאופיינות בדיוק המגיע לכמעט 100%.

עם זאת, בפועל, ניתן להשתמש בשיטות אלו בתנאים מסוימים:

· עם לוקליזציה ציטוגנטית ידועה של הגן האחראי להתפתחות מחלה תורשתית;

· יש לשבט את גן המחלה ולדעת את רצף הנוקלאוטידים שלו.

המטרה של אבחון DNA ישיר היא לזהות אללים מוטנטיים.

כך, במצבים בהם ידוע איזה סוג של נזק ל-DNA מוביל למחלה תורשתית, בודקים ישירות את קטע ה-DNA המכיל את הנזק, כלומר, נעשה שימוש בשיטת האבחון הישירה של ה-DNA.

עם זאת, עד היום לא מופו הגנים של מחלות רבות, ארגון האקסון-אינטררון שלהן אינו ידוע, ומחלות תורשתיות רבות מתאפיינות בהטרוגניות גנטית מובהקת, שאינה מאפשרת שימוש מלא בשיטות אבחון DNA ישירות. לכן, במקרים בהם לוקליזציה של הנזק אינה ידועה, נעשה שימוש בגישה אחרת, הקשורה לחקר הסביבה של הגן האחראי למחלת הגן, בשילוב עם ניתוח משפחתי, כלומר, שיטות עקיפות לאבחון גנטי מולקולרי של משתמשים במחלות תורשתיות.

ניתן להשתמש בשיטות שונות לאיתור מוטציות נקודתיות ומחיקות קטנות, אך כולן מסתמכות על שיטת ה-PCR. תגובה זו מאפשרת לך להכפיל את רצף הנוקלאוטידים של ה-DNA פעמים רבות ולאחר מכן לחפש מוטציות. שיטות לחיפוש אחר שברי DNA הנושאים מוטציות מבוססות על ניתוח השוואתי של רצפי נוקלאוטידים של DNA מוטנטים ונורמליים.

ניתוח מוצרי PCR

בתהליך של אבחון DNA ישיר

כולל מחקר של תכונות ספציפיות של אזור הגן המוגבר. לפיכך, במחלות הנגרמות כתוצאה מהתרחבות של חזרות טרינוקלאוטידים, תוצרי ההגברה שונים באורכם (המשקפים את המספר השונה של שלישיות באזור הגן הנחקר) וכתוצאה מכך, במהירות התנועה שלהם בג'ל. הודות לכך, מושגת הפרדה אלקטרופורטית ברורה של אללים נורמליים ומוטנטים וקביעה מדויקת של שבר מוארך פתולוגית, כלומר אבחון DNA של המחלה (איור 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

אורז. 14. אבחון של מחיקה בְּדִיחָה בגן DYT 1 בחולים עם דיסטוניה בלתי תלויה בדופא (אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד). נתיבים 2,3,6 - חולה; רצועות 1,4,5 - שליטה. החץ הדק מציין את האלל התקין, החץ העבה מציין את האלל הקצר המוטנטי (מחיקה של שלושה נוקלאוטידים).

אם כל אזור ה-DNA הנחקר הוא חלק ממחיקה מורחבת, אזי הגברה PCR של DNA מהאלל שנמחק זה לא יתבצע עקב היעדר אתרים להכלאה של פריימר. במקרה זה, תאובחן מחיקה הומוזיגוטית על סמך היעדר מוחלט של תוצר תגובת PCR (סינתזת DNA בלתי אפשרית משני העותקים של הגן). עם מחיקה הטרוזיגטית, ניתן לזהות תוצר PCR המסונתז מאלל תקין (שמור), אולם כדי לאבחן בצורה מהימנה מוטציה כזו, יש צורך להשתמש בשיטות הדמיית DNA מורכבות יותר המאפשרות להעריך את המינון של ה-PCR הסופי. מוצר.

כדי לזהות מוטציות נקודתיות (לרוב החלפות נוקלאוטידים) באתרים מסוימים, נעשה שימוש בשיטת PCR בשילוב עם שיטות אחרות של ניתוח גנטי מולקולרי. אם המיקום והטבע של מוטציית הנקודה המשוערת ידועים במדויק, אזי אנדונוקליזות הגבלה (אנזימי הגבלה) הם אנזימים תאיים מיוחדים המבודדים מזנים שונים של חיידקים.

אנזימים אלו מזהים רצפי נוקלאוטידים ספציפיים באורך של בין ארבעה לעשרה נוקלאוטידים. לאחר מכן, מתבצעת הגבלה (lat. (חיתוך)) של רצפים אלו כחלק ממולקולת DNA דו-גדילית. כל אנזים הגבלה מזהה וחותך במקום קבוע רצף נוקלאוטידים מוגדר בקפדנות - אתר הגבלה (אתר זיהוי).

במקרים בהם מוטציה נקודתית משנה את אתר הזיהוי הטבעי של אנזים הגבלה מסוים, אנזים זה לא יוכל לבקע את המקטע המוגבר ב-PCR המוגבר. במקרים מסוימים, מוטציה מובילה להופעת אתר זיהוי חדש של אנזים הגבלה מסוים שנעדר בדרך כלל.

בשני המצבים, תוצרי ה-PCR המוטנטים והנורמליים המטופלים באנזים ההגבלה שנבחר יפיקו שברי הגבלה באורכים שונים, אותם ניתן לזהות בקלות באמצעות אלקטרופורזה (איור 15).

לפיכך, אם יש צורך לזהות במהירות כל מוטציה נקודתית ספציפית, המשימה מצטמצמת לחיפוש אחר אנזים ההגבלה המתאים, שאתר הזיהוי שלו ממוקם במקום של רצף הנוקלאוטידים המשובש. טיפול במוצרי PCR עם אנזים הגבלה כזה יאפשר להבדיל בקלות בין אללים נורמליים למוטנטיים. ניתוח הגבלה מפשט מאוד את הזיהוי של מוטציות נקודתיות ידועות וכיום נעשה בו שימוש נרחב לאבחון DNA ישיר של מחלות תורשתיות.

השלב הסופי ניתוח גנטי מולקולרי של מוטציותהוא לקבוע את רצף הנוקלאוטידים של קטע ה-DNA הנחקר (ריצוף), אשר מושווה לנורמה ומתגבשת אבחנה גנטית סופית. הודות להצלחות הגנטיקה המולקולרית, פותחו כעת שיטות אבחון DNA ליותר מ-400 מחלות תורשתיות.

אורז. 15. זיהוי של מוטציה נקודתית באמצעות ניתוח הגבלה: A – אזור גן מוגבר המכיל אתר הגבלהAGCTעבור אנדונוקלאז הגבלהאלו אני. מוּטָצִיָהG→ אמשנה את רצף הנוקלאוטידים הזה, וכתוצאה מכך נוצר אנזים הגבלהAluIחָסוּם; B - אלקטרופרוגרמה של מוצרי הגבלה: מסלול 1 - הומוזיגוזיות לאלל הנורמלי; מסלול 2 - הומוזיגוזיות למוטציה; מסלול 3 - מצב הטרוזיגוטי (אלל תקין + מוטציה).

אבחון של מחלות תורשתיות, המבוסס על בדיקה ישירה של אללים מוטנטים בחולים, בני משפחתם או נשאים הטרוזיגוטיים חשודים למוטציות פתולוגיות, מתאים לאבחון טרום סימפטומטי וקדם לידתי, שניתן ליישם בשלבים המוקדמים ביותר של התפתחות העובר, לפני הופעה של כל מחלות סימפטומים קליניים או ביוכימיים.

ללא קשר לשיטת זיהוי המוטציות, ניתן להשיג מאפיינים מולקולריים מדויקים של כל מוטציה רק ​​על ידי רצף ישיר. כדי להפוך תהליך זה לאוטומטי, בשנים האחרונות נעשה שימוש נרחב במכשירים מיוחדים - רצפים, המאפשרים לזרז משמעותית את תהליך קריאת מידע ה-DNA.

הדרך לשימוש נרחב יותר במחקר ביולוגי מולקולרי במעבדות אבחון קליני נפתחת על ידי האצת התהליך האנליטי על ידי ביצוע כל ההליכים ברצף אחד, ללא העברת דגימה, יצירת תנאים למניעת זיהום במהלך בדיקות מקבילות של מספר אנליטים ועל ידי רישום אובייקטיבי של תוצאות בכל מחזור.

שינויים עיקריים בשיטת PCR

משמש לסריקה מהירה ולחיפוש אחר מוטציות גנים ידועות.

Multiplex (מולטי פריימר) PCR

שיטה זו מבוססת על הגברה בו-זמנית של מספר אקסונים של הגן הנחקר בתגובה אחת. זה מאפשר בדיקה מהירה וחסכונית של המוטציות הנפוצות ביותר. לדוגמה, כדי לאבחן במהירות את הובלת המחיקות בגן הדיסטרופין בחולים עם ניוון שרירים פרוגרסיבי של דושן/בקר, מתבצעת הגברה בו-זמנית של קבוצה של האקסונים המוטות בתדירות הגבוהה ביותר של גן זה. מאחר שמחלות אלו עוברות בתורשה בצורה רצסיבית מקושרת X וקשורות לפגיעה בכרומוזום X היחיד אצל בנים, במקרה של מחיקה ממושכת, אלקטרופורזה של תוצרי התגובה תגלה את היעדר שברי DNA אחד או יותר (אקסונים). ), שיכול לשמש אישור מולקולרי לאבחנה. בנוסף, על ידי בחירת קטעי גנים ספציפיים להגברת PCR, מתאפשרת הערכה מדויקת למדי של האורך הכולל של המחיקה ונקודות השבירה של הגנים (עד לאקסון).

השימוש המשולב במספר תגובות ריבוי מאפשר לאבחן עד 98% מכלל המחיקות המתרחשות בחולים עם ניוון שרירים פרוגרסיבי של דושן/בקר. זה מייצג כ-60% מסך המוטציות הידועות בגן הדיסטרופין ומצביע על היעילות הגבוהה מאוד של שיטת סקר זו לאבחון DNA של דיסטרופינפתיות (איור 16).

אורז. 16. אבחון DNA ישיר של ניוון שרירים Duchenne באמצעות Multiplex PCR (אגרוז ג'ל אלקטרופורזה). בכל אחד מהפרטים שנבדקו, ארבעה אקסונים של הגן דיסטרופין הוגברו בו זמנית (אקסונים 17, 19, 44 ו-45; חיצים מציינים את תוצרי ההגברה המתאימים). מסלול 1 – בקרה, נתיבים 2-5 – חולים עם ניוון שרירים דושן עם מחיקות שונות של הגן דיסטרופין (נתיבים 2 ו-5 – מחיקת אקסון 45, מסלול 3 – מחיקת אקסון 44, מסלול 4 – מחיקת אקסון 17 ו-19 ).

הגברה ספציפית לאלל

השיטה מבוססת על שימוש בשני זוגות פריימרים בלתי תלויים לאזור גן ספציפי: פריימר אחד בשני הזוגות נפוץ, והפריימר השני בכל זוג בעל מבנה שונה והוא משלים לרצף DNA תקין או מוטנטי. כתוצאה מתגובה כזו, ניתן לסנתז שני סוגים של תוצרי PCR בו-זמנית בתמיסה - נורמלי ומוטנטי. יתר על כן, העיצוב של הפריימרים המשמשים מאפשר להבדיל בבירור בין מוצרי הגברה נורמליים למוטנטיים לפי גודלם המולקולרי. שיטה זו היא מאוד ויזואלית ומאפשרת לך לאמת נשיאה הומו והטרוזיגוטית של האלל המוטנטי.

שיטה לשינוי מכוון-אתר של DNA מוגבר

השיטה מבוססת על שימוש במה שנקרא primer mismatch ב-PCR (לא משלים לחלוטין לתבנית), השונה מרצף ה-DNA של התבנית בנוקלאוטיד אחד. כתוצאה מהכללת הפריימר שצוין בתוצר ה-PCR המוטנטי, נוצר בו אתר הגבלה שנוצר באופן מלאכותי עבור אחד מאנדונוקלאזות ההגבלה, המאפשר אבחון DNA ישיר של מוטציה ידועה מסוימת באמצעות ניתוח הגבלה. יצירת אתר הגבלה מלאכותי כזה נחוצה אם החיפוש לא העלה קיומו של אנזים ידוע וזמין, שאתר ההגבלה ה"טבעי" שלו מושפע כתוצאה מהופעת המוטציה הנחקרת במולקולת ה-DNA. .

שיטת PCR של תמלול הפוך (RT- PCR)

שיטה זו משמשת במקרים בהם נוח יותר להשתמש לא ב-DNA גנומי כמושא המחקר, אלא ב-cDNA קומפקטי יותר ועשיר במידע המתקבל לאחר עיבוד מתאים של דגימות רקמה, למשל, חומר ביופסיה או שורות תאים של לימפוציטים, פיברובלסטים וכו' חשוב התנאי כאן הוא הביטוי (לפחות מינימלי) של הגן הרצוי ברקמה הנחקרת.

בשלב הראשון, שעתוק הפוך של mRNA מתבצע, ומולקולות ה-cDNA המתקבלות משמשות כתבנית ל-PCR. לאחר מכן, האזור הקריטי של cDNA, המוגבר בכמות מספקת, נתון לרצף ושיטות אחרות של בדיקת מוטציות, מחקר אלקטרופורטי ישיר (זיהוי מחיקות, הוספות וכו') או אינטגרציה למערכת ביטוי על מנת לקבל תוצר חלבוני והניתוח הישיר שלו.

שיטה זו יעילה במיוחד לאיתור מוטציות המובילות לסינתזה של חלבון "קטום" (מוטציות שטויות, מוטציות שחבור, מחיקות גדולות) - מה שנקרא ניתוח PTT (Protein Truncation Test). ניתוח PTT משמש בדרך כלל במחקר של גנים רב-אקסונים ארוכים, כגון ניוון שרירים דושן/בקר, אטקסיה-טלנגיאקטזיה או נוירופיברומטוזיס מסוג 1.

PCR בזמן אמת(PCR בזמן אמת, אנגלית)

מדי שנה, PCR בזמן אמת הופך לשיטת אבחון פופולרית יותר ויותר בתחום הבריאות המעשית. התכונה הבסיסית שלו היא ניטור וניתוח כמותי של הצטברות תוצרי תגובת שרשרת פולימראז והרישום והפירוש האוטומטי של התוצאות שהתקבלו. שיטה זו אינה מצריכה שלב אלקטרופורזה, מה שמפחית את הדרישות למעבדת PCR. הודות לחיסכון בשטח ייצור, צמצום כמות כוח האדם והביקוש לקביעה כמותית של DNA/RNA, שיטה זו שימשה בהצלחה בשנים האחרונות במרכזים סניטריים-אפידמיולוגיים, אבחון ומחקרים הגדולים במדינות המפותחות בעולם, ומחליפה PCR בפורמט הנוכחי ("קלאסי").

PCR בזמן אמת משתמש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים עם תיוג פלואורסצנטי כדי לזהות DNA בזמן שהוא מוגבר. PCR בזמן אמת מאפשר ניתוח מלא של דגימה תוך 20-60 דקות ומסוגל תיאורטית לזהות אפילו מולקולת DNA או RNA אחת בדגימה.

אורז. 17. PCR בזמן אמת.

PCR בזמן אמת משתמש במערכת TaqMan השולטת בקינטיקה של PCR ישירות במהלך ההגברה באמצעות כיבוי קרינת תהודה. לצורך זיהוי, נעשה שימוש בבדיקה הנושאת פלואורופור ו-quencher משלימים לחלק האמצעי של הפרגמנט המוגבר. כאשר הפלואורופור והמרווה קשורים לבדיקת האוליגונוקלאוטיד, נצפית פליטת פלורסנט מינורית בלבד. במהלך תהליך ההגברה, עקב פעילות האקסונוקלאז של 5 אינץ' של Taq polymerase, התווית הפלורסנטית נכנסת לתמיסה, משוחררת מקרבתה למרווה, ומייצרת אות פלואורסצנטי שגדל בזמן אמת ביחס להצטברות המגבר ( איור 17).

היתרונות העיקריים של PCR בזמן אמת על פני PCR עם אלקטרופורזה של ג'ל:

· השיטה כולה מתרחשת במבחנה אחת;

· השיטה אורכת שעה;

· 1-2 חדרי עבודה מספיקים;

· לצד הערכה איכותית של התוצאה, ישנה אפשרות להערכה כמותית (לדוגמה, כאשר רושמים טיפול אנטי-ויראלי לאיידס או צהבת נגיפית, יש צורך לדעת את העומס הנגיפי, כלומר כמות הנגיף ליחידה, אשר מסופק על ידי PCR בזמן אמת);

· הסיכון לזיהום מופחת בחדות.

סיכום

שיטת PCR היא אחת השיטות הנפוצות ביותר במחקר ביולוגי מולקולרי. יש להשתמש בשיטה זו באופן מושכל על ידי קלינאים, ורופא המחליט להשתמש ב-PCR בעבודתו חייב להיות בעל ידע מסוים לגבי התכונות והיכולות של שיטה זו. שנית, חייב להיות משוב הדוק בין הקלינאי למעבדת ה-PCR, הכרחי לניתוח מקרים מורכבים ולפתח את אסטרטגיית האבחון הנכונה. שלישית, ניתוח PCR אינו תרופת פלא באבחון (בעיקר מחלות זיהומיות) ואינו מחליף את שיטות המחקר הקיימות, אלא רק משלים אותן. והכי חשוב, PCR לא יכול להחליף את האינטואיציה והחשיבה האנליטית שחייב להיות לרופא שמצפה להצלחה.

פ . ס . מחקר ביולוגי מולקולרי - שינוי הנחיות לאבחון וטיפול. השימוש בשיטות ביולוגיות מולקולריות קשור לסיכוי לשינוי קיצוני בדגש באבחון מעבדתי. ייתכן שלא מדובר רק על מידע בזמן, אלא על קבלתו מראש. אם כעת בדיקות מעבדה ברוב המקרים מתבצעות כבר כשהמחלה התפתחה והטיפול החל, הרי שמידע מעבדה ביולוגי מולקולרי צפוי לאפשר לזהות את נטייתו של אדם לסוגים מסוימים של פתולוגיה ואת מידת הרגישות לתרופות מסוימות. , אשר יצדיק את אופי הרפואה העתידית חזוי, מונע ומותאם אישית.

שינוי כיוון האבחון והטיפול

מחלות תורשתיות

היום בעתיד

אבחון דרכון גנטי

8. כמה חדרי עבודה נדרשים להפעלת מעבדת PCR עם זיהוי פלורסנט (ניתוח כמותי, PCR בזמן אמת)?

9. מהו איתור?

10. אילו שיטות לאבחון DNA קיימות?

11. העבודה של איזה אנזים עומד בבסיס ה-PCR?

12. מדוע צריך להסיר את אזור הגילוי מאזורי עבודה אחרים?

13. מהו אתר הגבלה?

14. מהם ההבדלים בין שיטות האבחון הישירה והעקיפה של DNA?

15. מה זה רצף?

16. מהו Multiplex PCR?

17. אילו סוגי מוטציות נקבעים באמצעות PCR?

18. מהו זיהום?

19. מהי המהות של שיטת ההגברה הספציפית לאלל?

20. תנאי אחסון לחומר PCR?

21. באיזה מכשיר מתבצעת הגברה?

22. מהי שיטת ה-Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR)?

23. מה משמש חומר לאבחון PCR?

24. רשום את סוגי הזיהום?

מבחנים להכנה עצמית

1. אנזימים להגבלה של אנדונוקלאז:

א) אנזימים ש"שוברים" DNA במקומות ספציפיים בהחלט;

ב) אנזימים התופרים שברים במולקולת ה-DNA;

ג) אנזימים המספקים תרכובות המבצעות תיקון DNA.

2. הגברה של גנים:

3. איזו שיטה של ​​גנטיקה מולקולרית משמשת לאבחון מחלות הנגרמות על ידי גן מוטנטי ברצף ידוע?

א) שימוש באנזים הגבלה ספציפי;

ב) גילוי ישיר באמצעות בדיקות מולקולריות ספציפיות;

ג) ניתוח משפחתי של התפלגות פולימורפיזמים באורך שברי הגבלה נורמליים.

4. רצף DNA:

א) זיהוי רצף בסיסי ה-DNA;

ב) חזרות מרובות של כל קטע DNA;

ג) בידוד של קטע DNA המכיל את הגן הנחקר.

5. כדי להשיג דגימות DNA אתה יכול להשתמש :

ב) chorion villi;

ג) מי שפיר;

ד) תאים של מי שפיר;

ה) דגימות ביופסיה של עור, שרירים, כבד,

ה) הכל נכון חוץ מנקודה "ג",

ז) הכל נכון חוץ מנקודה "ד",

ח) כל האמור לעיל נכונים.

6. כדי לאבחן באילו מוטציות נעשה שימוש בשיטת PCR:

א) גנומי;

ב) כרומוזומלי;

ג) גן (נקודה).

7. הפריימר הוא:

א) קטע משלים של DNA;

ב) אוליגונוקלאוטיד סינטטי מסומן (רדיואקטיבי או פלואורסצנטי) רצף משלים לגן מוטנטי או תקין;

ג) אוליגונוקלאוטיד הפועל כ"פריימר" ומתחיל סינתזה של שרשרת פולינוקלאוטידים על מטריצת DNA או RNA.

8. מי פיתח את העיקרון של שיטת PCR?

ב) ק' מוליס

9. האם שיטת ה-PCR משמשת לאבחון התרחבות של חזרות טרינוקלאוטידים (סוג דינמי של מוטציה)?

10. באילו תחומים משתמשים ב-PCR?

א) רפואה קלינית;

ב) קביעת אורגניזמים מהונדסים (GMO)

ג) זיהוי אישי, הקמת אבהות, זיהוי פלילי

ד. כל התשובות נכונות,

ה) אף אחד מהאמור לעיל..

תשובות לדוגמא: 1 – א; 2 – ב; 3 – ב; 4 – א; 5 – ה; 6 - ב; 7 - ב; 8 – ב; 9 – א, 10 – גרם.

רָאשִׁי

1.בוצ'קוב גנטיקה. מוסקבה. GEOTAR, 2002.

נוֹסָף

1. , בכרב וטיפול במחלות מולדות ותורשתיות בילדים. - מוסקבה, 2004.

2. אבחון DNA וייעוץ גנטי רפואי. - מוסקבה, 2004.

3. גנטיקה של גינטר. - מוסקבה, 2003.

4. יסודות גורבונוב של גנטיקה רפואית. – סנט פטרסבורג: Intermedica, 1999.

5. ג'יי מקגי. אבחון קליני מולקולרי. – עולם, 1999.

6. מנשיקוב - מחקר ביולוגי באבחון מעבדה קליני: אפשרויות הבעיה (הרצאות). אבחון מעבדה קליני, מס' 3, 2006.

7. עבודתו של קורנינקו במעבדת ה-PCR במהלך ניתוח בליין של חומר ביולוגי. אבחון מעבדה קליני, מס' 10, 2006.

8. ארגון עבודת מעבדת ה-PCR. הוראות שיטתיות. MU 1.3.1794-03. רופא סניטרי ראשי של הפדרציה הרוסית, 2003.

9. טכנולוגיית ארליך ח.א. PCR. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. PCR כמותי בזמן אמת. Genome Res. – מס' 6, 1996.

עקרונות בסיסיים של השיטה

תגובת שרשרת פולימראז

מדריך מתודולוגי לעבודה חוץ כיתתית של סטודנטים בני 3-4 בהתמחויות רפואה כללית (060101) ורפואת ילדים (060103).

GOU VPO "האקדמיה הרפואית של מדינת קרסנויארסק של הסוכנות הפדרלית לבריאות ופיתוח חברתי"

רוסיה, קרסנויארסק,

עקרונות אבחון PCR

תַקצִיר

חלקים, 34 עמודים, 5 דמויות, 5 הפניות

מטרת עבודה זו היא סיכום קצר של העקרונות הבסיסיים והמאפיינים הטכנולוגיים של שיטת ה-PCR, יישומה המדעי והמעשי באבחון מחלות זיהומיות.

רשימת קיצורים קונבנציונליים

HCV - וירוס הפטיטיס C

dATP - deoxyadenosine triphosphate

dGTP - deoxyguanosine triphosphate

dNTP - deoxynucleotide triphosphate

dTTP - deoxythymidine triphosphate

dCTP - deoxycytosine triphosphate

DNA - חומצה דאוקסיריבונוקלאית

PCR - תגובת שרשרת פולימראז

RNA - חומצה ריבונוקלאית - מחלקת אימונוגלובולינים GTime PCR - שיטת PCR בזמן אמת

מבוא

עיקרון שיטת ה-PCR

שלבי ניתוח PCR

שיטת PCR בזמן אמת

יתרונות שיטת ה-PCR

מגבלות שיטת ה-PCR

יישום שיטת ה-PCR

סיכום

רשימת הפניות בשימוש

מבוא

גילוי שיטת תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) הפך בעשורים האחרונים לאחת הפיתוחים המדהימים ביותר בתחום הביולוגיה המולקולרית. זה איפשר להעלות את האבחון הרפואי לרמה חדשה מבחינה איכותית. העיקרון של שיטת תגובת שרשרת הפולימראז פותח על ידי קארי מוליס ב-1983. על פיתוח ניתוח PCR, ק. מוליס זכה בפרס נובל בכימיה בשנת 1993.

לאחר גילוי ה-PCR, הוא הוכנס מהר מאוד לפועל. השיטה הפכה לפופולרית עד כדי כך שכיום קשה לדמיין עבודה בתחום הביולוגיה המולקולרית ללא שימוש בה. שיטת PCR זכתה להתפתחות מהירה במיוחד הודות לתוכנית הגנום האנושי הבינלאומי. טכנולוגיות רצף לייזר מודרניות (פענוח רצפי נוקלאוטידים של DNA) נוצרו. אם בעבר האחרון לקח שבוע לפענח רצף DNA של 250 זוגות נוקלאוטידים (bp), רצפי לייזר מודרניים יכולים לקבוע עד 5000 bp. ביום. זה בתורו תורם לצמיחה משמעותית של מאגרי מידע המכילים רצפי DNA. נכון להיום, הוצעו שינויים שונים של PCR, הוכחה האפשרות ליצור מערכות בדיקה לאיתור מיקרואורגניזמים וזיהוי מוטציות נקודתיות ותוארו עשרות יישומים אפשריים של השיטה.

הופעתה של שיטת ה-PCR נבעה מהישגים מסוימים בתחום הגנטיקה המולקולרית, בעיקר פענוח רצף הנוקלאוטידים של הגנום של מספר מיקרואורגניזמים. יש לציין כי גילוי זה לווה בפיתוח של טכנולוגיות מסוימות. בפרט, הופעתם של מכשירים המאפשרים לסנתז אוטומטית שברי DNA חד-גדילי (אוליגונוקלאוטידים). באותה תקופה התגלו מיקרואורגניזמים ייחודיים החיים בגייזרים. המערכת האנזימטית שלהם, בפרט DNA פולימראז, עומדת בטמפרטורות הגבוהות של מעיינות חמים ושומרת על פעילותה הביולוגית עד 95 מעלות צלזיוס, שהיא תנאי הכרחי לביצוע תגובת השרשרת של הפולימראז.

תגובת שרשרת פולימראז היא כיום שיטת האבחון המתקדמת ביותר של ביולוגיה מולקולרית, גנטיקה מולקולרית ואבחון מעבדתי קליני, המאפשרת זיהוי של תאים בודדים של פתוגנים של מחלות זיהומיות רבות ברקמות ובנוזלים הביולוגיים של הגוף.

שיטת ה-PCR מבוססת על השלמה משלימה של קטע של DNA גנומי או RNA של הפתוגן, המתבצעת במבחנה באמצעות האנזים תרמו-יציב DNA פולימראז. הספציפיות של השיטה נקבעת על פי הייחודיות של החומר הגנטי של גורמי הזיהומים שהתגלו, שאליהם נבחרים הפריימרים של האוליגונוקלאוטידים המעורבים בתהליך ההגברה.

אבחון של מחלות זיהומיות, לרבות מחלות הנגרמות על ידי גורמים קשים לטיפוח, גנוטיפ של מיקרואורגניזמים, הערכת נגישותם, קביעת עמידות המיקרופלורה לאנטיביוטיקה, אבחון טרום לידתי, ניטור ביולוגי של מוצרי דם - זוהי רשימה חלקית של תחומי הרפואה באמצעות PCR. כיום, ניתוח PCR נותר הטכנולוגיה הנפוצה ביותר והמתפתחת באופן דינמי. מדי שנה מופיעות בשוק עשרות מערכות בדיקה חדשות לניתוח PCR, שנועדו גם לזהות את רצפי הנוקלאוטידים של מיקרואורגניזמים שונים הגורמים למחלות וגם לחקור גנים אנושיים. העלות של ניתוח PCR יורדת בהתמדה, מה שתורם לשימוש נרחב יותר ויותר בשיטה במוסדות רפואיים ואבחון. מספר מעבדות ה-PCR במדינות חבר העמים גדל באופן אקספוננציאלי, וככל הנראה, בעתיד הקרוב ניתוח PCR יהפוך לאחת משיטות האבחון המעבדתיות הנפוצות ביותר.

1. עיקרון שיטת ה-PCR

תגובת שרשרת פולימראז היא שיטה המחקה שכפול DNA טבעי ומאפשרת זיהוי של מולקולת DNA ספציפית אחת בנוכחות מיליוני מולקולות אחרות.

מהות השיטה היא להעתיק (להגביר) קטעים מסוימים של DNA במבחנה שוב ושוב במהלך מחזורי טמפרטורה חוזרים. בכל מחזור הגברה, שברים מסונתזים בעבר מועתקים שוב על ידי פולימראז של DNA. בשל כך, ישנה עלייה מרובה במספר שברי ה-DNA הספציפיים, מה שמפשט מאוד את המשך הניתוח.

שיטת ה-PCR מבוססת על תהליך טבעי - השלמה משלימה של מטריצת ה-DNA, המתבצעת באמצעות האנזים DNA פולימראז. תגובה זו נקראת שכפול DNA.

שכפול DNA טבעי כולל מספר שלבים:

) דנטורציה של DNA (התפתלות של הסליל הכפול, סטייה של גדילי DNA);

) יצירת קטעי DNA דו-גדיליים קצרים (פריימרים הדרושים לתחילת סינתזת DNA);

) סינתזה של גדיל DNA חדש (השלמה משלימה של שני הגדילים).

תהליך זה יכול לשמש לייצור עותקים של קטעים קצרים של DNA שהם ספציפיים למיקרואורגניזמים ספציפיים, כלומר. לבצע חיפוש ממוקד אחר אזורים ספציפיים כאלה, שהוא המטרה של אבחון גנים לזיהוי פתוגנים של מחלות זיהומיות.

גילוי של DNA פולימראז תרמי (Taq polymerase) מחיידקים תרמופילים Thermisaquaticus, שהאופטימום שבהם הוא באזור 70-72 מעלות צלזיוס, אפשרו להפוך את תהליך שכפול ה-DNA למחזורי ולהשתמש בו לעבודה במבחנה. יצירת תרמוסטטים (מגברים) הניתנים לתכנות, המבצעים שינויי טמפרטורה מחזוריים בהתאם לתוכנית נתונה, יצרה את התנאים המוקדמים להחדרה נרחבת של שיטת PCR לתרגול של אבחון קליני מעבדתי. עם חזרות מרובות של מחזורי סינתזה, מתרחשת עלייה אקספוננציאלית במספר העותקים של קטע DNA ספציפי, המאפשרת להשיג מספר מספיק של עותקי DNA לזיהוים מכמות קטנה של חומר מנותח, שעלול להכיל תאים בודדים. של מיקרואורגניזמים.

השלמת השרשרת המשלימה לא מתחילה בשום נקודה ברצף ה-DNA, אלא רק בבלוקים התחלתיים מסוימים - מקטעים דו-גדיליים קצרים. על ידי הצמדת בלוקים כאלה למקטעים ספציפיים של DNA, ניתן לכוון את תהליך הסינתזה של שרשרת חדשה רק בקטע זה, ולא לכל אורכה של שרשרת ה-DNA. כדי ליצור בלוקים התחלתיים במקטעי DNA נתונים, משתמשים בשני פריימרים של אוליגונוקלאוטידים (20 זוגות נוקלאוטידים), המכונים פריימרים. פריימרים משלימים לרצפי DNA על הגבול השמאלי והימני של מקטע מסוים ומכוונים בצורה כזו שהשלמת שרשרת DNA חדשה מתרחשת רק ביניהם.

לפיכך, PCR הוא עלייה מרובה במספר ההעתקים (הגברה) של אזור DNA ספציפי המזרז על ידי האנזים DNA פולימראז.

. שלבי ניתוח PCR

שיטת הניתוח בשיטת PCR כוללת שלושה שלבים:

1. בידוד של DNA (RNA) מדגימה קלינית;

2. הגברה של שברי DNA ספציפיים;

. איתור מוצרי הגברה.

. בידוד DNA (RNA).

בשלב זה של הניתוח, הדגימה הקלינית עוברת עיבוד מיוחד, שכתוצאה ממנו עובר ליז את החומר הסלולרי, מסירים שברי חלבון ופוליסכרידים ומתקבלת תמיסה של DNA או RNA, נקייה ממעכבים ומוכנה הגברה נוספת. בחירת טכניקת מיצוי ה-DNA (RNA) נקבעת בעיקר על פי אופי החומר הקליני המעובד.

2.הגברה של שברי DNA ספציפיים

בשלב זה מצטברים שברי DNA ספציפיים קצרים בכמות הדרושה לגילוי נוסף שלהם.

כדי לבצע תגובת שרשרת פולימראז, חייבים להיות קיימים בתערובת התגובה מספר רכיבים:

· פריימרים- אוליגונוקלאוטידים המסונתזים באופן מלאכותי, בדרך כלל בגודל של בין 15 ל-30 bp, זהים למקטעים המקבילים של DNA המטרה. הם ממלאים תפקיד מפתח ביצירת תוצרי תגובה הגברה. פריימרים שנבחרו בצורה נכונה מבטיחים את הספציפיות והרגישות של מערכת הבדיקה.

· Taq פולימראז- אנזים יציב תרמי המבטיח השלמת 3 - סוף גדיל ה-DNA השני לפי עקרון ההשלמה.

· תערובת של דיאוקסינוקלאוטיד טריפוספטים (dNTPs)- deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytosine triphosphate (dCTP) ו-deoxythymidine triphosphate (dTTP) - "חומר הבניין" המשמש את ה-Taq פולימראז לסינתזה של הגדיל השני של ה-DNA.

· מאגר -תערובת של קטיונים ואניונים בריכוז מסוים, המספקת תנאים אופטימליים לתגובה, כמו גם ערך pH יציב.

· מדגם מנותח- תכשיר שהוכן להוספה לתערובת התגובה, שעשוי להכיל את ה-DNA הרצוי, למשל, ה-DNA של מיקרואורגניזמים, המשמש מטרה להעתקה חוזרת לאחר מכן.

איור 1 מרכיבי תערובת התגובה

כל מחזור הגברה כולל 3 שלבים המתרחשים בתנאי טמפרטורה שונים:

שלב 1:דנטורציה של DNA (ביטול צמה של הסליל הכפול). מתרחש ב-93-95 מעלות צלזיוס למשך 30-40 שניות.

אחד המעגלים (+) משמש כמטריצה ​​הראשית. חמשת הקצוות שלו מקובעים על ידי האנזים DNA פולימראז, המבטיח בניית גדיל DNA שני, משלים לראשון, מנוקלאוטידים בודדים. אותו דבר, רק בכיוון ההפוך, קורה בגדיל השני של ה-DNA, אולם, מכיוון שההתפרקות של מולקולת ה-DNA מתרחשת בסדר הפוך, הגדיל החדש נבנה בשברים קטנים, אשר לאחר מכן נתפרים יחדיו. על מנת שהאנזים DNA פולימראז יתחיל את עבודתו, נדרשת נוכחות של זרע או פריימר - קטע DNA חד גדילי קטן, אשר כשהוא מחובר לאזור המשלים של אחד מגדילי ה-DNA האב, יוצר גוש מוצא. לגידול גדיל הבת.

שלב 2:הצמדת פריימרים (חישול). ההתקשרות של פריימרים מתרחשת משלימה לרצפים המתאימים על גדילי DNA מנוגדים בגבולות של אזור ספציפי. לכל זוג פריימרים יש טמפרטורת חישול משלו, שערכיה הם בטווח של 50-65 מעלות צלזיוס. טמפרטורת חישול פריימר מחושבת במדויק ומאומתת בניסוי היא אחד המאפיינים שקובעים את הספציפיות של התגובה, למעט ההתקשרות של פריימרים לרצפים משלימים שאינם שלמים.

מכיוון שגדילת גדילי DNA בת יכולה להתרחש בו-זמנית על שני הגדילים של DNA אימהי, ה-DNA פולימראז על הגדיל השני דורש גם פריימר משלו. לפיכך, שני פריימרים מתווספים לתערובת התגובה. למעשה, פריימרים, לאחר שהם מחוברים לגדילים ההפוכים של מולקולת ה-DNA, מגבילים את החלק שלה שישוכפל או יוגבר פעמים רבות לאחר מכן. שברי DNA כאלה נקראים אמפליקונים. אורכו של אמפליקון יכול להיות כמה מאות נוקלאוטידים. על ידי החלפת זוג פריימרים, נוכל לעבור מניתוח פתוגן אחד לניתוח אחר.

זמן חישול -20-60 שניות.

שלב 3:השלמת שרשראות DNA (התארכות).

מנגנון ההעתקה הוא כזה שתוספת משלימה של גדילים לא יכולה להתחיל בשום נקודה ברצף ה-DNA, אלא רק בלוקים התחלתיים מסוימים (קטעים דו-גדיליים קצרים). כדי ליצור בלוקים התחלתיים בקטעים נתונים של DNA, משתמשים בפריימרים שהם אוליגונוקלאוטידים באורך של כ-20 bp, הנקראים גם פריימרים. הם משלימים לרצפי ה-DNA על הגבול השמאלי והימני של מקטע מסוים ומכוונים בצורה כזו שסינתזת DNA המתבצעת על ידי DNA פולימראז מתרחשת רק ביניהם.

השלמה משלימה של שרשראות DNA ממשיכה מקצה 5' לקצה 3' של השרשרת בכיוונים מנוגדים, החל מאתרי ההתקשרות של הפריימר. החומר לסינתזה של שרשראות DNA חדשות הוא הפוספט ה-deoxyribonucleotide המוכנס. תהליך זה מזורז על ידי האנזים Tag polymerase. ה-DNA החדש שנוצר במחזור הראשון של הסינתזה משמש כחומר המוצא למחזור השני, בו נוצר קטע ה-DNA הספציפי הרצוי (אמפליקון) וכו'.

איור 2 עקרון הגברה של DNA

נכון לעכשיו, מספר שיטות משמשות להכנת דגימה ל-PCR. הליך הכנת הדגימה כולל תמוגה מיקרוביאלית ומיצוי חומצת גרעין. על מנת להשמיד את התא המיקרוביאלי, נעשה שימוש בהרתחה פשוטה, הקפאה-הפשרה בנוכחות ליזוזים, כמו גם מאגרי תמוגה מיוחדים המכילים חומרי ניקוי ופרוטאין. בחירת השיטה מוכתבת בדרך כלל על ידי אופי החיידק, ליתר דיוק, אופי דופן התא שלו. השיטה להשגת תכשיר DNA טהור, המתוארת על ידי B.R. Marmionetal, נחשבת לסטנדרטית וכבר הפכה לקלאסית. (1993). זה כרוך בפרוטאוליזה אנזימטית ואחריה דה-פרוטאין ומשקעים של DNA עם אלכוהול. שיטה זו מאפשרת להשיג תכשיר DNA טהור, אך היא די דורשת עבודה וכרוכה בעבודה עם חומרים אגרסיביים ובעלי ריח חזק כמו פנול וכלורופורם.

אחת הפופולריות ביותר היא שיטת מיצוי ה-DNA המוצעת על ידי R.Boometal. (1990), מבוסס על שימוש בחומר תמוגה חזק - guanidine thiocyanate (GuSCN) לתמוגגת תאים וספיגה לאחר מכן של DNA על נשא (חרוזי זכוכית, אדמה דיאטומית, "חלב" זכוכית וכו'). לאחר הכביסה, DNA נשאר בדגימה, נספג על הנשא, ממנו הוא מוסר בקלות באמצעות חיץ elution. השיטה נוחה, מתקדמת טכנולוגית ומתאימה להכנת דגימה להגברה. עם זאת, אובדן DNA אפשרי עקב ספיגה בלתי הפיכה על הנשא, כמו גם במהלך שטיפות רבות. זה חשוב במיוחד כאשר עובדים עם כמויות קטנות של DNA בדגימה. בנוסף, אפילו כמויות קטנות של GuSCN יכולות לעכב PCR, ולכן בעת ​​שימוש בשיטה זו חשובה מאוד הבחירה הנכונה של הסורבנט והקפדה על ניואנסים טכנולוגיים. יש לציין כי בשל ריבוי השלבים של הוספה והסרה של תמיסות, נדרשת זהירות בטיפול בדגימה, שכן זיהום צולב בין הדגימות לארוסול ה-DNA המתקבל אפשרי.

עם ההליך הקלאסי של מיצוי DNA פנול-כלורופורם, מושג טיהור DNA טוב, בעיקר ממעכבי Tag פולימראז, אך איבודים גדולים של חומצת גרעין הם בלתי נמנעים, בולט במיוחד כאשר עובדים עם דגימות קטנות עם ריכוז נמוך של הגורם הזיהומי.

קבוצה נוספת של שיטות הכנת דגימות מבוססת על שימוש במחליפי יונים כמו צ'ילקס (ארה"ב), שבניגוד לזכוכית, סופגים לא DNA, אלא זיהומים שמפריעים לתגובה. ככלל, טכנולוגיה זו כוללת שני שלבים: הרתחת המדגם וספיגה של זיהומים על מחליף יונים. השיטה אטרקטיבית ביותר בשל פשטות הביצוע שלה. ברוב המקרים הוא מתאים לעבודה עם חומר קליני. למרבה הצער, לפעמים יש דגימות עם זיהומים שלא ניתן להסיר באמצעות מחליפי יונים. בנוסף, לא ניתן להשמיד מיקרואורגניזמים מסוימים על ידי הרתחה פשוטה. במקרים אלה, יש צורך להציג שלבים נוספים של עיבוד מדגם.

במהלך הקרנה המונית, כאשר חשוב לקבל נתונים סטטיסטיים, ניתן להשתמש בשיטות פשוטות באמצעות חומרי ניקוי או טיפול בחומר ביולוגי באמצעות אלקליים ולאחר מכן לנטרל אותם. יחד עם זאת, השימוש בשיטות כאלה לאבחון קליני עלול להוביל לתוצאות שליליות כוזבות עקב שימוש בתכשיר DNA באיכות נמוכה בתערובת התגובה. לפיכך, יש לקחת בחשבון את בחירת שיטת הכנת הדגימה תוך הבנה של מטרות הניתוח המיועד.

במהלך ההליך הבא - הגברה - מכניסים למבחנה קטנה דגימה המכילה את ה-DNA של הפתוגן עם רכיבים המבטיחים את תגובת הפולימראז, שני סוגי פריימרים, שני אנזימים (Tag polymerase ו-N-uracil glycolase) וארבעה סוגים של נוקלאוטיד A, G, Ts, U. כדי לבצע את תגובת הפולימראז, נעשה שימוש במכשיר מיוחד (מחזור תרמי או מגבר DNA), המאפשר לשנות אוטומטית את הטמפרטורה של תערובת התגובה לפי תוכנית מסוימת. בסיבוב הראשון של PCR, הדגימה מחוממת לטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס כדי להפריד בין שני גדילי ה-DNA המשלימים. לאחר מכן הטמפרטורה יורדת ל-40-60 מעלות צלזיוס, בשלב זה הפריימרים מחוברים לגדיל DNA בודד, ולאחר מכן הטמפרטורה עולה שוב ל-72 מעלות צלזיוס, כאשר פעילות הפולימראז בולטת ביותר. כל המחזור עם שינויי טמפרטורה נמשך פחות מ-3 דקות.

כדי להעריך נכון תוצאות PCR, חשוב להבין ששיטה זו אינה כמותית. תיאורטית, ניתן לזהות תוצרי הגברה של מולקולות DNA מטרה בודדות באמצעות אלקטרופורזה לאחר 30-35 מחזורים. עם זאת, בפועל, הדבר נעשה רק במקרים בהם התגובה מתרחשת בתנאים קרובים לאידיאליים, דבר נדיר. למידת הטוהר של תכשיר ה-DNA יש השפעה רבה במיוחד על יעילות ההגברה, כלומר. נוכחות בתערובת התגובה של מעכבים מסוימים, שבמקרים מסוימים יכול להיות קשה מאוד להיפטר מהם. לפעמים, בשל נוכחותן, לא ניתן להגביר אפילו עשרות אלפי מולקולות DNA מטרה. לפיכך, לעתים קרובות אין קשר ישיר בין הכמות ההתחלתית של DNA המטרה לכמות הסופית של מוצרי ההגברה.

נעשה שימוש בשיטות שונות כדי להמחיש את תוצאות ההגברה. הנפוץ ביותר כיום הוא אלקטרופורזה, המבוססת על הפרדה של מולקולות DNA לפי גודל. לשם כך, מכינים צלחת של אגרוז ג'ל, אשר אגרוז מתמצק לאחר התכה במאגר אלקטרופורזה בריכוז של 1.5-2.5% בתוספת צבע DNA מיוחד, למשל אתידיום ברומיד. אגרוז מוצק יוצר סריג מרחבי. כאשר יוצקים באמצעות מסרקים, נוצרות בג'ל בארות מיוחדות, שאליהן מוסיפים לאחר מכן מוצרי הגברה. צלחת הג'ל ממוקמת במנגנון אלקטרופורזה ג'ל אופקי ומחבר מקור מתח קבוע. DNA טעון שלילי מתחיל לנוע בג'ל ממינוס לפלוס. במקרה זה, מולקולות DNA קצרות יותר נעות מהר יותר מאשר ארוכות יותר. מהירות תנועת ה-DNA בג'ל מושפעת מריכוז האגרוז, מעוצמת השדה החשמלי, מהטמפרטורה, מהרכב חיץ האלקטרופורזה ובמידה פחותה מהרכב ה-DNA. כל המולקולות באותו גודל נעות באותה מהירות. הצבע משולב (משולב) על ידי קבוצות מישוריות למולקולות DNA. לאחר השלמת האלקטרופורזה, הנמשכת בין 10 דקות לשעה, הג'ל מונח על מסנן טרנסילומינטר הפולט אור בתחום האולטרה סגול (254 - 310 ננומטר). אנרגיה אולטרה סגולה הנספגת ב-DNA ב-260 ננומטר מועברת לצבע, מה שגורם לו להאיר באזור הכתום-אדום של הספקטרום הנראה (590 ננומטר).

תקן ה-DNA של המיקרואורגניזם הרצוי משמש כ"בקרה חיובית". הגודל של אמפליקונים לא ספציפיים יכול להיות גדול יותר או קטן יותר בהשוואה ל"בקרה החיובית". במקרה הגרוע ביותר, גדלים אלו עשויים להתאים ונקראים כחיוביים באלקטרופורזה.

"שליטה חיובית" מאפשרת לך לוודא שכל הרכיבים הכלולים בתערובת התגובה מבטיחים התקדמות תקינה של התגובה. יחד עם זאת, תכשיר DNA שהוכן ל-PCR מחומר ביולוגי עשוי להכיל זיהומים של מעכבים, אשר מפחיתים משמעותית את יעילות התגובה, ובמקרים מסוימים מביאים להיעדר אמפליקונים ספציפיים גם בנוכחות הפתוגן הרצוי. יש צורך לעקוב אחר התקדמות ההגברה בכל מבחנה עם תערובת התגובה, עבורה נעשה שימוש במה שנקרא "בקרה פנימית" נוספת, שהיא כל תקן DNA שאינו דומה ל-DNA של המיקרואורגניזם הרצוי.

עבור מערכות בדיקה זיהומיות, לפעמים, למשל, נעשה שימוש בגן ​​p-globin, שבקצותיו תופרים באמצעות מניפולציות של הנדסה גנטית קטעי DNA ההומולוגיים לפריימרים הכלולים במערכת הבדיקה. אם "בקרה פנימית" מתווספת לתערובת התגובה, היא תהפוך לאותה מטרה עבור חישול פריימר כמו ה-DNA הכרומוזומלי של הגורם הזיהומי הרצוי. הגודל של תוצר הגברה הבקרה הפנימי נבחר כך שהוא גדול פי 2 או יותר מהאמפליקונים שנוצרו מהגברה של ה-DNA הרצוי של המיקרואורגניזם. כתוצאה מכך, אם מוסיפים לתערובת התגובה DNA "בקרה פנימית" יחד עם דגימת הבדיקה, אזי, ללא קשר להימצאות מיקרואורגניזם בדגימה הביולוגית, ה"בקרה הפנימית" תגרום להיווצרות אמפליקונים ספציפיים, אך ארוך משמעותית (כבד יותר) מהאמפליקון של המיקרואורגניזם. נוכחותם של אמפליקונים כבדים בתערובת התגובה מעידה על התקדמות תקינה של תגובת ההגברה ועל היעדר מעכבים. אם לא נוצרים אמפליקונים בגודל הנדרש ו"שליטה פנימית", אנו יכולים להסיק שיש זיהומים לא רצויים בדגימה המנותחת שיש לסלק, אך לא לגבי היעדר ה-DNA הרצוי.

למרות כל האטרקטיביות של גישה זו, יש בה פגם משמעותי. לפיכך, אם ה-DNA הרצוי קיים בתערובת התגובה, אזי יעילות ההגברה שלו יורדת בחדות עקב תחרות עם "הבקרה הפנימית" על פריימרים. זה חשוב ביסודו בריכוזי DNA נמוכים בדגימת הבדיקה ועלול להוביל לתוצאות שליליות שגויות. עם זאת, בתנאי שנפתרה בעיית התחרות על פריימרים, שיטה זו לניטור יעילות ההגברה בהחלט תהיה שימושית מאוד.

איור 3 מחזור שני של הגברה של DNA

. איתור מוצרי הגברה

). שיטת אלקטרופורזה אופקית

אחת השיטות להמחשת תוצאות ההגברה היא שיטת האלקטרופורזה, המבוססת על הפרדה של מולקולות DNA לפי גודל. ברוב השיטות, בשלב זה, תערובת תוצרי ההגברה המתקבלת בשלב השני מופרדת באלקטרופורזה אופקית בג'ל אגרוז. לפני ההפרדה האלקטרופורטית, מוסיפים לתערובת ההגברה תמיסה של אתידיום ברומיד, שיוצרת תרכובות ביניים חזקות עם שברי DNA דו-גדילי. תרכובות אלו מסוגלות להאיר תחת קרינת UV, הנרשמת בצורה של פסים זוהרים לאחר הפרדה אלקטרופורטית של תערובת ההגברה בג'ל אגרוז. הבהירות של פסי מוצר ההגברה עשויה להשתנות. לכן, לרוב נהוג במעבדות PCR להעריך את התוצאה באמצעות מערכת של שלוש, ארבע או חמש נקודות. עם זאת, זה לא יכול להיות קשור לכמות הראשונית של DNA המטרה בדגימה. לעתים קרובות, ירידה בבהירות הרצועות קשורה לירידה ביעילות ההגברה בהשפעת מעכבים או גורמים אחרים.

איור 4 איתור מוצרי הגברה באמצעות אלקטרופורזה אופקית

). שיטת אלקטרופורזה אנכית

שיטת האלקטרופורזה האנכית דומה ביסודה לאלקטרופורזה אופקית. ההבדל ביניהם הוא שבמקרה זה משתמשים בפוליאקרילאמיד במקום באגרוז. זה מתבצע בתא מיוחד לאלקטרופורזה אנכית. אלקטרופורזה של ג'ל פוליאקרילאמיד היא בעלת רזולוציה גבוהה יותר בהשוואה לאלקטרופורזה של אגרוז ומאפשרת להבחין בין מולקולות DNA בגדלים שונים בדיוק של נוקלאוטיד אחד. הכנת ג'ל פוליאקרילאמיד היא קצת יותר מסובכת מג'ל אגרוז. בנוסף, אקרילאמיד הוא חומר רעיל. מכיוון שהצורך לקבוע את גודלו של תוצר הגברה עם דיוק של 1 נוקלאוטיד מתעורר לעתים רחוקות, שיטה זו אינה משמשת בעבודה שגרתית.

3). שיטת בדיקה של הכלאה

כחלופה לשיטת הגילוי האלקטרופורטי, שיש לה כמה חסרונות: סובייקטיביות בקריאת התוצאות, מגבלות בקביעת ה-DNA של מיקרואורגניזמים שונים בתגובה אחת, ניתן להציע סכמות זיהוי הכלאה. בסכמות אלה, קטע ה-DNA שנוצר כתוצאה מהגברה מתכלה (יוצר קומפלקסים דו-גדילים - "כלאים") עם בדיקה ספציפית של אוליגונוקלאוטידים. רישום של קומפלקסים כאלה יכול להתבצע קולורימטרית או פלואורימטרית.

3. שיטת PCR בזמן אמת (PCR בזמן אמת)

שיטת Real-Time PCR מאפשרת לזהות תוצרי הגברה במהלך התגובה ולנטר את הקינטיקה של הצטברות האמפליקונים. כדי לזהות תוצר PCR, נעשה שימוש בצבעים פלואורסצנטיים המספקים פלואורסצנטי פרופורציונלי ישר לכמות תוצר PCR - קרינת כתב. המנגנונים ליצירתו משתנים בהתאם לסוג הספציפי של PCR בזמן אמת.

לעקומה הקינטית בקואורדינטות "רמת הקרינה של הכתב - מחזור הגברה" יש צורת S.

ניתן לחלק אותו לשלושה שלבים:

1.שלב ההתחלה (כאשר מוצרי PCR עדיין אינם מזוהים על ידי תווית ניאון).

2.שלב אקספוננציאלי (בו יש תלות אקספוננציאלית של כמות הקרינה במחזור ה-PCR).

.מישור (שלב הרוויה).

איור 5 גרף של עקומת הקרינה הקינטית באמצעות PCR בזמן אמת

רישום האות הפלורסנט מתבצע במהלך תהליך ההגברה במכשיר מיוחד - מחזור תרמי ל-Real-Time PCR. בהתבסס על העלייה בעוצמת האות הניאון, ריכוז תבנית ה-DNA הראשונית מחושב באמצעות התוכנה המסופקת עם המגבר.

יתרונות שיטת PCR בזמן אמת

נ היכולת לזהות הצטברות תוצרי הגברה ישירות במהלך ההגברה;

נ היתרון הבסיסי הוא היכולת לזהות הצטברות של אמפליקונים מבלי לפתוח את הצינור, מה שממזער את הסיכון לתוצאות חיוביות שגויות עקב זיהום של דגימות וריאגנטים עם מוצרי הגברה;

נ הפחתה משמעותית במספר המניפולציות עם מדגם הבדיקה מפחיתה את הזמן, מפשטת את הניתוח ומפחיתה את הסבירות לטעויות;

נ גישה זו מאפשרת לבטל את שלב האלקטרופורזה, מה שמוביל לירידה חדה בסבירות לזיהום דגימות הבדיקה במוצרי הגברה;

נ הפחתת הדרישות למעבדות PCR;

נ הגדלת האובייקטיביות של פרשנות תוצאות מחקר PCR, שכן העיבוד מתבצע באמצעות תוכנת המכשיר;

נ זמן המחקר הכולל מצטמצם באופן משמעותי, כמעט בחצי, ומאפשר קבלת התוצאות תוך 1.5 - 2 שעות לאחר הגעת החומר הקליני למעבדה;

נ שיטה זו מאפשרת לראשונה לכמת את תכולת ה-DNA של מיקרואורגניזם בדגימה קלינית;

נ השימוש בבדיקות הכלאה יחד עם פריימרים מגביר את הספציפיות של הניתוח;

נ האפשרות של רישום עצמאי בו-זמני של אות הפלורסנט ממספר בדיקות DNA הכלאה מאפשרת זיהוי במחקר אחד של מספר אזורים שונים של מטרות DNA זהות או שונות.

. יתרונות שיטת ה-PCR

נ זיהוי ישיר של פתוגנים של מחלות זיהומיות

שיטת PCR נותנת אינדיקציה ישירה לנוכחות של קטע DNA ספציפי של הפתוגן בחומר שנלקח מהמטופל.

נ ספציפיות גבוהה של PCR

בשיטת PCR מבודדים בחומר הנחקר קטע DNA שייחודי לפתוגן ספציפי - חיידק או וירוס. קטע DNA זה ייחודי ואינו אופייני לכל זיהום על פני כדור הארץ. הספציפיות נקבעת על ידי רצף הנוקלאוטידים של הפריימרים, מה שמבטל את האפשרות לקבל תוצאות שגויות, בניגוד לשיטת assay immunosorbent-linked enzyme, שבה שגיאות עקב אנטיגנים בעלי תגובה צולבת שכיחות.

נ PCR רגישות גבוהה

שיטת PCR מאפשרת לזהות אפילו תאים בודדים של חיידקים או וירוסים. אבחון PCR מזהה נוכחות של פתוגנים של מחלות זיהומיות במקרים בהם לא ניתן לעשות זאת בשיטות אחרות (אימונולוגיות, בקטריולוגיות, מיקרוסקופיות). הרגישות של ניתוח PCR היא 10-1000 תאים לדגימה (הרגישות של בדיקות אימונולוגיות ומיקרוסקופיות היא 103-105 תאים).

נ הרבגוניות של PCR

מכיוון שהפתוגן יכול להיכלל בכל הפרשות ורקמות ביולוגיות, מחקר PCR יכול להשתמש כמעט בכל חומר, כולל אלה שאינם נגישים למחקר בשיטות אחרות - ריר, שתן, דם, סרום, כיח, שפיכה, גרידות של תאי אפיתל.

נ מהירות גבוהה של השגת תוצאות ניתוח PCR

ניתוח PCR אינו מצריך בידוד וגידול תרבית של הפתוגן, דבר שלוקח זמן רב. שיטה מאוחדת לעיבוד ביולוגי ואיתור תוצרי תגובה ואוטומציה של תהליך ההגברה מאפשרים לבצע ניתוח מלא תוך 4-4.5 שעות.

נ יכולת לאבחן כל סוג של זיהום

הרגישות הגבוהה של שיטת ה-PCR מאפשרת לאבחן זיהום לא רק בשלב החריף של המחלה, אלא גם זיהומים כרוניים ואף נוכחות של חיידקים או וירוסים בודדים.

נכון לעכשיו, היתרון של ניתוח PCR על פני שיטת התרבות לגילוי מיקרואורגניזמים הוא הבא:

תדירות זיהוי גבוהה יותר של החיידק, העולה על אותו אינדיקטור בעת שימוש בשיטת התרבות ב-6-7%. הבדלים אלה מוסברים על ידי מוות אפשרי של החיידק במהלך אחסון והובלה, בעוד ש-PCR מסוגל לזהות צורות לא-קיימא של המיקרואורגניזם.

הזמן הנדרש לאיתור פתוגן בשיטת התרבית הוא כ-4 ימים, כאשר השימוש ב-PCR מאפשר זיהוי של החיידק תוך 4-5 שעות.

השימוש בטכנולוגיית PCR מאפשר זיהוי של פתוגנים, כמו כלמידיה, בדגימות הנלקחות באופן לא פולשני, כמו שתן.

שיטת ה-PCR יעילה במיוחד לאבחון צורות מיקרואורגניזמים קשות לגידול, בלתי ניתנות לתרבות ומתמשכות, אשר נתקלים לרוב בזיהומים סמויים וכרוניים, שכן בשיטה זו נמנעת הקשיים הכרוכים בגידול מיקרואורגניזמים כאלו בתנאי מעבדה.

נ אפשרות לביצוע ניטור והערכת יעילות הטיפול, במיוחד עבור מחלות ויראליות.

נ אפשרות לגילוי תת-סוגים וזנים בודדים של וירוסים וחיידקים.

נ אפשרות להגדרה מספר סוגים של פתוגנים (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) מצינור אחד עם חומר ביולוגי.

שיטה זו ניתנת להשוואה בעוצמת העבודה לשיטות קלאסיות (אימונואסאי אנזים, אימונופלואורסצנטי וכו'), אך מספקת מידע אבחוני אמין יותר, המאפשר זיהוי ישיר של DNA או RNA של גורם זיהומי בחומר קליני. לכן, שיטת ה-PCR, יחד עם שיטת התרבית, מוכרת כ"תקן הזהב" לאבחון מחלות זיהומיות.

5. מגבלות שיטת ה-PCR

· במהלך התגובה, ה-DNA של מיקרואורגניזמים חיים ומתים מוגבר

· אפשרות לתגובה צולבת

בחירת הפריימרים מבוססת על ידע קיים לגבי הגנום של מיקרואורגניזמים נתון ודומים לו. תיאורטית, קיימת אפשרות שאותו מקטע קיים במיקרואורגניזמים אחרים שהגנום שלהם לא פוענח כרגע ושלא נבדקו לאפשרות של תגובת צולבת. נוכחותם של מיקרואורגניזמים כאלה בדגימה עלולה להוביל לתוצאה חיובית שגויה של בדיקה.

· שונות של מיקרואורגניזמים

למרות שכאשר בונים מערכת בדיקה, קטע הגנום המשמש להגברה נבחר מאזור שמור מאוד, השונות של מיקרואורגניזמים יכולה להוביל לעובדה שחלק מהגנוטיפים או הזנים של הפתוגן הנחקר עשויים לרכוש מוטציות באזור המוגבר של הגנום. , ובכך הופכים חמקמקים עבור מערכת הבדיקה הזו.

שתי הנקודות האחרונות חשובות למפתחי ערכות אבחון PCR. כעת פותחו תקנים כדי להסדיר את כמות הבדיקות (כולל בדיקות לתגובות צולבות, כמו גם בדיקות של זנים ידועים של הפתוגן המתגלים) שמערכת בדיקה חייבת לעבור לפני שהיא מגיעה לשוק.

6. יישום שיטת ה-PCR

אבחון פולימראז מחלות זיהומיות

PCR משמש בתחומים רבים לניתוח וניסויים מדעיים:

1. זיהוי פלילי

PCR משמש להשוואת מה שנקרא "טביעות אצבע גנטיות". נדרשת דגימה של חומר גנטי מזירת הפשע - דם, רוק, זרע, שיער ועוד. זאת בהשוואה לחומר הגנטי של החשוד. מספיקה כמות קטנה מאוד של DNA, תיאורטית עותק אחד. ה-DNA מתפרק לשברים ואז מוגבר באמצעות PCR. הפרגמנטים מופרדים באמצעות אלקטרופורזה של DNA. הדפוס המתקבל של סידור להקות DNA נקרא טביעת אצבע גנטית.

2. קביעת אבהות

כאשר מנתחים את תוצאות האלקטרופורזה של שברי DNA שהוגברו באמצעות אב-ילד-אם PCR, מתגלה שהילד יירש כמה תכונות של ההחתמה הגנטית של שני ההורים, מה שנותן חותם ייחודי. למרות שטביעות אצבע גנטיות הן ייחודיות (למעט במקרה של תאומים זהים), עדיין ניתן ליצור קשרים משפחתיים על ידי לקיחת מספר טביעות אצבע. ניתן ליישם את אותה שיטה, לשנות מעט, כדי לבסס קשר אבולוציוני בין אורגניזמים.

3. אבחון רפואי

PCR מאפשר להאיץ ולהקל משמעותית את האבחנה של מחלות תורשתיות וויראליות. הגן המעניין מוגבר על ידי PCR באמצעות פריימרים מתאימים ולאחר מכן רצף לזיהוי מוטציות. ניתן לזהות זיהומים ויראליים מיד לאחר ההדבקה, שבועות או חודשים לפני הופעת התסמינים.

4. שיבוט גנים

שיבוט גנים הוא תהליך של בידוד גנים וכתוצאה ממניפולציות של הנדסה גנטית, השגת כמות גדולה מהתוצר של גן נתון. PCR משמש להגברת גן, אשר מוחדר לאחר מכן לווקטור - פיסת DNA המעבירה גן זר לתוך אותו אורגניזם או אחר הנוח לגידול. לדוגמה, פלסמידים או DNA ויראלי משמשים כווקטורים. החדרת גנים לאורגניזם זר משמשת בדרך כלל לייצור התוצר של אותו גן - RNA או, לרוב, חלבון. כך מתקבלים חלבונים רבים בכמויות תעשייתיות לשימוש בחקלאות, ברפואה וכו'.

5. רצף DNA

בשיטת הריצוף באמצעות dideoxynucleotides המסומנים בתווית פלואורסצנטית או איזוטופ רדיואקטיבי, PCR הוא חלק אינטגרלי, שכן במהלך הפילמור מוכנסות לשרשרת ה-DNA נגזרות של נוקלאוטידים המסומנים בתווית פלואורסצנטית או רדיואקטיבית. זה עוצר את התגובה, ומאפשר לקבוע את מיקומם של נוקלאוטידים ספציפיים לאחר הפרדת השרשראות המסונתזות בג'ל.

6. מוטגנזה

נכון לעכשיו, PCR הפך לשיטה העיקרית לביצוע מוטגנזה (שינוי רצף הנוקלאוטידים של ה-DNA). השימוש ב-PCR איפשר לפשט ולהאיץ את הליך המוטגנזה, כמו גם להפוך אותו לאמין וניתן לשחזור.

7. אבחון מחלות זיהומיות

לשימוש בשיטת PCR לאבחון מחלות זיהומיות בעלות אופי חיידקי ונגיפים כאחד, יש חשיבות עצומה לפתרון בעיות רבות של מיקרוביולוגיה ואפידמיולוגיה. השימוש בשיטה זו תורם גם לפיתוח מחקר בסיסי בתחום חקר מחלות זיהומיות כרוניות ולא מובנות.

8. אבחון מחלות ויראליות

ניתן להדגים את היתרונות המקיפים ביותר של PCR באבחון מחלות ויראליות על ידי התחשבות בתהליך הזיהומי הנגרם על ידי וירוס הפטיטיס C (HCV). PCR הוא בעל ערך אבחוני מיוחד לאיתור וירוס זה מהסיבות הבאות:

) היעדר שיטה לטיפוח HCV; 2) ערכות אבחון אנטיגן אינן קיימות; 3) התגובה של יצירת נוגדנים ל-HCV כל כך איטית עד שלא ניתן לבצע אבחנה במהלך השלב החריף של הזיהום, ככלל.

לכן, השימוש בטכנולוגיית PCR לאבחון, בקרת איכות הטיפול וניתוח אפידמיולוגי של תחלואה הנגרמת על ידי HCV הופך כעת למקובל.

יחד עם זאת, רק טכנולוגיית PCR מאפשרת לפתור את הבעיות הבאות: 1) אבחון זיהום חריף עם גילוי מאוחר של נוגדנים ל-HCV; 2) לבצע אבחון אטיולוגי של הפטיטיס C כרונית בחולים עם דיכוי חיסוני; 3) להעריך את היעילות של טיפול אנטי ויראלי; 4) לזהות וירמיה אצל תורמי דם עם רמות אמינוטרנספראז תקינות; 5) לקבוע זיהום אפשרי של מוצרי דם; 6) להעריך את השכיחות של HCV.

9. יישום של PCR בריאות ובפתיסיולוגיה

סיבה שכיחה לדלקת ריאות לא טיפוסית ולברונכיטיס כרונית חוזרת היא מיקופלזמה וכלמידיה. אבחון של פתוגנים אלה באמצעות שיטות מסורתיות של מיקרוסקופיה והתרבות חיידקים אינו יעיל. PCR מאפשר לא רק לאבחן כלמידיה ומיקופלסמוזיס, אלא גם לבצע זיהוי מינים של הפתוגן (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). השימוש בשיטת PCR יכול לשפר משמעותית את האבחנה המוקדמת של שחפת. נכון לעכשיו, ערכות PCR פותחו והופיעו בשוק כדי לקבוע את העמידות של מיקובקטריה לאנטיביוטיקה.

10. יישום PCR בפרקטיקה של שירותי הדם

בדיקת דם התורם לאיתור הפטיטיס, עגבת, HIV בשיטות סרולוגיות אינה שוללת את הסכנה של שימוש בדם נגוע עקב נוכחות של תקופה סרונגיטיבית מסוימת למחלות אלו, שיכולה להימשך עד מספר שבועות מרגע הופעת הפתוגן בדם. דָם. השיטה היעילה ביותר לבדיקת דם לנוכחות פתוגנים אלו היא שיטת PCR.

11. יישום PCR בניאונטולוגיה

מספר מיקרואורגניזמים יכולים להדביק את העובר במהלך ההריון. אלו הם ציטומגלווירוס, טוקסופלזמה, וירוס הרפס, וירוס אדמת, מיקופלזמה, כלמידיה ועוד. השימוש בבדיקות סרולוגיות לקביעת זיהומים אלו ביילודים אינו יעיל, שכן היווצרות מערכת החיסון של הילד מתרחשת במשך מספר חודשים, ונוכחות של גורם זיהומי לא יכול להיות מלווה בייצור של נוגדנים ספציפיים. מצד שני, נוגדנים אימהיים מקבוצת IgG עשויים להיות נוכחים בדם של יילוד במשך זמן רב, המסוגלים לחדור את מחסום השליה. לפיכך, נוכחות של IgG ספציפי אצל ילד בחודשי החיים הראשונים אינה מעידה על נוכחות של פתוגן. השימוש בניתוח PCR מגדיל באופן משמעותי את האפשרויות לאבחון זיהומים בילודים, לרבות בשלב התוך רחמי.

12. יישום PCR בפרקטיקה אורוגניקולוגית

בין הגורמים הזיהומיים המשפיעים על מערכת האורגניטל, ניתנה לאחרונה תשומת לב רבה לגורמים הגורמים לזיהומים סמויים וכרוניים - כלמידיה ומיקופלזמה. מחלות הנגרמות על ידי פתוגנים אלו מאופיינות בסימפטומים קליניים מטושטשים ובמהלך כרוני, המוביל לעיתים קרובות לפגיעה בתפקודי הרבייה - הפלה, אי פוריות. מחקרים רבים שבדקו את השימוש בשיטת PCR לאיתור כלמידיאטרכומטיס, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, שנערכו במרפאות גדולות במדינות שונות, הראו את היעילות הגבוהה של שיטה זו. ידוע שמבחינת רגישות ויעילות, PCR עדיף על שיטת התרבית, המקובלת כ"תקן הזהב".

סיכום

לפיכך, טכנולוגיית PCR היא כלי רב עוצמה המספק את היכולת ללמוד ולאבחן תהליכים זיהומיים כרוניים ואת האקולוגיה של פתוגנים של מחלות זיהומיות. שיטת האבחון PCR משלימה שיטות קיימות כבר לאבחון מיקרוביולוגי ומשנה באופן איכותי את המתודולוגיה לפתרון בעיות יישומיות של מיקרוביולוגיה ואפידמיולוגיה רפואית.

בהתחשב באמור לעיל, נגבש תחומי מחקר בפתולוגיה זיהומית, בהם PCR מתחיל לשחק תפקיד מוביל.

אבחון מצבים זיהומיים כרוניים הנגרמים על ידי התמדה של חיידקים או וירוסים. זהו היישום הברור ביותר של PCR למטרות אבחון.

PCR היא השיטה היעילה ביותר לזיהוי וחקר פתוגנים אשר, בהיותם במצב "לא מעובד", מסוגלים להתמיד שם, לשרוד תנאים חיצוניים לא נוחים.

PCR מאפשר קביעת עמידות לאנטיביוטיקה בחיידקים הגדלים לאט וקשים לטיפוח.

תחומים מבטיחים לשימוש מעשי באבחון PCR הם:

· אבחון מחלות אונקולוגיות;

· אבחון לוקמיה ולימפומות;

· אבחון סרטן השד;

· אבחון של מחלות ממאירות אחרות;

אבחון DNA של ניאופלזמות שפירות וממאירות מוגבל על ידי כמות קטנה אך הולכת וגדלה של מידע על הגנים הקשורים למחלות אלו;

· אבחון מחלות גנטיות.

אבחון של מחלות גנטיות יכול להתפתח רק בעקבות מחקר מדעי מקיף על הגנום האנושי. עם זאת, הקהילה הרפואית כבר הכירה בחשיבות של לימוד הבסיס הגנטי של מחלות, כמו גם את האפשרות לאבחן ולטפל במחלה לפני הופעת תסמיניה;

· זיהוי אישי: רפואה משפטית, קרימינולוגיה; השתלת איברים ורקמות; קביעת אבהות. מומחים מעריכים תחום זה של שוק אבחון ה-DNA כאחד הגדולים והצומחים ביותר;

משמש לעתים קרובות כשיטה מהירה לאינדיקציה וזיהוי של וירוסים.

שיטה זו פותחה לראשונה על ידי K. Mullis (ארה"ב) בשנת 1983. בשל רגישותה הגבוהה, הספציפיות וקלות היישום שלה, היא נמצאת בשימוש נרחב בגנטיקה, רפואה משפטית, אבחון ותחומים נוספים.

המהות של השיטה היא הגברה, כלומר הגדלת מספר העותקים של שברים מוגדרים בקפדנות של מולקולת DNA במבחנה. שיטה זו משתמשת במנגנון מטריציוני ובעקרון ההשלמה. שתי שרשראות פולינוקלאוטידים בודדות (חומצות גרעין) מסוגלות להיות מקושרות בקשרי מימן לשרשרת דו-גדילית אחת אם רצפי הנוקלאוטידים של אחת תואמים בדיוק את רצף הנוקלאוטידים של השניה, כך שהבסיסים החנקניים שלהן יכולים ליצור אדנין-תימין וגואנין-ציטוזין זוגות.

PCR מבוסס על הגברה של DNA באמצעות פולימראז DNA יציב תרמי, המסנתז גדילי DNA המשלימים זה את זה, החל משני פריימרים. פריימר הוא מקטע DNA המורכב מ-20-30 נוקלאוטידים. פריימרים אלה משלימים לגדילי ה-DNA ההפוכים. במהלך סינתזת ה-DNA, פריימרים מוכנסים לשרשרת מולקולות ה-DNA החדשות שסונתזו.

בדרך כלל PCR מבוצע ב-25-40 מחזורים. כל מחזור כולל שלושה שלבים: הראשון הוא דנטורציה ב-92-95 מעלות צלזיוס. במקרה זה, שני גדילי ה-DNA מתפצלים; השני הוא חישול, או הוספת פריימרים ב-50-65 מעלות צלזיוס; השלישי הוא התארכות, או פילמור ב-68-72 מעלות צלזיוס, בעוד DNA פולימראז מבצע השלמה משלימה של שרשראות תבנית ה-DNA באמצעות ארבעה סוגים של נוקלאוטידים. כתוצאה ממחזור אחד, החומר הגנטי הרצוי מוכפל. שרשראות ה-DNA שנוצרו במחזור הראשון משמשות כתבניות למחזור השני וכו'. לאחר המחזור הראשון, רק הפרגמנט בין שני הפריימרים מוגבר. לפיכך, מספר העותקים של האזור המוגבר מוכפל, מה שמאפשר לסנתז מיליוני (2 נ') שברי DNA ב-25-40 מחזורים - כמות המספיקה לאינדיקציה שלהם בשיטות שונות (שיטת בדיקות הכלאה המכילות בדיקה מסוימת תווית, אלקטרופורזה וכו'). לעתים קרובות יותר, נעשה שימוש באלקטרופורזה של ג'ל agarose עם מכתים אתידיום ברומיד למטרה זו.

ב-PCR מקטעי DNA של פתוגן, משתמשים בפריימרים בעלי רצף ייחודי של נוקלאוטידים האופייני רק לפתוגן מסוים.

ההליך לביצוע PCR מסתכם בדברים הבאים: מטריצת DNA מבודדת מהחומר הנחקר; במבחנה, ה-DNA המבודד משולב עם תערובת הגברה, הכוללת DNA פולימראז, כל 4 סוגי הנוקלאוטידים, 2 סוגי פריימרים, MgCl, חוצץ, מים מופחתים ושמן מינרלי. לאחר מכן מניחים את הצינורות במחזור, וההגברה מתבצעת באופן אוטומטי לפי תוכנית נתונה המתאימה לסוג הפתוגן. התוצאות מתועדות לעתים קרובות יותר על ידי אלקטרופורזה בג'ל אגרוז 1-2% בנוכחות אתידיום ברומיד, שמתחבר עם שברי DNA ומתגלה בצורה של פסים זוהרים כאשר הג'ל מוקרן בקרני UV על גבי מאיר. כל הליכי PCR נמשכים 1-2 ימי עסקים.

על מנת להגביר את הספציפיות והרגישות של PCR, נעשה שימוש באפשרויות שונות: PCR מקונן; PCR עם "התחלה חמה" באמצעות שכבת פרפין או חסימת המרכזים הפעילים של הפולימראז עם נוגדנים חד שבטיים. בנוסף, חברות מסוימות מייצרות ערכות ריאגנטים ליאופיל להגברת ה-DNA, שמאיצות את תהליך ה-PCR ומפחיתות את האפשרות לתוצאות חיוביות שגויות.

טכנולוגיה חדשה, Real-Time PCR, מוצגת כעת. התכונה הבסיסית שלו היא ניטור וניתוח כמותי של הצטברות תוצרי תגובת שרשרת פולימראז ורישום ופרשנות אוטומטית של התוצאות שהתקבלו. שיטה זו אינה מצריכה שלב אלקטרופורזה, מה שמפחית את דרישות המעבדה ל-PCR. PCR בזמן אמת משתמש בבדיקות אוליגונוקלאוטידים עם תיוג פלואורסצנטי כדי לזהות DNA בזמן שהוא מוגבר. PCR בזמן אמת מאפשר ניתוח מלא של דגימה תוך 20-60 דקות והוא תיאורטית דרך לזהות אפילו מולקולת DNA או RNA אחת בדגימה.

מערכת זיהוי המוצר בתגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (ניטור PCR) מאפשרת לך לנטר את הצטברות ה-DNA המוגבר מחזור אחר מחזור. המערכת כוללת גם בדיקה אוליגונוקלאוטידית המסוגלת להיצמד (להכליד) למקטע הפנימי של ה-DNA המטרה. הבדיקה מסומנת בקצה 5' בצבע כתב ניאון, ובקצה 3' עם צבע חוסם (צבע מרווה). כאשר תוצר ה-PCR מצטבר, הגשש הכלאה אליו, אך לא מתרחשת זוהר עקב הקרבה בין המדווח לחוסם. כתוצאה מהעתקת הרצף, הפולימראז מגיע לקצה 5′ של הבדיקה. פעילות 5'-3' exonuclease של הפולימראז מנתקת את תג הפלורסנט מקצה ה-3' של הבדיקה, ובכך משחררת את הכתב הפלורסנטי מהחיבור שלו עם חוסם האותות, מה שמוביל לעלייה בפלורסנטיות. רמת הקרינה היא אם כן פרופורציונלית לכמות תוצר התגובה הספציפי. חשוב שתוצאות ה-PCR ייקלטו על ידי נוכחות הקרינה בצינורות סגורים, ובכך נפתרת עוד אחת מהבעיות העיקריות של שיטה זו - בעיית הזיהום באמפליקונים.

יתרונות PCR: מהירות ניתוח; רגישות גבוהה וסגוליות; כמות מינימלית של חומר בדיקה; פשטות הביצוע ואפשרות לאוטומציה מלאה.

בשל העובדה שהרגישות של PCR יכולה להגיע עד לזיהוי עותק אחד של תבנית ה-DNA, קיימת רמה גבוהה של סכנה לקבלת תוצאות חיוביות כוזבות. לכן, בעת ביצוע בדיקת PCR, מעבדת אבחון גנטי חייבת לעמוד בקפדנות בדרישות מיוחדות לפריסה ומצב הפעלה.

PCR היא אחת השיטות המשלימות הקיימות באבחון וירולוגי. תגובה זו חשובה מאוד לאבחון של זיהומים ויראליים כאשר לא ניתן לזהות אנטיגנים ויראליים או נוגדנים ספציפיים לווירוס וכאשר נוכחות חומצת גרעין ויראלית עשויה להיות העדות היחידה לזיהום, במיוחד בזיהומים סמויים ומעורבים.

אם אתה מוצא שגיאה, אנא סמן קטע טקסט ולחץ Ctrl+Enter.

תגובת שרשרת הפולימראז ידועה כבר 30 שנה. הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים רבים, מארכיאולוגיה ועד גנטיקה.

שיטת ה-PCR היא שעוזרת לבסס אבהות, אך היא משמשת לרוב לזיהוי מחלות זיהומיות שונות בגוף האדם.

כיצד מתבצע ניתוח PCR, ומהו? ננסה לענות בפירוט על שאלות אלו.

ניתוח PCR - מה זה?

תגובת שרשרת פולימראז (PCR) היא שיטת אבחון גנטית מולקולרית בעלת דיוק גבוה המאפשרת לזהות מחלות זיהומיות ותורשתיות שונות בבני אדם, הן בשלב האקוטי והן בשלב הכרוני, והרבה לפני שהמחלה יכולה להתבטא.

שיטת ה-PCR היא ספציפית לחלוטין, ואם היא מבוצעת נכון, אינה יכולה לתת תוצאה חיובית כוזבת. כלומר, אם אין זיהום, אז הניתוח לעולם לא יראה שהוא קיים. לכן, עכשיו לעתים קרובות מאוד, כדי לאשר את האבחנה, הם גם לוקחים בדיקת PCR כדי לקבוע את הפתוגן ואת אופיו.

תגובת שרשרת הפולימראז (PCR) פותחה על ידי קארי מוליס (ארה"ב) בשנת 1983, ועליה הוענק לו פרס נובל לכימיה בשנת 1993.

מה היתרון בשיטה זו?

אבחון בשיטה זו מאפשר לך למצוא את הפתוגן ישירות בגן, הכלול בחומרים הנבדקים. זוהי הבדיקה המדויקת ביותר לזיהומים המועברים במגע מיני, זיהומים נסתרים ומחלות מין שונות.

הבדלים בין אבחון PCR ושיטות מחקר מעבדתיות אחרותהם כדלקמן:

• השיטה מכוונת לזיהוי הפתוגן עצמו;
• אבחון בשיטת PCR נבדל על ידי הרבגוניות שלו: לאיתור מספר פתוגנים;
• מחלות, מספיקה רק דגימה ביולוגית אחת של החולה;
• השיטה רגישה ביותר ואינה מלווה בתגובות צולבות אחרות.

בנוסף, היתרון של אבחון PCR הוא שכל חומר ביולוגי של המטופל מתאים לניתוח: דם, הפרשות איברי המין, שתן, זרע.

אילו זיהומים מריחת PCR יכולה לזהות?

מספר רב של גורמים זיהומיים עשויים להיות נוכחים בגוף, כולל "חבויים" שאינם באים לידי ביטוי במשך זמן רב.

ניתוח מריחת PCR מאפשר לך לזהות זיהומים כאלה:

• ureplasmosis של איברי המין;
• פַּטֶרֶת הַעוֹר();
• הֶרפֵּס;
• נוכחות של תאים סרטניים;
• להעריך מצב הורמונלי;

חומר הבדיקה ל-PCR הוא בדרך כלל כיח, רוק, שתן ודם. לפני ביצוע הניתוח, עליך להתכונן אליו בקפידה על ידי התייעצות תחילה עם רופא.

דם עבור PCR נתרם בדרך כלל על קיבה ריקה. תוצאות טובות מוצגות בניתוח כאשר החומר למחקר נלקח מתעלת צוואר הרחם או השופכה. במקרה זה, עדיף לבצע אבחון PCR לא יאוחר מיום אחד לאחר קיום יחסי מין.

סוגי PCR

PCR משמש בתחומים רבים לבדיקות וניסויים מדעיים. ישנן שיטות ניתוח שונות:

1. תעתיק הפוך PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - משמש להגברה, בידוד או זיהוי של רצף ידוע מספריית RNA.
2. PCR הפוך(Inverse PCR) - משמש כאשר ידוע רק אזור קטן בתוך הרצף הרצוי. שיטה זו שימושית במיוחד כאשר מדובר בקביעת רצפים שכנים לאחר הכנסת DNA לגנום.
3. Nested PCR משמש להפחתת מספר תוצרי הלוואי של התגובה. משתמשים בשני זוגות של פריימרים ומבוצעות שתי תגובות עוקבות.
4. PCR אסימטרי(eng. Asymmetric PCR) - מתבצע כאשר יש צורך להגביר בעיקר אחד מהגדילים של ה-DNA המקורי. משמש בכמה טכניקות ניתוח רצף והכלאה.
5. PCR כמותי(PCR כמותי, Q-PCR (אנגלית)) או PCR בזמן אמת - משמש לניטור ישיר של המדידה של כמות תוצר PCR ספציפי בכל מחזור תגובה.
6. שלב אחר שלב PCR (Touchdown PCR) - באמצעות גישה זו, ההשפעה של קשירת פריימר לא ספציפי מצטמצמת.
7. PCR ספציפי לקבוצה(eng. group-specific PCR) - PCR לרצפים קשורים באותו או בין מינים שונים, תוך שימוש בפריימרים שמרניים לרצפים אלו.

אם רצף הנוקלאוטידים של התבנית ידוע חלקית או לא ידוע בכלל, ניתן להשתמש בפריימרים מנוונים, שהרצף שלהם מכיל עמדות מנוונות בהן ניתן לאתר כל בסיס. לדוגמה, רצף הפריימר יכול להיות: ...ATH..., כאשר H הוא A, T או C.

אילו חומרים ביולוגיים נחקרים?

מדיות ביולוגיות שונות ונוזלים אנושיים יכולים לשמש חומר למחקר PCR, שבו ניתן לזהות DNA חיידקי זר או DNA ויראלי או RNA:

1. שֶׁתֶן. יכול לשמש לזיהומים בדרכי גניטורינאריות בגברים ובאיברי שתן בנשים (אצל גברים השימוש בשתן כחומר מחליף גרידה אפיתל).
2. ליחה. הוא משמש לאבחון שחפת, ובדרך כלל פחות, לאבחון צורות נשימתיות של כלמידיה ומיקופלסמוזיס. כיח בכמות של 15-20 מ"ל נאסף בבקבוק סטרילי (חד פעמי).
3. נוזלים ביולוגיים. מיץ ערמונית, פלאורל, עמוד השדרה, מי שפיר, נוזל מפרקים, שטיפה ברונכואלוואולרית, רוק נאספים על פי אינדיקציות.
4. גרידות אפיתל מקרומים ריריים. משמש בדרך כלל לאבחון מחלות המועברות במגע מיני (STDs), כגון זיבה, כלמידיה, mycoplasmosis, ureaplasmosis, trichomoniasis, gardnerelosis, הרפס וזיהומים אחרים המשפיעים על הממברנות הריריות.
5. ביופסיות. לרוב, ביופסיות של הקיבה והתריסריון משמשות לאיתור זיהום בהליקובקטר פילורי.
6. דם, פלזמה, סרום. משמש לניתוח PCR של הפטיטיס B, C, D, G, הרפס, CMV, נגיפי HIV ומחקר של גנים אנושיים.

איך להתכונן למבחן?

מהימנות תוצאת ה-PCR תלויה ישירות בהגשה נכונה של החומר לבדיקה. אסור לזהם את החומר, אחרת תוצאת המחקר לא תהיה אובייקטיבית. ההמלצות החשובות ביותר לפני ביצוע בדיקת PCR כוללות את הדרישות הבאות:

1. שתן נאסף בבוקר במיכל סטרילי.
2. יש לבצע בדיקת דם לזיהומים על בטן ריקה בבוקר.
3. אתה לא צריך להיות פעיל מינית יום לפני הבדיקה.

תוצאת הניתוח תהיה מוכנה 1.5-2 ימים לאחר ההליך המדובר. ישנם מצבים שבהם ניתן להכין את התוצאה עוד באותו היום.

פענוח של ניתוח OPC

תהליך פירוש המחקר המוצג נבדל בפשטותו. את תוצאות ניתוח ה-PCR ניתן לקבל 1.5-2 ימים לאחר הגשת החומר. במקרים מסוימים, התוצאה מוכנה כבר ביום הראשון, והנה משמעותם:

• תוצאה שליליתמראה שחומר האבחון אינו מכיל את הגורם הזיהומי הרצוי.
• PCR חיוביפירושו ש-DNA או RNA של הפתוגן נמצאים בגוף האדם.

במקרים מסוימים, מיקרואורגניזמים מכומתים. זה נכון במיוחד למחלות הנגרמות על ידי מיקרואורגניזמים אופורטוניסטיים. מכיוון שחיידקים אלה מציגים את השפעותיהם השליליות רק בכמויות מופרזות.

כמו כן, ניתוח PCR כמותי חשוב לבחירת טקטיקות טיפוליות ולצורך מעקב אחר הטיפול בזיהומים ויראליים כגון HIV ונגיפי הפטיטיס.

עד כמה מדויק אבחון PCR של זיהומים?

שיטת ה-PCR מאופיינת ברמת דיוק גבוהה, ספציפיות ורגישות. המשמעות היא שניתוח זה מסוגל:

• לקבוע במדויק את נוכחות או היעדר זיהום;
• לציין בדיוק איזה סוג של זיהום זה (ספציפיות);
• לזהות זיהום אפילו עם תכולת DNA מיקרוביאלית נמוכה מאוד בחומר ביולוגי,
• אשר נבדק (רגישות).

ניתוח PCR: מחיר ותנאים

המחיר של בדיקה ספציפית יהיה תלוי באיזה זיהום תיבדקו. מחירים ותנאים משוערים:

1. STI: 300-500 רובל, תנאים - יום אחד;
2. וירוס אפשטיין-בר, וירוס הפפילומה האנושי, הרפס, ציטומגלווירוס: 300-500 רובל, תנאים - יום אחד;
3. הפטיטיס A, B, C, D, G: ניתוח איכותי 650 רובל, ניתוח כמותי 2000 רובל. תנאים – עד 5 ימים;
4. נוגדנים לנגיף הפטיטיס C, סך הכל (אנטי-HCV) - 420 רובל;
5. נוגדנים לנגיף הפטיטיס C, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 רובל;
6. הליקובקטר פילורי: 300-400 רובל, תנאים - יום אחד;
7. HIV (נוגדנים ואנטיגנים) - 380 רובל;
8. HIV RNA, באיכות גבוהה - 3,500 רובל;
9. HIV RNA, כמותית - 11,000 רובל.

כדי לחסוך כסף, אתה יכול לבחור בחבילת ניתוח קבועה. שירות זה ניתן על ידי רוב המרפאות בהן ניתן להיבדק בשיטת PRC (אינביטרו, אונקליניק וכו').

ביצוע ניתוח PCR (אבחון PCR) מתחיל באיסוף חומר לבדיקה אצל רופא נשים, אורולוג או רופא עור. האיכות והאמינות של התוצאות שהתקבלו לאחר מכן מובטחות על ידי הכישורים הגבוהים ביותר והניסיון הרב של הרופאים של המרכז הרפואי Euromedprestige, העומדים בכל הכללים הדרושים לביצוע ניתוח PCR: סטריליות מלאה, שימוש בחומרים חד פעמיים בלבד.

החומר שנאסף מהמברשת מונח במיכל עם תמיסת מלח. לאחר האיסוף, יש להעביר דגימות למעבדת PCR בהקדם האפשרי.

ניתוח PCR מתבצע במעבדה בשלושה שלבים:

1. מיצוי DNA
2. הגברה של שברי DNA
3. איתור מוצרי הגברה של DNA

מיצוי DNA הוא השלב הראשוני של אבחון PCR, אשר מהותו היא כדלקמן: הרופא לוקח מהמטופל חומר למחקר ומעביר אותו לעיבוד מיוחד. במהלך העיבוד, הסליל הכפול של ה-DNA מפוצל לגדילים בודדים. לחומר של המטופל מוסיפים נוזל מיוחד הממיס חומרים אורגניים המפריעים ל"טוהר" התגובה. זה מסיר שומנים, חומצות אמינו, פפטידים, פחמימות, חלבונים ופוליסכרידים. כתוצאה מכך נוצר DNA או RNA.

העיקרון של שיטת ה-PCR הוא "בנייה" של זיהומי DNA או RNA חדשים. לא ניתן לעשות זאת מבלי להסיר את החומר הסלולרי.

משך הזמן המושקע בחילוץ DNA תלוי בגורם הסיבתי של הזיהום ובסוג החומר המשמש למחקר PCR. לדוגמה, זה לוקח 1.5-2 שעות להכין את הדם לשלב הבא.

0Array ( => ניתוח) מערך ( => 2) מערך ( =>.html) 2

הגברה של DNA

כדי לבצע את השלב הבא של אבחון ה-DNA - הגברה של ה-DNA - הרופאים משתמשים במטריצות ה-DNA המכונות - מולקולות DNA של זיהומים, שעליהן יתרחש לאחר מכן "שיבוט" של DNA. כבר הוזכר שאין צורך בנוכחות ה-DNA השלם של הזיהום, כדי לבצע שלב זה מספיקה חתיכה קטנה ממולקולת ה-DNA, האופיינית רק לחיידק נתון (זיהום).

הבסיס להגברת ה-DNA ובהתאם, הבסיס לכל עיקרון תגובת ה-PCR הוא התהליך הטבעי של השלמת ה-DNA לכל היצורים החיים – שכפול ה-DNA, המתבצע באמצעות הכפלת שרשרת DNA בודדת.

החל מקטע אחד בודד של DNA, רופא המעבדה מעתיק אותו ומגדיל את מספר העותקים במצב תגובת שרשרת: לאחר המחזור הראשון יש לך כבר 2 שברים, לאחר המחזור השני - 4, לאחר השלישי - 8, לאחר המחזור הראשון. רביעית - 16, ואז 32, 64, 128, 256... בכל מחזור מוכפל מספר העותקים, ואחרי עשרים מחזורים הספירה כבר נכנסת למיליונים, ואחרי שלושים - למיליארדים. המחזור נמשך מספר דקות ומצטמצם לשינוי מסוים בטמפרטורה בכור כימי קטן מאוד. כאן, בתמיסה, כל המרכיבים הדרושים לסינתזה נמצאים בכמות מספקת, קודם כל, נוקלאוטידים A, G, T ו-C, וגם פעולות כימיות הכנה עדינות מתבצעות כך שמיד נלקח עותק מדויק מכל אחד. קטע DNA סיים, ואז מהעותק הזה - שוב עותק, זו תגובת השרשרת המסועפת.

על ידי הצמדת פריימרים לשרשרת ה-DNA - "חתיכות" של DNA (זוגות נוקלאוטידים) מסונתזים באופן מלאכותי בדומה ל-DNA של חיידקים (זיהומים) - נוצרים שני סלילים קצרים המורכבים משני גדילים של קטעי DNA, הנחוצים לסינתזה של העתיד DNA.

הסינתזה של שרשרת חדשה מתרחשת על ידי השלמת כל אחד משני גדילי ה-DNA. תהליך ההגברה מתרחש בעזרת אזור ספציפי - DNA פולימראז, שנותן את השם לשיטת המעבדה. הפולימראז פועל כזרז לתגובה ומנטר את ההתקשרות הרציפה של בסיסי נוקלאוטידים לגדיל ה-DNA החדש שגדל.

לפיכך, הגברה של DNA היא עלייה מרובה במספר עותקי ה-DNA שהם ספציפיים, כלומר, הטבועים רק באורגניזם מסוים. אין צורך להשלים את כל שרשרת ה-DNA כדי לראות את הגורם המדבק. יש צורך רק באזור המאפיין חיידק נתון כפרט.

5360 לשפשף. עלות תכנית מקיפה עם גסטרואנטרולוג

הנחה 25% בפגישה עם קרדיולוג

- 25%יְסוֹדִי
ביקור רופא
מטפל בסופי שבוע

RUB 5,160 במקום 5,420 לשפשף. בדיקת גברים לזיהומים אורולוגיים

אלרגולוגיה RUB 5,120 במקום 5,590 לשפשף.

כל שלבי ההגברה החוזרים על עצמם מתרחשים בטמפרטורות שונות. כדי לבצע ניתוח PCR, נעשה שימוש בציוד הניתן לתכנות במיוחד - PCR - תרמוסטט או מגבר, אשר משנה טמפרטורות באופן אוטומטי. ההגברה מתבצעת על פי תוכנית נתונה המתאימה לסוג הזיהום המתגלה. בהתאם לתוכנית ולסוג הזיהום המתגלה, תהליך ה-PCR האוטומטי אורך בין שעתיים ל-3 שעות.

לכישוריו של רופא המעבדה המבצע את הניתוח תפקיד חשוב באבחון PCR, ההגדרות הנכונות של ציוד ה-PCR ופרשנות התוצאות תלויות בו. לרופאים במרכז הרפואי Euromedprestige ניסיון רב בביצוע אבחון DNA, המבטיח את מהימנות תוצאות המחקר ומבטיח הצלחה חיובית בטיפול במחלות זיהומיות. לעבור בדיקות PCR ולערוך אבחון וטיפול מלא במחלות זיהומיות במרכז הרפואי Euromedprestige שלנו.

במהלך זיהוי תוצרי הגברה, התערובת המתקבלת של תוצרי הגברה מופרדת. לתערובת מוסיפים תמיסות מיוחדות המעניקות לשברי ה-DNA יכולת הקרינה - המשתקפת בפסים זוהרים כתום-אדום. הזוהר המתקבל מעיד על נוכחות DNA של וירוסים, חיידקים או חיידקים בחומר שנלקח מהמטופל לצורך ניתוח PCR.