Reaksyon ng kadena ng polimer. Tingnan kung ano ang "PCR" sa ibang mga diksyunaryo

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy"

pinangalanang Yasenetsky Federal Agency for Health and Social Development »

Department of Medical Genetics at Clinical Neurophysiology IPO

BATAYANG MGA PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Metodolohikal na manwal para sa 3-4 na taong mag-aaral

sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at

Krasnoyarsk - 2007

Schneider, N. A., Butyanov, R. A. Mga pangunahing prinsipyo ng paraan ng reaksyon ng polymerase chain. Metodolohikal na manwal para sa ekstrakurikular na gawain ng 3-4 taong mga mag-aaral sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103). – Krasnoyarsk: Publishing house ng State Educational Institution of Higher Professional Education KrasSMA, 2007. – 42 p.

Ang manu-manong pagtuturo ay ganap na sumusunod sa mga kinakailangan ng State Standard (2000) at sumasalamin sa mga pangunahing aspeto ng modernong paraan ng pag-diagnose ng namamana na mga sakit ng tao - ang polymerase chain reaction method, ang materyal na pang-edukasyon ay inangkop sa mga teknolohiyang pang-edukasyon, na isinasaalang-alang ang mga detalye. ng pagsasanay sa 3-4 na taon ng mga medikal at pediatric faculties.

Mga Reviewer: Pinuno ng Department of Medical Genetics, Institusyon ng Edukasyon ng Estado ng Mas Mataas na Propesyonal na Edukasyon

"Novosibirsk State Medical University ng Federal Agency for Health and Social Development", Doctor of Medical Sciences, Propesor;

Pagtitiklop ng DNA

Ang object ng pag-aaral ng paraang ito ay Deoxyribonucleic acid (DNA). Ang DNA ay ang unibersal na tagapagdala ng genetic na impormasyon sa lahat ng mga organismo na umiiral sa Earth (maliban sa mga microorganism na naglalaman ng RNA). Ang DNA ay isang double strand na pinaikot sa isang helix. Ang bawat strand ay binubuo ng mga nucleotide na konektado sa pagkakasunud-sunod. Ang mga DNA strand ay may magkasalungat na direksyon: ang 5" dulo ng isang strand ay tumutugma sa 3" na dulo ng pangalawang strand. Ang isang natatanging katangian ng DNA ay ang kakayahang magdoble. Ang prosesong ito ay tinatawag na pagtitiklop. Ang pagtitiklop ng molekula ng DNA ay nangyayari sa panahon ng sintetikong interphase. Ang bawat isa sa dalawang kadena ng molekula ng "ina" ay nagsisilbing template para sa "anak na babae". Pagkatapos ng pagtitiklop, ang bagong synthesize na molekula ng DNA ay naglalaman ng isang "ina" na strand, at ang pangalawa ay isang bagong synthesize na "anak na babae" na strand (semi-conservative na pamamaraan). Para sa template synthesis ng isang bagong molekula ng DNA, kinakailangan na ang lumang molekula ay despiraled at pahabain. Nagsisimula ang pagtitiklop sa ilang lugar sa molekula ng DNA. Ang seksyon ng isang molekula ng DNA mula sa simula ng isang pagtitiklop hanggang sa simula ng isa pa ay tinatawag replicon.

Ang simula ng pagtitiklop ay isinaaktibo mga panimulang aklat(primer) na binubuo ng 100-200 na mga pares ng nucleotide. Ang DNA helicase enzyme ay nag-unwind at naghahati sa ina na DNA helix sa dalawang strand, kung saan, ayon sa prinsipyo ng complementarity, kasama ang pakikilahok ng DNA polymerase enzyme, ang "anak" na mga hibla ng DNA ay binuo. Upang simulan ng enzyme ang trabaho nito, kinakailangan ang pagkakaroon ng panimulang bloke - isang maliit na paunang double-stranded na fragment. Ang panimulang bloke ay nabuo sa pamamagitan ng pakikipag-ugnayan ng panimulang aklat sa komplementaryong rehiyon ng kaukulang strand ng parent DNA. Sa bawat replicon, ang DNA polymerase ay maaaring gumalaw kasama ang "ina" strand sa isang direksyon lamang (5`=>3`).

Sa nangungunang strand, habang ang replicon ay nag-unwind, ang isang "anak na babae" na strand ay unti-unting lumalaki. Sa lagging strand, nag-synthesize din ang daughter strand sa direksyon (5`=>3`), ngunit sa magkahiwalay na mga fragment habang nag-unwind ang replicon.

Kaya, ang pagdaragdag ng mga pantulong na nucleotides ng "anak na babae" na mga hibla ay nangyayari sa magkasalungat na direksyon (antiparallel). Ang pagtitiklop sa lahat ng mga replika ay nangyayari nang sabay-sabay. Ang mga fragment at bahagi ng "anak na babae" na mga hibla na na-synthesize sa iba't ibang mga replika ay tinatahi sa isang solong strand ng enzyme ligase. Ang pagtitiklop ay nailalarawan sa pamamagitan ng semi-conservativeness, antiparallelism at discontinuity. Ang buong genome ng isang cell ay ginagaya nang isang beses sa isang yugto ng panahon na tumutugma sa isang mitotic cycle. Bilang resulta ng proseso ng pagtitiklop, dalawang molekula ng DNA ang nabuo mula sa isang molekula ng DNA, kung saan ang isang strand ay mula sa molekula ng ina ng DNA, at ang pangalawa, anak na babae, na bagong synthesize (Fig. 1).

kanin. 1. Scheme ng pagtitiklop ng molekula ng DNA.

Kaya, kasama ang ikot ng pagtitiklop ng DNA tatlong pangunahing yugto:

1. unwinding ng DNA helix at divergence ng strands (denaturation);

2. paglakip ng mga panimulang aklat;

3. pagkumpleto ng kadena ng thread ng bata.

Prinsipyo ng pamamaraan ng PCR

Ito ay DNA replication na bumubuo sa batayan ng PCR. Sa PCR, ang mga proseso sa itaas ay isinasagawa sa isang test tube sa isang cyclic mode. Ang paglipat mula sa isang yugto ng reaksyon patungo sa isa pa ay nakakamit sa pamamagitan ng pagbabago ng temperatura ng pinaghalong incubation. Kapag ang solusyon ay pinainit sa 93-95°C, nangyayari ang DNA denaturation. Upang magpatuloy sa susunod na yugto - ang pagdaragdag o "pagsusubo" ng mga panimulang aklat - ang pinaghalong pagpapapisa ng itlog ay pinalamig sa 50-65°C. Susunod, ang timpla ay pinainit sa 70-72°C - ang pinakamabuting kalagayan para sa taq-DNA polymerase - sa yugtong ito ay nagaganap ang pagtatayo ng bagong DNA strand. Pagkatapos ay umuulit muli ang ikot. Sa ibang salita ang paraan ng PCR ay maraming pagtaas sa numero ng kopya (pagpapalakas) isang partikular na seksyon ng DNA na na-catalyze ng enzyme DNA polymerase.

Ang paglaki ng mga strand ng DNA ng anak na babae ay dapat mangyari nang sabay-sabay sa parehong mga hibla ng maternal DNA, kaya nangangailangan din ang pagtitiklop ng pangalawang strand ng sarili nitong primer. Kaya, dalawang panimulang aklat ang idinagdag sa pinaghalong reaksyon: isa para sa "+" na kadena, ang pangalawa para sa "-" na kadena. Ang pagkakaroon ng nakakabit sa kabaligtaran na mga hibla ng molekula ng DNA, nililimitahan ng mga panimulang aklat ang kanilang sarili sa bahagi nito na pagkatapos ay madodoble o mapapalaki ng maraming beses. Ang haba ng naturang fragment, na tinatawag na amplicon, ay karaniwang ilang daang nucleotides.

Mga yugto ng PCR

Ang bawat cycle ng amplification ay may kasamang 3 yugto, na nagaganap sa iba't ibang kondisyon ng temperatura (Larawan 2).

· Stage 1: denaturation ng DNA . Nangyayari sa 93-95° sa loob ng 30-40 segundo.

· Stage 2: panimulang pagsusubo . Ang attachment ng mga panimulang aklat ay nangyayari bilang pantulong sa kaukulang mga pagkakasunud-sunod sa kabaligtaran ng mga hibla ng DNA sa mga hangganan ng isang partikular na rehiyon. Ang bawat pares ng mga panimulang aklat ay may sariling temperatura ng pagsusubo, ang mga halaga nito ay nasa hanay na 50-65°C. Oras ng pagsusubo 20-60 seg.

· Stage 3: pagkumpleto ng mga chain ng DNA. Ang komplementaryong pagkumpleto ng mga chain ng DNA ay nangyayari mula sa 5" dulo hanggang 3" na dulo ng chain sa magkasalungat na direksyon, simula sa mga primer attachment site. Ang materyal para sa synthesis ng mga bagong DNA chain ay deoxyribonucleoside triphosphates na idinagdag sa solusyon. Ang proseso ng synthesis ay na-catalyzed ng enzyme taq polymerase at nagaganap sa temperatura na 70-72°C. Ang oras ng synthesis ay 20-40 segundo.

Ang mga bagong DNA chain na nabuo sa unang amplification cycle ay nagsisilbing template para sa ikalawang amplification cycle, kung saan nabuo ang isang partikular na DNA amplicon fragment (Fig. 3). Sa kasunod na mga cycle ng amplification, ang mga amplicon ay nagsisilbing template para sa synthesis ng mga bagong chain.

Kaya, ang akumulasyon ng mga amplicon sa solusyon ay nangyayari ayon sa formula 2", kung saan ang n ay ang bilang ng mga cycle ng amplification. Samakatuwid, kahit na ang paunang solusyon sa una ay naglalaman lamang ng isang double-stranded na molekula ng DNA, pagkatapos ay sa 30-40 na mga cycle tungkol sa 108 amplicon molecules ang naipon sa solusyon. Ito ang halaga ay sapat para sa maaasahang visual detection ng fragment na ito sa pamamagitan ng agarose gel electrophoresis.

Ang proseso ng amplification ay isinasagawa sa isang espesyal na programmable thermostat ( thermal cycler), na, ayon sa isang ibinigay na programa, ay awtomatikong nagbabago ng mga temperatura ayon sa bilang ng mga cycle ng amplification.

Upang maisagawa ang amplification, kinakailangan ang mga sumusunod na sangkap:

· DNA matrix(DNA o bahagi nito na naglalaman ng nais na tiyak na fragment);

· Mga panimulang aklat(synthetic oligonucleotides (20-30 nucleotide pairs), pantulong sa mga sequence ng DNA sa mga hangganan ng partikular na fragment na tinutukoy). Ang pagpili ng isang partikular na fragment at ang pagpili ng mga primer ay gumaganap ng isang kritikal na papel sa pagtitiyak ng amplification, na nakakaapekto sa kalidad ng pagsusuri.

· Pinaghalong deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)(isang pinaghalong apat na dNTP, na siyang materyal para sa synthesis ng mga bagong komplementaryong DNA chain sa katumbas na konsentrasyon na 200-500 µM)

· EnzymeTaq- polymerase(thermotable DNA polymerase na nag-catalyze sa pagpahaba ng mga primer chain sa pamamagitan ng sunud-sunod na pagdaragdag ng mga nucleotide base sa lumalaking chain ng synthesized DNA, 2-3 mM).

· Buffer solution(reaction medium na naglalaman ng Mg2+ ions na kailangan para mapanatili ang aktibidad ng enzyme, pH 6.8-7.8).

Upang matukoy ang mga partikular na rehiyon ng genome ng mga RNA virus, ang isang kopya ng DNA ay unang nakuha mula sa isang template ng RNA gamit ang isang reverse transcription (RT) na reaksyon na na-catalyze ng enzyme revertase (reverse transcriptase).

kanin. 2. Pagpapalakas (1st cycle).

kanin. 3. Pagpapalakas (2nd cycle).

Pangunahing aplikasyon ng PCR

· klinikal na gamot:

o diagnosis ng mga impeksyon,

o pagkilala sa mga mutasyon, kabilang ang diagnosis ng mga namamana na sakit,

o genotyping, kabilang ang HLA genotyping,

o mga teknolohiyang cellular

· ekolohiya (bilang isang paraan upang masubaybayan ang kalagayan at kalidad ng mga bagay sa kapaligiran at mga produktong pagkain)

· pagpapasiya ng mga transgenic na organismo (GMOs)

Personal na pagkakakilanlan, pagtatatag ng paternity, forensics

· pangkalahatan at tiyak na biology,

Mga pangunahing prinsipyo

organisasyon ng mga diagnostic na laboratoryo

Ang trabaho sa laboratoryo ng PCR ay isinasagawa alinsunod sa "Mga Panuntunan ng disenyo, pag-iingat sa kaligtasan, pang-industriya na kalinisan, rehimeng anti-epidemya at personal na kalinisan kapag nagtatrabaho sa mga laboratoryo (mga departamento, departamento) ng mga sanitary at epidemiological na institusyon ng sistema ng pangangalagang pangkalusugan.

Kontaminasyon ng mga sample ng DNA

Ang pagsasagawa ng mga diagnostic ng PCR ay nauugnay sa isang problema dahil sa mataas na sensitivity ng pamamaraan - ang posibilidad karumihan. Ang pagpasok ng mga bakas na halaga ng positibong DNA sa reaction tube (mga partikular na produkto ng amplification ng DNA - mga amplicon; pamantayan ng DNA na ginamit bilang positibong kontrol; positibong DNA mula sa isang klinikal na sample) ay humahantong sa pagpapalaki ng isang partikular na fragment ng DNA sa panahon ng PCR at, bilang isang resulta , sa paglitaw ng mga maling positibong resulta.

Sa proseso ng trabaho maaari kang makatagpo dalawang uri ng kontaminasyon:

1. cross contamination mula sa sample hanggang sa sample (sa panahon ng pagpoproseso ng mga klinikal na sample o kapag natunaw ang reaksyong timpla), na humahantong sa kalat-kalat na false-positive na mga resulta;

2. kontaminasyon sa mga produkto ng amplification(amplicons), na pinakamahalaga, dahil sa panahon ng proseso ng PCR, ang mga amplicon ay naiipon sa napakalaking dami at mga mainam na produkto para sa reamplification.

Ang kontaminasyon ng mga babasagin, mga awtomatikong pipette at kagamitan sa laboratoryo, ang ibabaw ng mga bangko ng laboratoryo, o kahit na ang ibabaw ng balat ng mga manggagawa sa laboratoryo na may mga bakas na dami ng mga amplicon ay humahantong sa mga sistematikong false-positive na resulta. Ang pagtukoy sa pinagmulan ng kontaminasyon ay maaaring napakahirap at nangangailangan ng malaking pamumuhunan ng oras at pera. Ang karanasang natamo hanggang sa kasalukuyan sa mga laboratoryo gamit ang paraan ng PCR para sa mga diagnostic ay nagpapahintulot sa amin na bumalangkas ng mga pangunahing kinakailangan para sa organisasyon ng naturang mga laboratoryo at ang pagsasagawa ng mga pagsusuri mismo. Ang pagsunod sa mga kinakailangang ito ay nag-aalis ng posibilidad ng kontaminasyon at mga maling positibong resulta.

Mga yugto ng pagsusuri sa PCR

Ang mga ito ay heograpikal na pinaghihiwalay sa pamamagitan ng paglalagay sa kanila sa magkahiwalay na mga silid (Larawan 4, 5):

· Pre-PCR room, kung saan pinoproseso ang mga klinikal na sample, ibinubukod ang DNA, inihahanda ang isang reaksyong timpla para sa PCR, at isinagawa ang PCR (kung may mga kundisyon, inirerekomenda din ang huling dalawang yugto na isagawa sa karagdagang hiwalay na silid). Sa mga lugar na ito, ipinagbabawal na isagawa ang lahat ng iba pang uri ng trabaho sa mga ahente ng pagsubok, ang mga diagnostic ng PCR na kung saan ay isinasagawa sa laboratoryo na ito.

· Post-PCR room, kung saan ang pagtuklas ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa. Maaaring gumamit ng iba pang paraan ng pagtuklas sa kuwartong ito. Maipapayo na hanapin ang silid ng pagtuklas ng produkto ng amplification hangga't maaari mula sa mga silid ng pre-PCR.

Ang mga workroom ay nilagyan ng mga ultraviolet lamp na may maximum na radiation sa rehiyon na 260 nm (uri ng DB-60) sa rate na 2.5 W bawat 1 m3. Ang mga lamp ay matatagpuan upang ang mga ibabaw ng work table, kagamitan at materyales kung saan ang operator ay nakikipag-ugnayan sa panahon ng pagsusuri ng PCR ay nalantad sa direktang pag-iilaw. Ang pag-iilaw ay isinasagawa sa loob ng 1 oras bago simulan ang trabaho at sa loob ng 1 oras pagkatapos matapos ang trabaho.

Ang mga doktor sa laboratoryo ay nagtatrabaho sa mga espesyal na damit sa laboratoryo, na binago kapag lumilipat mula sa isang silid patungo sa isa pa, at sa mga disposable na guwantes. Ang mga damit mula sa iba't ibang kuwarto ay pinoproseso nang hiwalay. Ang iba't ibang empleyado ay nagtatrabaho sa iba't ibang yugto ng pagsusuri sa PCR.

Para sa trabaho, hiwalay na mga hanay ng mga dispenser, plastik at babasagin, kagamitan sa laboratoryo, gown at guwantes ay ginagamit, na nilayon para sa iba't ibang yugto ng pagsusuri at hindi portable mula sa isang silid patungo sa isa pa. Ang mga kagamitan, materyales at suplay sa bawat silid ay angkop na minarkahan.

Ang lahat ng mga yugto ng trabaho ay isinasagawa lamang gamit ang mga disposable consumable: mga tip para sa mga awtomatikong pipette, test tube, guwantes, atbp. Siguraduhing baguhin ang mga tip kapag lumilipat mula sa sample patungo sa sample. Kinakailangang gumamit ng mga tip na may filter - isang aerosol barrier upang maiwasan ang pagpasok ng mga microdroplet ng solusyon sa pipette. Ang mga ginamit na tubo at tip ay itinatapon sa mga espesyal na lalagyan o lalagyan na naglalaman ng solusyon sa disinfectant. Ang mga klinikal na sample ay nakaimbak nang hiwalay sa mga reagents.

Upang iproseso at linisin ang lugar ng trabaho, ang bawat silid ay nilagyan ng cotton-gauze swabs (wipes), tweezers, disinfectant at inactivating solution.

Ibinubukod ng diagnostic laboratory ng PCR ang mga gawaing nauugnay sa paggawa (pag-clone) at paghihiwalay ng mga recombinant na plasmid na naglalaman ng mga pagkakasunud-sunod ng DNA o mga fragment ng gene ng mga pathogen na na-diagnose sa laboratoryo na ito.

Koleksyon ng mga klinikal na materyal

Ang materyal na pag-aaralan para sa PCR ay maaaring mga scrapings ng epithelial cells, dugo, plasma, serum, pleural at cerebrospinal fluid, ihi, plema, mucus at iba pang biological secretions, biopsy.

Ang materyal ay kinokolekta sa isang silid ng paggamot ng naaangkop na profile. Pagkatapos ng koleksyon, ang mga sample ay dapat maihatid sa PCR diagnostic laboratory sa lalong madaling panahon.

Ang mga sample ay dapat kunin gamit ang sterile, mas mainam na disposable, mga instrumento lamang sa disposable sterile plastic tubes o glass tubes, pre-treated para sa isang oras na may chromium mixture, lubusang hugasan ng distilled water at calcined sa isang drying cabinet sa temperatura na 150°C para sa 1 oras.

Detection zone (ibang palapag o ibang gusali).

kanin. 4. PCR laboratory device na may detection sa pamamagitan ng electrophoresis.

Detection zone (ibang palapag o ibang gusali)

kanin. 5. PCR laboratory device na may fluorescent detection (quantitative analysis).

kanin. 6. Kwarto ng pagkuha ng DNA. Ang ipinapakita ay isang tabletop box na may germicidal lamp.

kanin. 7. Amplification room.

kanin. 8. Detection room.

kanin. 9. Mga sample ng dugo para sa mga diagnostic ng DNA ng mga namamana na sakit.

Sample na imbakan at transportasyon

Upang masuri ang mga namamana na sakit, ang mga sample ng dugo ay naka-imbak sa mga espesyal na form ng papel o sa mga epindorf (plastic tubes) sa isang frozen na estado sa loob ng mahabang panahon (Larawan 9).

Upang masuri ang mga nakakahawang sakit, ang mga sample ay pinananatili sa temperatura ng silid nang hindi hihigit sa 2 oras. Kung kailangan ng mas mahabang imbakan, ang mga sample ay maaaring ilagay sa refrigerator sa temperatura na 2-8°C sa loob ng hindi hihigit sa isang araw. Ang mas mahabang pag-iimbak (hanggang 2 linggo) ay pinahihintulutang frozen sa isang freezer sa temperatura na minus 20°C. Ang paulit-ulit na pagyeyelo at pagtunaw ng mga sample ay hindi pinapayagan.

Kung ang laboratoryo ng diagnostic ng PCR at ang silid ng pamamaraan para sa sampling ay heograpikal na pinaghihiwalay, kung gayon ang transportasyon ng mga sample ay dapat isagawa sa mga thermoses o thermal container bilang pagsunod sa mga patakaran para sa pag-iimbak ng mga sample at ang mga patakaran para sa pagdadala ng mga nakakahawang materyales.

Pagkuha ng DNA mula sa mga sample

Ang solid-phase sorption method ay naging laganap, na binubuo ng pagdaragdag ng lysis agent na naglalaman ng guanidine solution, sorption ng DNA sa isang sorbent, paulit-ulit na paghuhugas at resorption ng DNA na may buffer solution. Kapag nagpoproseso ng serum, plasma o buong dugo, kadalasang ginagamit ang paraan ng pagkuha ng phenol. Ang pamamaraan ay nagsasangkot ng deproteinization na may phenol/chloroform na sinusundan ng DNA (o RNA) precipitation na may ethanol o isopropanol. Ang pagproseso ay isinasagawa sa Eppendor P microcentrifuge tubes na may dami na 1.5 ml. Ang oras ng pagproseso ay 1.5-2 na oras (Larawan 10).

kanin. 10. Pagkuha ng DNA.

Pagsasagawa ng PCR

Ang isang tiyak na halaga ng sample mula sa naprosesong klinikal na sample ay inilipat sa isang espesyal na microcentrifuge tube ng uri ng Eppendorf na may dami na 0.2 o 0.5 ml. Ang isang amplification mixture na binubuo ng tubig, PCR buffer, dNTP solution, primer solution at solusyon ay idinagdag sa ang parehong tubo. Taq polymerase (idinagdag sa huling pinaghalong). Karaniwan, ang dami ng pinaghalong reaksyon ay 25 µl. Pagkatapos ay isang patak ng mineral na langis ang idinaragdag sa bawat tubo upang maiwasan ang pagsingaw ng pinaghalong reaksyon sa panahon ng proseso ng amplification. Ang ang mga tubo ay inililipat sa isang programmable thermostat (amplifier), kung saan awtomatikong isinasagawa ang amplification ayon sa isang ibinigay na programa (Fig. 11).

kanin. labing-isa. amplifier" Thermocycler ».

Ang oras ng reaksyon, depende sa tinukoy na programa, ay 2-3 oras. Kaayon ng mga pang-eksperimentong sample, ang mga control sample ay inilalagay: ang positibong kontrol ay kinabibilangan ng lahat ng bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na ang klinikal na sample na materyal, isang control DNA na paghahanda ng gene na pinag-aaralan ay idinagdag. Kasama sa negatibong kontrol ang lahat ng bahagi ng reaksyon, ngunit sa halip na klinikal na materyal o paghahanda ng DNA, isang naaangkop na dami ng deionized na tubig o isang katas na hindi naglalaman ng DNA na sinusuri ay idinagdag. Ang negatibong kontrol ay kinakailangan upang suriin ang mga bahagi ng reaksyon para sa kawalan ng DNA dahil sa kontaminasyon at upang ibukod ang mga maling positibong resulta.

Pagpaparehistro ng mga resulta

Ang amplified specific DNA fragment ay nakita ng agarose gel electrophoresis sa pagkakaroon ng ethidium bromide. Ang ethidium bromide ay bumubuo ng isang matatag na interstitial compound na may mga fragment ng DNA, na lumilitaw sa anyo ng mga makinang na banda kapag ang gel ay na-irradiated ng UV radiation na may wavelength na 290-330 nm. Depende sa laki ng mga amplicon na nabuo bilang isang resulta ng PCR, isang gel na may agarose na nilalaman na 1.5% hanggang 2.5% ay ginagamit. Upang maghanda ng agarose gel, ang isang halo ng agarose, buffer at tubig ay natunaw sa isang microwave oven o sa isang paliguan ng tubig, at isang solusyon ng ethidium bromide ay idinagdag. Ang halo, na pinalamig sa 50-60 ° C, ay ibinuhos sa amag sa isang layer na 4-6 mm ang kapal at, gamit ang mga espesyal na suklay, ang mga bulsa ay ginawa sa gel para sa paglalapat ng sample. Ang mga suklay ay naka-install sa paraang ang isang 0.5-1 mm na layer ng agarose ay nananatili sa pagitan ng ilalim ng mga balon at ng base ng gel. Matapos tumigas ang gel, ang amplifier ay inilapat sa mga bulsa sa halagang 5-15 μl. Inirerekomenda na magsagawa ng electrophoresis ng isang pinaghalong mga marker ng haba ng fragment ng DNA na kahanay sa mga kontrol at eksperimentong sample. Karaniwan, ang naturang halo ay naglalaman ng sampung mga fragment ng DNA na may haba na 100, 200, 300, atbp. na mga pares ng base.

Ang paggamit ng naturang pagsubok ay ginagawang posible na i-verify ang haba ng mga amplicon sa kontrol at mga eksperimentong sample. Ang gel na may inilapat na sample ay inilipat sa isang electrophoresis chamber na puno ng buffer, ang kamara ay konektado sa isang pinagmumulan ng kapangyarihan at ang electrophoretic na paghihiwalay ng mga produkto ng amplification ay isinasagawa sa loob ng 30-45 minuto sa lakas ng electric field na 10-15 V/ cm. Sa kasong ito, ang harap ng tina na kasama sa pinaghalong reaksyon ay dapat maglakbay nang hindi bababa sa 3 cm.

Matapos makumpleto ang electrophoresis, ang gel ay inilipat sa isang glass transilluminator at tiningnan sa ilalim ng ultraviolet light. Para sa dokumentasyon, ang gel ay nakuhanan ng larawan sa Micrat 300 film o naitala gamit ang isang video system na nakakonekta sa isang computer.

Una sa lahat, sinusuri ang mga sample ng kontrol. Ang isang orange na kumikinang na banda ay dapat na naroroon sa electrophoretic track na naaayon sa positibong kontrol. Ang electrophoretic mobility nito ay dapat na tumutugma sa haba ng amplicon na tinukoy sa mga tagubilin.

Sa electrophoretic track na naaayon sa negatibong kontrol, ang naturang banda ay dapat na wala. Ang pagkakaroon ng naturang banda sa negatibong kontrol ay nagpapahiwatig ng kontaminasyon - kontaminasyon ng mga reagents na ginamit sa pagsubok na DNA o amplicon. Ang mga sample ng pagsubok ay tinatasa sa pamamagitan ng pagkakaroon ng isang banda sa kaukulang track, na matatagpuan sa parehong antas ng banda sa positibong control sample. Ang intensity ng banda ay tumutugma sa dami ng DNA na sinusuri sa sample, na nagbibigay-daan para sa isang semi-quantitative na pagtatasa ng PCR. Karaniwan, ang mga positibong resulta ay tinatasa sa isang sukat na apat na puntos. Kung ang glow ng banda sa sample ng pagsubok ay napakahina, kung gayon ang gayong sample ay dapat na muling ayusin (Larawan 12).

kanin. 12. Agarose gel electrophoresis.

Mga aplikasyon ng PCR para sadiagnostic ng point mutations at gene polymorphism

Ang isa sa mga nangungunang lugar ng aplikasyon ng PCR sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan ay ang diagnosis ng point mutations at gene polymorphism . May mga direkta at hindi direktang pamamaraan ng mga diagnostic ng DNA. Sa mga sitwasyon kung saan kilala ang isang gene, ang pinsala na humahantong sa pag-unlad ng isang namamana na sakit, ang pinsalang ito ay maaaring makita ng mga molecular genetic na pamamaraan. Ang ganitong mga pamamaraan ay tinatawag na direkta. Gamit ang mga direktang pamamaraan, ang mga iregularidad sa pangunahing nucleotide sequence ng DNA (mutations at kanilang mga uri) ay nakita. Ang mga direktang pamamaraan ay nailalarawan sa pamamagitan ng katumpakan na umaabot sa halos 100%.

Gayunpaman, sa pagsasagawa, ang mga pamamaraang ito ay maaaring gamitin sa ilalim ng ilang mga kundisyon:

· may kilalang cytogenetic localization ng gene na responsable para sa pagbuo ng isang namamana na sakit;

· ang gene ng sakit ay dapat na ma-clone at alam ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide nito.

Ang layunin ng direktang pagsusuri ng DNA ay upang matukoy ang mga mutant alleles.

Kaya, sa mga sitwasyon kung saan alam kung anong uri ng pinsala sa DNA ang humahantong sa isang namamana na sakit, ang DNA fragment na naglalaman ng pinsala ay direktang sinusuri, ibig sabihin, ang direktang paraan ng diagnostic ng DNA ay ginagamit.

Gayunpaman, hanggang ngayon, ang mga gene ng maraming sakit ay hindi pa namamapa, ang kanilang exon-intron na organisasyon ay hindi kilala, at maraming mga namamana na sakit ay nailalarawan sa pamamagitan ng binibigkas na genetic heterogeneity, na hindi pinapayagan ang buong paggamit ng mga direktang pamamaraan ng diagnostic ng DNA. Samakatuwid, sa mga kaso kung saan ang lokalisasyon ng pinsala ay hindi alam, ang isa pang diskarte ay ginagamit, na may kaugnayan sa pag-aaral ng paligid ng gene na responsable para sa sakit sa gene, kasama ang pagsusuri ng pamilya, iyon ay, hindi direktang pamamaraan ng molekular genetic diagnosis ng ang mga namamana na sakit ay ginagamit.

Maaaring gamitin ang iba't ibang pamamaraan upang makita ang mga mutasyon ng punto at maliliit na pagtanggal, ngunit lahat sila ay umaasa sa paraan ng PCR. Ang reaksyong ito ay nagpapahintulot sa iyo na i-multiply ang DNA nucleotide sequence ng maraming beses at pagkatapos ay maghanap ng mga mutasyon. Ang mga pamamaraan para sa paghahanap ng mga fragment ng DNA na nagdadala ng mga mutasyon ay batay sa isang paghahambing na pagsusuri ng mutant at normal na DNA nucleotide sequence.

Pagsusuri ng mga produkto ng PCR

sa proseso ng direktang pagsusuri ng DNA

Kinasasangkutan ng pag-aaral ng mga partikular na katangian ng rehiyon ng amplified gene. Kaya, sa mga sakit na sanhi ng pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide, ang mga produkto ng amplification ay naiiba sa kanilang haba (na sumasalamin sa iba't ibang bilang ng mga triplet sa pinag-aralan na rehiyon ng gene) at, bilang kinahinatnan, sa kanilang bilis ng paggalaw sa gel. Salamat sa ito, ang isang malinaw na electrophoretic na paghihiwalay ng mga normal at mutant alleles at isang tumpak na pagpapasiya ng isang pathologically elongated fragment ay nakamit, i.e. DNA diagnosis ng sakit (Fig. 13).

https://pandia.ru/text/78/085/images/image018_18.jpg" width="417" height="110 src=">

kanin. 14. Diagnosis ng pagtanggal GAG sa gene DYT 1 sa mga pasyente na may dopa-independent dystonia (polyacrylamide gel electrophoresis). Lanes 2,3,6 – may sakit; track 1,4,5 – kontrol. Ang manipis na arrow ay nagpapahiwatig ng normal na allele, ang makapal na arrow ay nagpapahiwatig ng mutant na mas maikling allele (pagtanggal ng tatlong nucleotides).

Kung ang buong rehiyon ng DNA na pinag-aaralan ay bahagi ng pinalawig na pagtanggal, ang PCR amplification ng DNA mula sa tinanggal na allele na ito ay hindi isasagawa dahil sa kakulangan ng mga site para sa primer hybridization. Sa kasong ito, ang isang homozygous na pagtanggal ay masuri batay sa kumpletong kawalan ng isang produkto ng reaksyon ng PCR (imposible ang synthesis ng DNA mula sa parehong mga kopya ng gene). Sa isang heterozygous na pagtanggal, posibleng makita ang isang produkto ng PCR na na-synthesize mula sa isang normal (napanatili) na allele; gayunpaman, upang mapagkakatiwalaang masuri ang gayong mutation, kinakailangan na gumamit ng mas kumplikadong mga pamamaraan ng pag-imaging ng DNA na nagbibigay-daan sa pagtantya ng dosis ng panghuling PCR produkto.

Upang matukoy ang mga point mutations (madalas na mga pagpapalit ng nucleotide) sa ilang partikular na mga site, ang PCR method ay ginagamit kasama ng iba pang mga pamamaraan ng molecular genetic analysis. Kung ang lokasyon at kalikasan ng putative point mutation ay tiyak na kilala, kung gayon ang restriction endonucleases (mga enzyme ng paghihigpit) ay mga espesyal na cellular enzyme na nakahiwalay sa iba't ibang strain ng bacteria.

Kinikilala ng mga enzyme na ito ang mga tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide mula apat hanggang sampung nucleotide ang haba. Pagkatapos nito, isinasagawa ang paghihigpit (lat. (pagputol)) sa mga pagkakasunud-sunod na ito bilang bahagi ng isang double-stranded na molekula ng DNA. Kinikilala at pinuputol ng bawat restriction enzyme sa isang nakapirming lugar ang isang mahigpit na tinukoy, tiyak na pagkakasunud-sunod ng nucleotide - site ng paghihigpit (site ng pagkilala).

Sa mga kaso kung saan binago ng isang point mutation ang natural recognition site para sa isang partikular na restriction enzyme, hindi magagawa ng enzyme na ito na buwagin ang mutant na PCR-amplified fragment. Sa ilang mga kaso, ang isang mutation ay humahantong sa paglitaw ng isang bagong site ng pagkilala para sa isang partikular na restriction enzyme na normal na wala.

Sa parehong mga sitwasyon, ang mutant at normal na mga produkto ng PCR na ginagamot sa napiling restriction enzyme ay magbubunga ng mga fragment ng paghihigpit ng iba't ibang haba, na madaling matukoy ng electrophoresis (Fig. 15).

Kaya, kung kinakailangan upang mabilis na makita ang anumang partikular na mutation ng punto, ang gawain ay nabawasan sa paghahanap para sa kaukulang restriction enzyme, ang site ng pagkilala na kung saan ay naisalokal sa site ng disrupted nucleotide sequence. Ang paggamot sa mga produktong PCR na may tulad na restriction enzyme ay gagawing posible na madaling makilala ang mga normal at mutant alleles. Ang pagsusuri sa paghihigpit ay lubos na nagpapadali sa pagtuklas ng mga kilalang point mutations at ngayon ay malawakang ginagamit para sa direktang DNA diagnosis ng mga namamana na sakit.

Ang huling yugto molecular genetic analysis ng mutations ay upang matukoy ang nucleotide sequence ng DNA fragment sa ilalim ng pag-aaral (sequencing), na kung saan ay inihambing sa mga pamantayan at isang panghuling genetic diagnosis ay formulated. Salamat sa mga tagumpay ng molecular genetics, ang mga pamamaraan ng diagnostic ng DNA para sa higit sa 400 namamana na mga sakit ay binuo na ngayon.

kanin. 15. Detection ng point mutation gamit ang restriction analysis: A – amplified gene region na naglalaman ng restriction siteAGCTpara sa restriction endonucleaseAlu ako. MutationG→ Abinabago ang nucleotide sequence na ito, na nagreresulta sa restriction enzymeAluIhinarangan; B - electropherogram ng mga produkto ng paghihigpit: track 1 - homozygosity para sa normal na allele; track 2 - homozygosity para sa mutation; track 3 – heterozygous state (normal allele + mutation).

Ang diagnosis ng mga namamana na sakit, batay sa direktang pagsusuri ng mga mutant alleles sa mga pasyente, mga miyembro ng kanilang pamilya o mga pinaghihinalaang heterozygous carrier ng pathological mutations, ay angkop para sa pre-symptomatic at prenatal diagnosis, na maaaring mailapat sa pinakamaagang yugto ng pag-unlad ng pangsanggol, bago ang paglitaw ng anumang mga klinikal o biochemical na sintomas na sakit.

Anuman ang paraan ng pag-detect ng mutation, ang mga tumpak na katangian ng molekular ng bawat mutation ay maaari lamang makuha sa pamamagitan ng direktang sequencing. Upang i-automate ang prosesong ito, sa mga nakaraang taon, ang mga espesyal na aparato ay malawakang ginagamit - mga sequencer, na ginagawang posible na makabuluhang mapabilis ang proseso ng pagbabasa ng impormasyon ng DNA.

Ang landas sa mas malawak na paggamit ng molekular na biological na pananaliksik sa mga clinical diagnostic laboratories ay binuksan sa pamamagitan ng pagpapabilis ng analytical na proseso sa pamamagitan ng pagsasagawa ng lahat ng mga pamamaraan sa isang continuum, nang walang sample transfer, na lumilikha ng mga kondisyon upang maiwasan ang kontaminasyon sa panahon ng parallel na pagsubok ng isang bilang ng mga analytes at sa pamamagitan ng layunin na pagtatala ng resulta sa bawat cycle.

Pangunahing pagbabago ng paraan ng PCR

Ginagamit upang mabilis na mag-scan at maghanap ng mga kilalang gene mutations.

Multiplex (multi-primer) PCR

Ang pamamaraang ito ay batay sa sabay-sabay na pagpapalakas ng ilang mga exon ng gene na pinag-aaralan sa isang reaksyon. Ito ay nagbibigay-daan para sa cost-effective na mabilis na pag-screen ng mga pinakakaraniwang mutasyon. Halimbawa, upang mabilis na ma-diagnose ang pagdadala ng mga pagtanggal sa dystrophin gene sa mga pasyente na may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy, ang sabay-sabay na pagpapalakas ng isang hanay ng mga pinaka-madalas na mutated exon ng gene na ito ay isinasagawa. Dahil ang mga sakit na ito ay minana sa isang X-linked recessive na paraan at nauugnay sa pinsala sa nag-iisang X chromosome sa mga lalaki, sa kaso ng isang pinahabang pagtanggal, ang electrophoresis ng mga produkto ng reaksyon ay magbubunyag ng kawalan ng isa o higit pang mga fragment ng DNA (exon). ), na maaaring magsilbing molecular confirmation ng diagnosis. Bilang karagdagan, sa pamamagitan ng pagpili ng mga partikular na seksyon ng gene para sa PCR amplification, ang isang medyo tumpak na pagtatasa ng kabuuang haba ng pagtanggal at mga breakpoint ng gene (hanggang sa exon) ay posible.

Ang pinagsamang paggamit ng ilang multiplex na reaksyon ay ginagawang posible na masuri ang hanggang 98% ng lahat ng mga pagtanggal na nagaganap sa mga pasyenteng may progresibong Duchenne/Becker muscular dystrophy. Ito ay kumakatawan sa humigit-kumulang 60% ng kabuuang bilang ng mga kilalang mutasyon sa dystrophin gene at nagpapahiwatig ng napakataas na kahusayan ng pamamaraang ito ng screening para sa pagsusuri ng DNA ng mga dystrophinopathies (Fig. 16).

kanin. 16. Direktang DNA diagnosis ng Duchenne muscular dystrophy gamit ang multiplex PCR (agarose gel electrophoresis). Sa bawat isa sa mga sinuri na indibidwal, apat na exon ng dystrophin gene ang sabay-sabay na pinalaki (exons 17, 19, 44 at 45; ipinapahiwatig ng mga arrow ang kaukulang mga produkto ng amplification). Lane 1 – control, lane 2-5 – mga pasyenteng may Duchenne muscular dystrophy na may iba’t ibang pagtanggal ng dystrophin gene (lane 2 at 5 – pagtanggal ng exon 45, track 3 – pagtanggal ng exon 44, track 4 – pagtanggal ng mga exon 17 at 19 ).

Allele-specific amplification

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng dalawang independiyenteng pares ng mga panimulang aklat para sa isang partikular na rehiyon ng gene: ang isang panimulang aklat sa parehong mga pares ay karaniwan, at ang pangalawang panimulang aklat sa bawat pares ay may iba't ibang istraktura at komplementaryo sa alinman sa isang normal o mutant na pagkakasunud-sunod ng DNA. Bilang resulta ng naturang reaksyon, ang dalawang uri ng mga produkto ng PCR ay maaaring sabay na ma-synthesize sa solusyon - normal at mutant. Bukod dito, ginagawang posible ng disenyo ng mga panimulang aklat na malinaw na makilala ang pagkakaiba ng normal at mutant na mga produkto ng amplification sa pamamagitan ng kanilang laki ng molekular. Ang pamamaraang ito ay napaka-visual at nagbibigay-daan sa iyo upang i-verify ang parehong homo- at heterozygous na karwahe ng mutant allele.

Paraan para sa pagbabagong nakadirekta sa site ng amplified DNA

Ang pamamaraan ay batay sa paggamit ng tinatawag na mismatch primer sa PCR (hindi ganap na pantulong sa template), na naiiba sa template DNA sequence ng isang nucleotide. Bilang resulta ng pagsasama ng tinukoy na panimulang aklat sa mutant na produkto ng PCR, isang artipisyal na nilikha na site ng paghihigpit para sa isa sa mga endonucleases ng paghihigpit ay nabuo dito, na nagpapahintulot sa direktang pagsusuri ng DNA ng isang tiyak na kilalang mutation gamit ang pagsusuri sa paghihigpit. Ang paglikha ng naturang artipisyal na lugar ng paghihigpit ay kinakailangan kung ang paghahanap ay hindi nagbunyag ng pagkakaroon ng isang kilalang at magagamit na enzyme, ang "natural" na lugar ng paghihigpit na apektado bilang isang resulta ng hitsura ng mutation na pinag-aaralan sa molekula ng DNA .

Reverse transcriptase PCR method (RT- PCR)

Ang pamamaraang ito ay ginagamit sa mga kaso kung saan mas maginhawang gumamit ng hindi genomic DNA bilang object ng pag-aaral, ngunit isang mas compact at mayaman sa impormasyon na cDNA na nakuha pagkatapos ng naaangkop na pagproseso ng mga sample ng tissue, halimbawa, biopsy material o cell line ng mga lymphocytes, fibroblast, atbp. Mahalaga ang kondisyon dito ay ang pagpapahayag (kahit minimal) ng gustong gene sa tissue na pinag-aaralan.

Sa unang yugto, ang reverse transcription ng mRNA ay isinasagawa, at ang nagresultang mga molekula ng cDNA ay nagsisilbing isang template para sa PCR. Kasunod nito, ang kritikal na rehiyon ng cDNA, na pinalaki sa sapat na dami, ay sumasailalim sa sequencing at iba pang mga pamamaraan ng mutation screening, direktang electrophoretic na pag-aaral (detection ng mga pagtanggal, pagsingit, atbp.) o pagsasama sa isang expression system upang makakuha ng produktong protina at ang direktang pagsusuri nito.

Ang pamamaraang ito ay lalong epektibo para sa pag-detect ng mga mutasyon na humahantong sa synthesis ng isang "pinutol" na protina (mga walang katuturang mutation, splicing mutations, malalaking pagtanggal) - ang tinatawag na PTT analysis (Protein Truncation Test). Karaniwang ginagamit ang PTT analysis sa pag-aaral ng mahabang multi-exon genes, gaya ng Duchenne/Becker muscular dystrophy, ataxia-telangiectasia, o neurofibromatosis type 1.

Real-time na PCR(Real-Time PCR, English)

Taun-taon, ang real-time na PCR ay nagiging isang lalong popular na paraan ng diagnostic sa praktikal na pangangalagang pangkalusugan. Ang pangunahing tampok nito ay ang pagsubaybay at pagsusuri ng dami ng akumulasyon ng mga produktong polymerase chain reaction at ang awtomatikong pagpaparehistro at interpretasyon ng mga resultang nakuha. Ang pamamaraang ito ay hindi nangangailangan ng isang yugto ng electrophoresis, na binabawasan ang mga kinakailangan para sa isang laboratoryo ng PCR. Salamat sa pag-save ng espasyo sa produksyon, pagbabawas ng bilang ng mga tauhan at ang pangangailangan para sa dami ng pagpapasiya ng DNA/RNA, ang pamamaraang ito ay matagumpay na ginamit sa mga nakaraang taon sa pinakamalaking sanitary-epidemiological, diagnostic at research center sa mga binuo na bansa sa mundo, na pinapalitan PCR sa kasalukuyang format nito (“classical”).

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng fluorescently labeled oligonucleotide probes upang makita ang DNA habang ito ay pinalakas. Ang real-time na PCR ay nagbibigay-daan para sa kumpletong pagsusuri ng isang sample sa loob ng 20-60 minuto at ayon sa teorya ay may kakayahang makakita ng kahit isang molekula ng DNA o RNA sa isang sample.

kanin. 17. Real-time na PCR.

Ang real-time na PCR ay gumagamit ng TaqMan system na direktang kumokontrol sa PCR kinetics sa panahon ng amplification gamit ang resonance fluorescence quenching. Para sa pagtuklas, ginagamit ang isang probe na nagdadala ng fluorophore at isang quencher na pantulong sa gitnang bahagi ng amplified fragment. Kapag ang fluorophore at quencher ay nakatali sa oligonucleotide probe, minor fluorescent emission lamang ang naobserbahan. Sa panahon ng proseso ng amplification, dahil sa 5" exonuclease na aktibidad ng Taq polymerase, ang fluorescent label ay napupunta sa solusyon, napalaya mula sa kalapitan nito sa quencher, at bumubuo ng fluorescent signal na tumataas sa real time na proporsyon sa akumulasyon ng amplifier ( Larawan 17).

Ang pangunahing bentahe ng Real-Time PCR sa PCR na may gel electrophoresis:

· Ang buong pamamaraan ay nagaganap sa isang test tube;

· Ang pamamaraan ay tumatagal ng 1 oras;

· Sapat na ang 1-2 work room;

· Kasama ng qualitative assessment ng resulta, may posibilidad ng quantitative assessment (halimbawa, kapag nagrereseta ng antiviral therapy para sa AIDS o viral hepatitis, kinakailangang malaman ang viral load, ibig sabihin, ang dami ng virus sa bawat unit, na ay ibinibigay ng real time PCR);

· Ang panganib ng kontaminasyon ay makabuluhang nabawasan.

Konklusyon

Ang pamamaraan ng PCR ay isa sa mga pinakakaraniwang pamamaraan ng molekular na biological na pananaliksik. Ang pamamaraang ito ay dapat gamitin nang matalino ng mga clinician, at ang isang doktor na nagpasyang gumamit ng PCR sa kanyang trabaho ay dapat magkaroon ng tiyak na kaalaman tungkol sa mga tampok at kakayahan ng pamamaraang ito. Pangalawa, dapat mayroong malapit na feedback sa pagitan ng clinician at ng PCR laboratory, na kinakailangan upang pag-aralan ang mga kumplikadong kaso at bumuo ng tamang diskarte sa diagnostic. Pangatlo, ang pagsusuri ng PCR ay hindi isang panlunas sa lahat sa mga diagnostic (pangunahin ang mga nakakahawang sakit) at hindi pinapalitan ang mga umiiral na pamamaraan ng pananaliksik, ngunit pinupunan lamang ang mga ito. At higit sa lahat, hindi mapapalitan ng PCR ang intuwisyon at analytical na pag-iisip na dapat mayroon ang isang doktor na umaasa sa tagumpay.

P . S . Molecular biological research - pagbabago ng mga alituntunin para sa diagnosis at paggamot. Ang paggamit ng mga molecular biological na pamamaraan ay nauugnay sa pag-asam ng isang radikal na pagbabago sa diin sa mga diagnostic ng laboratoryo. Maaaring hindi lamang ito tungkol sa napapanahong impormasyon, ngunit tungkol sa pagtanggap nito nang maaga. Kung ngayon ang mga pagsubok sa laboratoryo sa karamihan ng mga kaso ay isinasagawa na kapag ang sakit ay umunlad at ang paggamot ay nagsimula, pagkatapos ay ang molekular na biological na impormasyon sa laboratoryo ay inaasahan na gawing posible upang matukoy ang pagkahilig ng isang tao sa ilang mga uri ng patolohiya at ang antas ng pagiging sensitibo sa ilang mga gamot. , na magbibigay-katwiran sa predictive, preventive at personalized na katangian ng hinaharap na gamot.

PAGBABAGO NG DIAGNOSIS AT MGA ORIENTASYON SA PAGGAgamot

HEREDITARY DISEASES

Ngayon Sa hinaharap

Diagnosis Genetic na pasaporte

8. Ilang mga workroom ang kailangan para magpatakbo ng isang PCR laboratory na may fluorescent detection (quantitative analysis, Real-Time PCR)?

9. Ano ang detection?

10. Anong mga paraan ng pagsusuri ng DNA ang mayroon?

11. Aling enzyme ang pinagbabatayan ng PCR?

12. Bakit kailangang alisin ang detection zone mula sa ibang mga lugar na pinagtatrabahuan?

13. Ano ang restriction site?

14. Ano ang mga pagkakaiba sa pagitan ng direkta at hindi direktang pamamaraan ng diagnostic ng DNA?

15. Ano ang sequencing?

16. Ano ang multiplex PCR?

17. Anong mga uri ng mutasyon ang tinutukoy gamit ang PCR?

18. Ano ang kontaminasyon?

19. Ano ang kakanyahan ng paraan ng pagpapalakas ng allele-specific?

20. Mga kondisyon ng imbakan para sa PCR material?

21. Sa anong aparato nagaganap ang amplification?

22. Ano ang paraan ng reverse transcriptase PCR (RT-PCR)?

23. Ano ang nagsisilbing materyal para sa PCR diagnostics?

24. Ilista ang mga uri ng kontaminasyon?

Mga pagsubok para sa paghahanda sa sarili

1. Endonuclease restriction enzymes:

a) mga enzyme na "sinisira" ang DNA sa mga partikular na lugar;

b) ang mga enzyme na nagsasama-sama ay pumuputol sa molekula ng DNA;

c) mga enzyme na nagbibigay ng mga compound na nagsasagawa ng pag-aayos ng DNA.

2. Pagpapalakas ng gene:

3. Aling paraan ng molecular genetics ang ginagamit upang masuri ang mga sakit na dulot ng mutant gene ng isang kilalang sequence?

a) paggamit ng isang tiyak na restriction enzyme;

b) direktang pagtuklas gamit ang mga tiyak na molekular na probe;

c) pagsusuri ng pamilya ng pamamahagi ng mga normal na polymorphism ng haba ng fragment ng paghihigpit.

4. DNA sequencing:

a) pagkakakilanlan ng sequence ng base ng DNA;

b) maraming pag-uulit ng anumang seksyon ng DNA;

c) paghihiwalay ng isang fragment ng DNA na naglalaman ng gene na pinag-aaralan.

5. Upang makakuha ng mga sample ng DNA maaari mong gamitin :

b) chorionic villi;

c) amniotic fluid;

d) mga selula ng amniotic fluid;

e) mga sample ng biopsy ng balat, kalamnan, atay,

e) lahat ay tama maliban sa puntong "c",

g) lahat ay tama maliban sa puntong "d",

h) lahat ng nasa itaas ay totoo.

6. Upang masuri kung aling mga mutasyon ang ginagamit ng paraan ng PCR:

a) genomic;

b) chromosomal;

c) gene (punto).

7. Ang panimulang aklat ay:

a) pantulong na seksyon ng DNA;

b) isang sintetikong oligonucleotide na may label na (radioactively o fluorescently) sequence na komplementaryo sa isang mutant o normal na gene;

c) isang oligonucleotide na gumaganap bilang isang "primer" at nagpapasimula ng synthesis ng isang polynucleotide chain sa isang DNA o RNA matrix.

8. Sino ang bumuo ng prinsipyo ng pamamaraan ng PCR?

b) K. Mullis

9. Ginagamit ba ang paraan ng PCR upang masuri ang pagpapalawak ng mga pag-uulit ng trinucleotide (isang dinamikong uri ng mutation)?

10. Sa anong mga lugar ginagamit ang PCR?

a) klinikal na gamot;

b) pagpapasiya ng mga transgenic na organismo (GMOs)

c) personal na pagkakakilanlan, pagtatatag ng paternity, forensics

d) lahat ng nabanggit,

e) wala sa itaas..

Mga halimbawang sagot: 1 – a; 2 – b; 3 – b; 4 – a; 5 – e; 6 – sa; 7 – sa; 8 – b; 9 – a, 10 – g.

Pangunahing

1.Bochkov genetics. Moscow. GEOTAR, 2002.

Dagdag

1. , Bakharev at paggamot ng mga congenital at hereditary na sakit sa mga bata. - Moscow, 2004.

2. DNA diagnostics at medikal na genetic counseling. - Moscow, 2004.

3. Ginter genetics. – Moscow, 2003.

4. Gorbunov batayan ng medikal na genetika. – St. Petersburg: Intermedica, 1999.

5. J. McGee. Molecular clinical diagnostics. – Mundo, 1999.

6. Menshikov - biological na pananaliksik sa mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo: mga posibilidad ng problema (mga lektura). Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 3, 2006.

7. Ang gawain ni Kornienko sa laboratoryo ng PCR sa panahon ng in-line na pagsusuri ng biological na materyal. Mga diagnostic ng klinikal na laboratoryo, No. 10, 2006.

8. Organisasyon ng gawaing laboratoryo ng PCR. Mga tagubilin sa pamamaraan. MU 1.3.1794-03. Punong Sanitary Doctor ng Russian Federation, 2003.

9. Erlich H. A. PCR na teknolohiya. – Percin-Elmer Cetus, 1993.

10. Heid C. A., Stevens J. Real time quantitative PCR. Genome Res. – Blg. 6, 1996.

BATAYANG MGA PRINSIPYO NG PARAAN

POLYMERASE CHAIN ​​REACTION

Metodolohikal na manwal para sa ekstrakurikular na gawain ng 3-4 taong mga mag-aaral sa mga espesyalidad ng pangkalahatang medisina (060101) at pediatrics (060103).

GOU VPO "Krasnoyarsk State Medical Academy ng Federal Agency for Health and Social Development"

Russia, Krasnoyarsk,

Mga prinsipyo ng PCR diagnostics

ABSTRAK

mga seksyon, 34 na pahina, 5 mga numero, 5 mga sanggunian

Ang layunin ng gawaing ito ay isang maikling buod ng mga pangunahing prinsipyo at teknolohikal na tampok ng pamamaraan ng PCR, ang siyentipiko at praktikal na aplikasyon nito sa pagsusuri ng mga nakakahawang sakit.

LISTAHAN NG KONVENSYONAL NA MGA PAGDAGDAG

HCV - hepatitis C virus

dATP - deoxyadenosine triphosphate

dGTP - deoxyguanosine triphosphate

dNTP - deoxynucleotide triphosphate

dTTP - deoxythymidine triphosphate

dCTP - deoxycytosine triphosphate

DNA - deoxyribonucleic acid

PCR - polymerase chain reaction

RNA - ribonucleic acid - immunoglobulin class GTime PCR - real-time na paraan ng PCR

PANIMULA

PRINSIPYO NG PARAAN NG PCR

MGA YUGTO NG PCR ANALYSIS

REAL-TIME PCR PARAAN

MGA BEHEBANG NG PARAAN NG PCR

MGA LIMITASYON NG PARAAN NG PCR

APPLICATION NG PCR METHOD

KONGKLUSYON

LISTAHAN NG MGA GINAMIT NA SANGGUNIAN

PANIMULA

Ang pagtuklas ng paraan ng polymerase chain reaction (PCR) ay naging isa sa mga pinaka-kapansin-pansing pag-unlad sa larangan ng molecular biology nitong mga nakaraang dekada. Ginawa nitong posible na itaas ang mga medikal na diagnostic sa isang qualitatively bagong antas. Ang prinsipyo ng polymerase chain reaction method ay binuo ni Carrie Mullis noong 1983. Para sa pagbuo ng pagsusuri sa PCR, ginawaran si K. Mullis ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993.

Matapos ang pagtuklas ng PCR, ito ay napakabilis na ipinakilala sa pagsasanay. Ang pamamaraan ay naging napakapopular na ngayon ay mahirap isipin na nagtatrabaho sa larangan ng molecular biology nang hindi ginagamit ito. Ang pamamaraan ng PCR ay nakatanggap ng partikular na mabilis na pag-unlad salamat sa internasyonal na programa ng Human Genome. Ang mga makabagong teknolohiya ng laser sequencing (pag-decode ng DNA nucleotide sequences) ay nalikha. Kung noong nakaraan ay tumagal ng isang linggo upang matukoy ang pagkakasunud-sunod ng DNA na 250 pares ng nucleotide (bp), maaaring matukoy ng mga modernong laser sequencer ang hanggang 5000 bp. sa isang araw. Ito naman ay nag-aambag sa makabuluhang paglaki ng mga database ng impormasyon na naglalaman ng mga sequence ng DNA. Sa kasalukuyan, ang iba't ibang mga pagbabago ng PCR ay iminungkahi, ang posibilidad ng paglikha ng mga sistema ng pagsubok para sa pag-detect ng mga microorganism at pagtukoy ng mga mutasyon ng punto ay ipinakita, at dose-dosenang mga posibleng aplikasyon ng pamamaraan ang inilarawan.

Ang paglitaw ng paraan ng PCR ay dahil sa ilang mga tagumpay sa larangan ng molecular genetics, pangunahin ang pag-decode ng nucleotide sequence ng mga genome ng isang bilang ng mga microorganism. Dapat pansinin na ang pagtuklas na ito ay sinamahan ng pag-unlad ng ilang mga teknolohiya. Sa partikular, ang paglitaw ng mga device na ginagawang posible na awtomatikong mag-synthesize ng mga single-stranded na mga fragment ng DNA (oligonucleotides). Sa parehong panahon, natuklasan ang mga natatanging microorganism na naninirahan sa mga geyser. Ang kanilang enzymatic system, sa partikular na DNA polymerase, ay lumalaban sa mataas na temperatura ng mga hot spring at nagpapanatili ng biological activity nito hanggang 95 ° C, na isang kinakailangang kondisyon para sa pagsasagawa ng polymerase chain reaction.

Ang polymerase chain reaction ay kasalukuyang pinaka-advanced na diagnostic na paraan ng molecular biology, molecular genetics at clinical laboratory diagnostics, na nagpapahintulot sa pagkilala sa mga solong cell ng pathogens ng maraming mga nakakahawang sakit sa mga tissue at biological fluid ng katawan.

Ang paraan ng PCR ay batay sa komplementaryong pagkumpleto ng isang seksyon ng genomic DNA o RNA ng pathogen, na isinasagawa sa vitro gamit ang enzyme thermostable DNA polymerase. Ang pagtitiyak ng pamamaraan ay tinutukoy ng pagiging natatangi ng genetic na materyal ng mga nakitang nakakahawang ahente, kung saan napili ang mga primer na oligonucleotide na kasangkot sa proseso ng amplification.

Diagnosis ng mga nakakahawang sakit, kabilang ang mga sanhi ng mahirap na linangin na mga ahente, genotyping ng mga microorganism, pagtatasa ng kanilang virulence, pagpapasiya ng microflora resistance sa antibiotics, prenatal diagnosis, biological monitoring ng mga produkto ng dugo - ito ay isang hindi kumpletong listahan ng mga lugar ng gamot gamit ang PCR. Ngayon, ang pagsusuri ng PCR ay nananatiling pinakalaganap at pabago-bagong pagbuo ng teknolohiya. Bawat taon, dose-dosenang mga bagong sistema ng pagsubok para sa pagsusuri ng PCR ang lumalabas sa merkado, na parehong idinisenyo upang matukoy ang mga pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng iba't ibang microorganism na nagdudulot ng mga sakit, at upang pag-aralan ang mga gene ng tao. Ang halaga ng pagsusuri ng PCR ay patuloy na bumababa, na nag-aambag sa lalong malawak na paggamit ng pamamaraan sa mga institusyong medikal at diagnostic. Ang bilang ng mga laboratoryo ng PCR sa mga bansa ng CIS ay lumalaki nang husto at, tila, sa malapit na hinaharap na pagsusuri ng PCR ay magiging isa sa mga pinakakaraniwang pamamaraan ng diagnostic ng laboratoryo.

1. PRINSIPYO NG PARAAN NG PCR

Ang polymerase chain reaction ay isang paraan na ginagaya ang natural na pagtitiklop ng DNA at nagbibigay-daan sa pagtuklas ng isang partikular na molekula ng DNA sa pagkakaroon ng milyun-milyong iba pang molekula.

Ang kakanyahan ng pamamaraan ay paulit-ulit na kopyahin (palakasin) ang ilang mga seksyon ng DNA sa isang test tube sa panahon ng paulit-ulit na mga siklo ng temperatura. Sa bawat cycle ng amplification, ang mga naunang na-synthesize na mga fragment ay muling kinokopya ng DNA polymerase. Dahil dito, mayroong maraming pagtaas sa bilang ng mga partikular na fragment ng DNA, na lubos na nagpapadali sa karagdagang pagsusuri.

Ang paraan ng PCR ay batay sa isang natural na proseso - komplementaryong pagkumpleto ng DNA matrix, na isinasagawa gamit ang enzyme DNA polymerase. Ang reaksyong ito ay tinatawag na DNA replication.

Kasama sa natural na pagtitiklop ng DNA ang ilang yugto:

) DNA denaturation (unwinding ng double helix, divergence ng DNA strands);

) Pagbubuo ng maikling double-stranded na mga seksyon ng DNA (mga panimulang aklat na kinakailangan upang simulan ang DNA synthesis);

) Synthesis ng bagong DNA strand (komplementaryong pagkumpleto ng parehong strand).

Ang prosesong ito ay maaaring gamitin upang makagawa ng mga kopya ng mga maikling seksyon ng DNA na partikular sa mga partikular na microorganism, i.e. magsagawa ng naka-target na paghahanap para sa mga partikular na lugar, na siyang layunin ng mga diagnostic ng gene upang matukoy ang mga pathogen ng mga nakakahawang sakit.

Pagtuklas ng thermostable DNA polymerase (Taq polymerase) mula sa thermophilic bacteria Thermisaquaticus, ang pinakamabuting kalagayan nito ay nasa rehiyon na 70-72°C, na naging posible na gawing cyclic ang proseso ng pagtitiklop ng DNA at gamitin ito para sa trabaho sa vitro. Ang paglikha ng mga programmable thermostat (amplifier), na nagsasagawa ng mga pagbabago sa cyclic na temperatura ayon sa isang naibigay na programa, ay lumikha ng mga kinakailangan para sa malawakang pagpapakilala ng paraan ng PCR sa pagsasanay ng mga klinikal na diagnostic ng laboratoryo. Sa maraming pag-uulit ng mga cycle ng synthesis, nangyayari ang isang exponential na pagtaas sa bilang ng mga kopya ng isang partikular na fragment ng DNA, na ginagawang posible na makakuha ng sapat na bilang ng mga kopya ng DNA para sa kanilang pagkakakilanlan mula sa isang maliit na halaga ng nasuri na materyal, na maaaring naglalaman ng mga solong cell. ng mga mikroorganismo.

Ang komplementaryong pagkumpleto ng kadena ay hindi nagsisimula sa anumang punto sa pagkakasunud-sunod ng DNA, ngunit lamang sa ilang mga panimulang bloke - maikling double-stranded na mga seksyon. Sa pamamagitan ng paglakip ng gayong mga bloke sa mga partikular na seksyon ng DNA, posible na idirekta ang proseso ng synthesis ng isang bagong kadena lamang sa seksyong ito, at hindi kasama ang buong haba ng kadena ng DNA. Upang lumikha ng mga panimulang bloke sa mga partikular na seksyon ng DNA, dalawang oligonucleotide primers (20 pares ng nucleotide), na tinatawag na mga primer, ang ginagamit. Ang mga panimulang aklat ay pantulong sa mga pagkakasunud-sunod ng DNA sa kaliwa at kanang mga hangganan ng isang partikular na fragment at nakatuon sa paraang ang pagkumpleto ng isang bagong DNA chain ay nangyayari lamang sa pagitan nila.

Kaya, ang PCR ay isang maramihang pagtaas sa numero ng kopya (amplification) ng isang partikular na rehiyon ng DNA na na-catalyze ng enzyme DNA polymerase.

. MGA YUGTO NG PCR ANALYSIS

Ang pamamaraan ng pagsusuri gamit ang paraan ng PCR ay may kasamang tatlong yugto:

1. Paghihiwalay ng DNA (RNA) mula sa isang klinikal na sample;

2. Pagpapalakas ng mga partikular na fragment ng DNA;

. Pagtuklas ng mga produkto ng amplification.

. Paghihiwalay ng DNA (RNA).

Sa yugtong ito ng pagsusuri, ang klinikal na sample ay sumasailalim sa espesyal na pagproseso, bilang isang resulta kung saan ang cellular na materyal ay lysed, ang mga protina at polysaccharide fraction ay tinanggal, at isang solusyon ng DNA o RNA ay nakuha, libre mula sa mga inhibitor at handa na para sa. karagdagang amplification. Ang pagpili ng pamamaraan ng pagkuha ng DNA (RNA) ay pangunahing tinutukoy ng likas na katangian ng klinikal na materyal na pinoproseso.

2.Pagpapalakas ng mga partikular na fragment ng DNA

Sa yugtong ito, naiipon ang mga maiikling partikular na fragment ng DNA sa halagang kinakailangan para sa kanilang karagdagang pagtuklas.

Upang magsagawa ng isang polymerase chain reaction, ang isang bilang ng mga bahagi ay dapat na naroroon sa pinaghalong reaksyon:

· Mga panimulang aklat- artipisyal na na-synthesize na oligonucleotides, karaniwang may sukat mula 15 hanggang 30 bp, na kapareho ng kaukulang mga seksyon ng target na DNA. Sila ay gumaganap ng isang mahalagang papel sa pagbuo ng mga produkto ng reaksyon ng amplification. Tinitiyak ng wastong napiling mga panimulang aklat ang pagiging tiyak at pagiging sensitibo ng sistema ng pagsubok.

· Taq polymerase- thermostable enzyme na nagsisiguro sa pagkumpleto ng 3 - ang dulo ng pangalawang strand ng DNA ayon sa prinsipyo ng complementarity.

· Pinaghalong deoxynucleotide triphosphate (dNTPs)- deoxyadenosine triphosphate (dATP), deoxyguanosine triphosphate (dGTP), deoxycytosine triphosphate (dCTP) at deoxythymidine triphosphate (dTTP) - ang "building material" na ginamit ng Taq polymerase upang i-synthesize ang pangalawang strand ng DNA.

· Buffer -isang halo ng mga cation at anion sa isang tiyak na konsentrasyon, na nagbibigay ng pinakamainam na kondisyon para sa reaksyon, pati na rin ang isang matatag na halaga ng pH.

· Nasuri na sample- isang paghahanda na inihanda para sa karagdagan sa pinaghalong reaksyon, na maaaring naglalaman ng nais na DNA, halimbawa, ang DNA ng mga microorganism, na nagsisilbing target para sa kasunod na paulit-ulit na pagkopya.

Fig.1 Mga bahagi ng pinaghalong reaksyon

Ang bawat ikot ng amplification ay may kasamang 3 yugto na nagaganap sa iba't ibang kondisyon ng temperatura:

Stage 1:Denaturasyon ng DNA (unbraiding ng double helix). Nangyayari sa 93-95°C sa loob ng 30-40 segundo.

Ang isa sa mga circuits (+) ay ginagamit bilang pangunahing matrix. Ang limang dulo ng bar nito ay naayos ng enzyme DNA polymerase, na nagsisiguro sa pagbuo ng pangalawang DNA strand, komplementaryo sa una, mula sa mga indibidwal na nucleotide. Ang parehong bagay, sa kabilang direksyon lamang, ay nangyayari sa pangalawang strand ng DNA, gayunpaman, dahil ang pag-unwinding ng molekula ng DNA ay nagpapatuloy sa reverse order, ang bagong strand ay itinayo sa maliliit na mga fragment, na pagkatapos ay pinagsama-sama. Upang simulan ng DNA polymerase enzyme ang gawain nito, ang pagkakaroon ng isang buto o panimulang aklat ay kinakailangan - isang maliit na single-stranded na fragment ng DNA, na, kapag konektado sa komplementaryong rehiyon ng isa sa mga parent na DNA strands, ay bumubuo ng panimulang bloke. para sa pagpapalaki ng anak na babae strand.

Stage 2:Paglalagay ng mga panimulang aklat (pagsusubo). Ang attachment ng mga panimulang aklat ay nangyayari bilang pantulong sa kaukulang mga pagkakasunud-sunod sa kabaligtaran ng mga hibla ng DNA sa mga hangganan ng isang partikular na rehiyon. Ang bawat pares ng mga panimulang aklat ay may sariling temperatura ng pagsusubo, ang mga halaga nito ay nasa hanay na 50-65°C. Ang tumpak na kalkulasyon at na-verify sa eksperimentong temperatura ng primer annealing ay isa sa mga katangian na tumutukoy sa pagtitiyak ng reaksyon, hindi kasama ang attachment ng mga primer sa hindi kumpletong komplementaryong mga pagkakasunud-sunod.

Dahil ang paglaki ng mga anak na babae na DNA strand ay maaaring mangyari nang sabay-sabay sa parehong mga hibla ng maternal DNA, ang DNA polymerase sa pangalawang strand ay nangangailangan din ng sarili nitong primer. Kaya, dalawang panimulang aklat ang idinagdag sa pinaghalong reaksyon. Sa katunayan, ang mga panimulang aklat, na nakakabit sa kabaligtaran na mga hibla ng molekula ng DNA, ay nililimitahan ang bahagi nito na pagkatapos ay madodoble o mapapalaki ng maraming beses. Ang ganitong mga fragment ng DNA ay tinatawag na mga amplicon. Ang haba ng isang amplicon ay maaaring ilang daang mga nucleotide. Sa pamamagitan ng pagpapalit ng isang pares ng mga panimulang aklat, maaari tayong lumipat mula sa pagsusuri ng isang pathogen patungo sa pagsusuri sa isa pa.

Oras ng pagsusubo -20-60 seg.

Stage 3:Pagkumpleto ng mga chain ng DNA (pagpahaba).

Ang mekanismo ng pagkopya ay tulad na ang komplementaryong pagdaragdag ng mga hibla ay hindi maaaring magsimula sa anumang punto sa pagkakasunud-sunod ng DNA, ngunit lamang sa ilang mga panimulang bloke (maiikling double-stranded na mga seksyon). Upang lumikha ng mga panimulang bloke sa mga partikular na seksyon ng DNA, ginagamit ang mga panimulang aklat, na mga oligonucleotide na humigit-kumulang 20 bp ang haba, na tinatawag ding mga primer. Ang mga ito ay pantulong sa mga pagkakasunud-sunod ng DNA sa kaliwa at kanang mga hangganan ng isang tiyak na fragment at nakatuon sa paraang ang DNA synthesis na isinasagawa ng DNA polymerase ay nangyayari lamang sa pagitan nila.

Ang komplementaryong pagkumpleto ng mga chain ng DNA ay nagpapatuloy mula sa 5'-end hanggang sa 3'-end ng chain sa magkasalungat na direksyon, simula sa mga primer attachment site. Ang materyal para sa synthesis ng mga bagong DNA chain ay ang ipinakilalang deoxyribonucleotide phosphate. Ang prosesong ito ay na-catalyze ng enzyme Tag polymerase. Ang bagong DNA na nabuo sa unang cycle ng synthesis ay nagsisilbing panimulang materyal para sa pangalawang cycle, kung saan ang nais na tiyak na fragment ng DNA (amplicon) ay nabuo, atbp.

Fig.2 Prinsipyo ng DNA amplification

Sa kasalukuyan, maraming paraan ang ginagamit upang maghanda ng sample para sa PCR. Kasama sa pamamaraan ng paghahanda ng sample ang microbial lysis at pagkuha ng nucleic acid. Upang sirain ang microbial cell, ang simpleng pagkulo, pagyeyelo-pagtunaw sa pagkakaroon ng lysozyme, pati na rin ang mga espesyal na buffer ng lysis na naglalaman ng mga detergent at proteinase ay ginagamit. Ang pagpili ng paraan ay karaniwang idinidikta ng likas na katangian ng mikrobyo, mas tiyak, ang likas na katangian ng cell wall nito. Ang pamamaraan para sa pagkuha ng purong paghahanda ng DNA, na inilarawan ni B.R. Marmionetal, ay itinuturing na pamantayan at naging klasikal na. (1993). Ito ay nagsasangkot ng enzymatic proteolysis na sinusundan ng deproteinization at precipitation ng DNA na may alkohol. Ang pamamaraang ito ay nagpapahintulot sa iyo na makakuha ng isang purong paghahanda ng DNA, ngunit ito ay lubos na matrabaho at nagsasangkot ng pagtatrabaho sa mga agresibo at malakas na amoy na mga sangkap tulad ng phenol at chloroform.

Isa sa pinakasikat ay ang paraan ng pagkuha ng DNA na iminungkahi ni R.Boometal. (1990), batay sa paggamit ng isang malakas na ahente ng lysis - guanidine thiocyanate (GuSCN) para sa cell lysis at kasunod na pagsipsip ng DNA sa isang carrier (glass beads, diatomaceous earth, glass "milk", atbp.). Pagkatapos ng paghuhugas, ang DNA ay nananatili sa sample, na na-sorbed sa carrier, kung saan madali itong maalis gamit ang isang elution buffer. Ang pamamaraan ay maginhawa, technologically advanced at angkop para sa paghahanda ng isang sample para sa amplification. Gayunpaman, ang pagkawala ng DNA ay posible dahil sa hindi maibabalik na sorption sa carrier, gayundin sa panahon ng maraming paghuhugas. Ito ay lalong mahalaga kapag nagtatrabaho sa maliit na halaga ng DNA sa isang sample. Bilang karagdagan, kahit na ang mga bakas na halaga ng GuSCN ay maaaring makapigil sa PCR, kaya kapag ginagamit ang pamamaraang ito, ang tamang pagpili ng sorbent at maingat na pagsunod sa mga teknolohikal na nuances ay napakahalaga. Dapat tandaan na dahil sa malaking bilang ng mga hakbang ng pagdaragdag at pag-alis ng mga solusyon, kailangan ang pag-iingat kapag hinahawakan ang sample, dahil posible ang cross-contamination sa pagitan ng mga sample at ang resultang DNA aerosol.

Sa klasikal na pamamaraan ng phenol-chloroform DNA extraction, nakakamit ang magandang DNA purification, pangunahin mula sa Tag polymerase inhibitors, ngunit ang malalaking pagkawala ng nucleic acid ay hindi maiiwasan, lalo na kapansin-pansin kapag nagtatrabaho sa maliliit na sample na may mababang konsentrasyon ng nakakahawang ahente.

Ang isa pang pangkat ng mga pamamaraan ng paghahanda ng sample ay batay sa paggamit ng mga ion exchanger tulad ng Chilex (USA), na, hindi tulad ng salamin, sorb hindi DNA, ngunit mga impurities na nakakasagabal sa reaksyon. Bilang isang patakaran, ang teknolohiyang ito ay may kasamang dalawang yugto: kumukulo ang sample at sorption ng mga impurities sa isang ion exchanger. Ang pamamaraan ay lubhang kaakit-akit dahil sa pagiging simple ng pagpapatupad nito. Sa karamihan ng mga kaso ito ay angkop para sa pagtatrabaho sa klinikal na materyal. Sa kasamaang palad, minsan may mga sample na may mga impurities na hindi maalis gamit ang mga ion exchanger. Bilang karagdagan, ang ilang mga microorganism ay hindi maaaring sirain sa pamamagitan ng simpleng pagkulo. Sa mga kasong ito, kinakailangan na ipakilala ang mga karagdagang yugto ng pagpoproseso ng sample.

Sa panahon ng mass screening, kapag mahalaga na makakuha ng istatistikal na data, posible na gumamit ng mga simpleng pamamaraan gamit ang mga detergent o paggamot sa biological na materyal na may alkalis at pagkatapos ay neutralisahin ang mga ito. Kasabay nito, ang paggamit ng mga naturang pamamaraan para sa mga klinikal na diagnostic ay maaaring humantong sa mga maling negatibong resulta dahil sa paggamit ng mababang kalidad na paghahanda ng DNA sa pinaghalong reaksyon. Kaya, ang pagpili ng paraan ng paghahanda ng sample ay dapat isaalang-alang na may pag-unawa sa mga layunin ng nilalayon na pagsusuri.

Sa susunod na pamamaraan - amplification - isang sample na naglalaman ng DNA ng pathogen ay ipinakilala sa isang maliit na test tube na may mga bahagi na nagsisiguro ng polymerase reaction, dalawang uri ng primers, dalawang enzymes (Tag polymerase at N-uracil glycolase) at apat na uri ng nucleotide A, G, Ts, U. Upang maisagawa ang reaksyon ng polymerase, ginagamit ang isang espesyal na aparato (thermal cycler o DNA amplifier), na nagpapahintulot sa iyo na awtomatikong baguhin ang temperatura ng pinaghalong reaksyon ayon sa isang tiyak na programa. Sa unang round ng PCR, ang sample ay pinainit sa temperatura na 94°C upang paghiwalayin ang dalawang pantulong na DNA strands. Ang temperatura pagkatapos ay bumaba sa 40-60 ° C, kung saan ang mga primer ay nakakabit sa isang solong strand ng DNA, pagkatapos kung saan ang temperatura ay tumaas muli sa 72 ° C, kapag ang aktibidad ng polymerase ay pinaka-binibigkas. Ang buong cycle na may mga pagbabago sa temperatura ay tumatagal ng mas mababa sa 3 minuto.

Upang masuri nang tama ang mga resulta ng PCR, mahalagang maunawaan na ang pamamaraang ito ay hindi quantitative. Sa teorya, ang mga produkto ng amplification ng mga solong target na molekula ng DNA ay maaaring makita gamit ang electrophoresis pagkatapos ng 30-35 na mga cycle. Gayunpaman, sa pagsasagawa, ito ay ginagawa lamang sa mga kaso kung saan ang reaksyon ay nagaganap sa ilalim ng mga kondisyon na malapit sa ideal, na bihira. Ang antas ng kadalisayan ng paghahanda ng DNA ay may partikular na malaking impluwensya sa kahusayan ng amplification, i.e. ang presensya sa pinaghalong reaksyon ng ilang mga inhibitor, na sa ilang mga kaso ay maaaring maging lubhang mahirap na mapupuksa. Minsan, dahil sa kanilang presensya, kahit sampu-sampung libong target na molekula ng DNA ay hindi maaaring palakihin. Kaya, madalas na walang direktang kaugnayan sa pagitan ng paunang halaga ng target na DNA at ang panghuling halaga ng mga produkto ng amplification.

Iba't ibang paraan ang ginagamit upang mailarawan ang mga resulta ng amplification. Ang pinakakaraniwan ngayon ay electrophoresis, batay sa paghihiwalay ng mga molekula ng DNA ayon sa laki. Upang gawin ito, maghanda ng isang plato ng agarose gel, na kung saan ay agarose solidified pagkatapos matunaw sa isang electrophoresis buffer sa isang konsentrasyon ng 1.5-2.5% na may pagdaragdag ng isang espesyal na pangulay ng DNA, halimbawa ethidium bromide. Ang solidified agarose ay bumubuo ng isang spatial na sala-sala. Kapag nagbubuhos gamit ang mga suklay, ang mga espesyal na balon ay nabuo sa gel, kung saan ang mga produkto ng amplification ay kasunod na idinagdag. Ang gel plate ay inilalagay sa isang pahalang na gel electrophoresis apparatus at isang pare-parehong pinagmumulan ng boltahe ay konektado. Nagsisimulang gumalaw ang DNA na may negatibong charge sa gel mula minus hanggang plus. Sa kasong ito, ang mga mas maiikling molekula ng DNA ay gumagalaw nang mas mabilis kaysa sa mas mahaba. Ang bilis ng paggalaw ng DNA sa gel ay naiimpluwensyahan ng konsentrasyon ng agarose, lakas ng patlang ng kuryente, temperatura, komposisyon ng buffer ng electrophoresis at, sa isang mas mababang lawak, ang komposisyon ng DNA. Ang lahat ng mga molekula ng parehong laki ay gumagalaw sa parehong bilis. Ang dye ay isinasama (intercalated) ng mga planar na grupo sa mga molekula ng DNA. Matapos makumpleto ang electrophoresis, na tumatagal mula 10 minuto hanggang 1 oras, ang gel ay inilalagay sa isang transilluminator filter na nagpapalabas ng liwanag sa hanay ng ultraviolet (254 - 310 nm). Ang enerhiya ng ultraviolet na hinihigop ng DNA sa 260 nm ay inililipat sa tina, na nagiging sanhi ng pag-fluoresce nito sa orange-red na rehiyon ng nakikitang spectrum (590 nm).

Ang pamantayan ng DNA ng nais na mikroorganismo ay ginagamit bilang isang "positibong kontrol". Ang laki ng mga hindi tiyak na amplicon ay maaaring mas malaki o mas maliit kumpara sa "positibong kontrol". Sa pinakamasamang kaso, ang mga sukat na ito ay maaaring magkasabay at mababasa bilang positibo sa electrophoresis.

Ang "positibong kontrol" ay nagbibigay-daan sa iyo upang matiyak na ang lahat ng mga sangkap na kasama sa pinaghalong reaksyon ay tinitiyak ang normal na pag-unlad ng reaksyon. Kasabay nito, ang paghahanda ng DNA na inihanda para sa PCR mula sa biological na materyal ay maaaring maglaman ng mga impurities ng mga inhibitor, na makabuluhang bawasan ang kahusayan ng reaksyon, at sa ilang mga kaso ay humantong sa kawalan ng mga tiyak na amplicons kahit na sa pagkakaroon ng nais na pathogen. Kinakailangan na subaybayan ang pag-unlad ng amplification sa bawat test tube na may pinaghalong reaksyon, kung saan ginagamit ang isang karagdagang tinatawag na "internal control", na anumang pamantayan ng DNA na hindi katulad ng DNA ng nais na mikroorganismo.

Para sa mga nakakahawang sistema ng pagsubok, kung minsan, halimbawa, ang p-globin gene ay ginagamit, hanggang sa mga dulo nito, gamit ang genetic engineering manipulations, ang mga seksyon ng DNA na homologous sa mga primer na kasama sa sistema ng pagsubok ay natahi. Kung ang isang "internal na kontrol" ay idinagdag sa pinaghalong reaksyon, ito ay magiging parehong target para sa panimulang pagsusubo bilang ang chromosomal DNA ng nais na nakakahawang ahente. Ang laki ng internal control amplification product ay pinili upang ito ay 2 o higit pang beses na mas malaki kaysa sa mga amplicon na nabuo mula sa amplification ng nais na microorganism DNA. Bilang resulta, kung ang "panloob na kontrol" na DNA ay idinagdag sa pinaghalong reaksyon kasama ang sample ng pagsubok, kung gayon, anuman ang pagkakaroon ng isang microorganism sa biological sample, ang "internal control" ay magiging sanhi ng pagbuo ng mga tiyak na amplicon, ngunit makabuluhang mas mahaba (mas mabigat) kaysa sa amplicon ng microorganism. Ang pagkakaroon ng mga mabibigat na amplicon sa pinaghalong reaksyon ay nagpapahiwatig ng normal na pag-unlad ng reaksyon ng amplification at ang kawalan ng mga inhibitor. Kung ang mga amplicon ng kinakailangang laki at "panloob na kontrol" ay hindi nabuo, maaari nating tapusin na may mga hindi kanais-nais na impurities sa nasuri na sample na dapat alisin, ngunit hindi tungkol sa kawalan ng nais na DNA.

Sa kabila ng lahat ng pagiging kaakit-akit ng diskarteng ito, mayroon itong malaking depekto. Kaya, kung ang nais na DNA ay naroroon sa pinaghalong reaksyon, kung gayon ang kahusayan ng pagpapalakas nito ay bumababa nang husto dahil sa kumpetisyon sa "panloob na kontrol" para sa mga panimulang aklat. Ito ay pangunahing mahalaga sa mababang konsentrasyon ng DNA sa sample ng pagsubok at maaaring humantong sa mga maling negatibong resulta. Gayunpaman, sa kondisyon na ang problema ng kumpetisyon para sa mga panimulang aklat ay malulutas, ang pamamaraang ito ng pagsubaybay sa kahusayan ng amplification ay tiyak na magiging kapaki-pakinabang.

Fig. 3 Pangalawang cycle ng DNA amplification

. Pagtuklas ng mga produkto ng amplification

). Pahalang na pamamaraan ng electrophoresis

Ang isa sa mga pamamaraan para sa pagpapakita ng mga resulta ng amplification ay ang paraan ng electrophoresis, batay sa paghihiwalay ng mga molekula ng DNA ayon sa laki. Sa karamihan ng mga pamamaraan, sa yugtong ito, ang pinaghalong mga produkto ng amplification na nakuha sa ika-2 yugto ay pinaghihiwalay ng pahalang na electrophoresis sa isang agarose gel. Bago ang electrophoretic separation, isang solusyon ng ethidium bromide ay idinagdag sa amplification mixture, na bumubuo ng malakas na interstitial compound na may double-stranded na mga fragment ng DNA. Ang mga compound na ito ay may kakayahang mag-fluorescing sa ilalim ng UV irradiation, na naitala sa anyo ng mga makinang na banda pagkatapos ng electrophoretic na paghihiwalay ng amplification mixture sa isang agarose gel. Maaaring mag-iba ang liwanag ng mga banda ng produkto ng amplification. Samakatuwid, madalas na kaugalian sa mga laboratoryo ng PCR na suriin ang resulta gamit ang isang three-, four-, o five-point system. Gayunpaman, hindi ito maiugnay sa paunang halaga ng target na DNA sa sample. Kadalasan, ang pagbaba sa liwanag ng mga banda ay nauugnay sa isang pagbawas sa kahusayan ng amplification sa ilalim ng impluwensya ng mga inhibitor o iba pang mga kadahilanan.

Fig.4 Detection ng mga produkto ng amplification sa pamamagitan ng horizontal electrophoresis

). Pamamaraan ng patayong electrophoresis

Ang paraan ng vertical electrophoresis ay sa panimula ay katulad ng pahalang na electrophoresis. Ang kanilang pagkakaiba ay sa kasong ito ang polyacrylamide ay ginagamit sa halip na agarose. Isinasagawa ito sa isang espesyal na silid para sa vertical electrophoresis. Ang polyacrylamide gel electrophoresis ay may mas malaking resolution kumpara sa agarose electrophoresis at nagbibigay-daan sa isa na makilala ang mga molekula ng DNA na may iba't ibang laki na may katumpakan ng isang nucleotide. Ang paghahanda ng polyacrylamide gel ay medyo mas kumplikado kaysa sa agarose gel. Bilang karagdagan, ang acrylamide ay isang nakakalason na sangkap. Dahil ang pangangailangan upang matukoy ang laki ng isang produkto ng amplification na may katumpakan ng 1 nucleotide ay bihirang lumitaw, ang pamamaraang ito ay hindi ginagamit sa karaniwang gawain.

3). Paraan ng Hybridization probe

Bilang isang kahalili sa paraan ng pagtuklas ng electrophoretic, na may ilang mga kawalan: pagiging subjectivity sa pagbabasa ng mga resulta, mga limitasyon sa pagtukoy ng DNA ng iba't ibang microorganism sa isang reaksyon, maaaring imungkahi ang mga scheme ng pagtuklas ng hybridization. Sa mga scheme na ito, nabuo ang fragment ng DNA bilang isang resulta ng amplification hybridizes (bumubuo ng 2-stranded complex - "hybrids") na may isang tiyak na oligonucleotide probe. Ang pagpaparehistro ng naturang mga complex ay maaaring isagawa sa colorimetrically o fluorimetrically.

3. REAL-TIME PCR METHOD (Real-Time PCR)

Ginagawang posible ng Real-Time na paraan ng PCR na makita ang mga produkto ng amplification sa panahon ng reaksyon at subaybayan ang mga kinetics ng akumulasyon ng amplicon. Upang makita ang isang produkto ng PCR, ginagamit ang mga fluorescent dyes na nagbibigay ng fluorescence na direktang proporsyonal sa dami ng produkto ng PCR - reporter fluorescence. Ang mga mekanismo para sa pagbuo nito ay nag-iiba depende sa partikular na uri ng Real-Time PCR.

Ang kinetic curve sa mga coordinate na "Level ng reporter fluorescence - amplification cycle" ay may S-shape.

Maaari itong nahahati sa tatlong yugto:

1.Yugto ng pagsisimula (kapag ang mga produkto ng PCR ay hindi pa natukoy ng isang fluorescent na label).

2.Exponential stage (kung saan mayroong exponential dependence sa dami ng fluorescence sa PCR cycle).

.Plateau (yugto ng saturation).

Fig.5 Graph ng fluorescence kinetic curve gamit ang Real-Time PCR

Ang pagpaparehistro ng fluorescent signal ay isinasagawa sa panahon ng proseso ng amplification sa isang espesyal na aparato - isang thermal cycler para sa Real-Time PCR. Batay sa pagtaas ng intensity ng fluorescent signal, ang konsentrasyon ng paunang DNA template ay kinakalkula gamit ang software na ibinigay kasama ng amplifier.

Mga kalamangan ng real-time na paraan ng PCR

n ang kakayahang makita ang akumulasyon ng mga produkto ng amplification nang direkta sa panahon ng amplification;

n ang pangunahing bentahe ay ang kakayahang makita ang akumulasyon ng mga amplicon nang hindi binubuksan ang tubo, na nagpapaliit sa panganib ng mga maling positibong resulta dahil sa kontaminasyon ng mga sample at reagents na may mga produkto ng amplification;

n ang isang makabuluhang pagbawas sa bilang ng mga manipulasyon sa sample ng pagsubok ay binabawasan ang oras, pinapasimple ang pagsusuri at binabawasan ang posibilidad ng mga pagkakamali;

n Ginagawang posible ng diskarte na ito na alisin ang yugto ng electrophoresis, na humahantong sa isang matalim na pagbaba sa posibilidad ng kontaminasyon ng mga sample ng pagsubok na may mga produkto ng amplification;

n pagbabawas ng mga kinakailangan para sa mga laboratoryo ng PCR;

n pagtaas ng objectivity ng interpretasyon ng mga resulta ng isang PCR study, dahil ang pagproseso ay isinasagawa gamit ang software ng device;

n Ang kabuuang oras ng pananaliksik ay makabuluhang, halos kalahati, na nagpapahintulot sa mga resulta na makuha sa loob ng 1.5 - 2 oras pagkatapos dumating ang klinikal na materyal sa laboratoryo;

n Ang pamamaraang ito ay nagbibigay-daan sa unang pagkakataon na mabilang ang nilalaman ng DNA ng isang mikroorganismo sa isang klinikal na sample;

n ang paggamit ng hybridization probes kasama ang mga panimulang aklat ay nagdaragdag sa pagtitiyak ng pagsusuri;

n ang posibilidad ng independiyenteng sabay-sabay na pagpaparehistro ng fluorescent signal mula sa ilang hybridization DNA probes ay nagbibigay-daan para sa pagkakakilanlan sa isang pag-aaral ng ilang magkakaibang rehiyon ng pareho o magkakaibang mga target ng DNA.

. MGA BEHEBANG NG PARAAN NG PCR

n Direktang pagkakakilanlan ng mga pathogens ng mga nakakahawang sakit

Ang paraan ng PCR ay nagbibigay ng direktang indikasyon ng pagkakaroon ng isang tiyak na fragment ng DNA ng pathogen sa materyal na kinuha mula sa pasyente.

n Mataas na pagtitiyak ng PCR

Gamit ang paraan ng PCR, ang isang fragment ng DNA ay nakahiwalay sa materyal na pinag-aaralan na natatangi sa isang partikular na pathogen - isang bacterium o isang virus. Ang seksyon ng DNA na ito ay natatangi at hindi tipikal para sa anumang impeksyon sa lupa. Ang pagtitiyak ay tinutukoy ng pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng mga panimulang aklat, na nag-aalis ng posibilidad na makakuha ng mga maling resulta, kabaligtaran sa paraan ng immunosorbent assay na may kaugnayan sa enzyme, kung saan ang mga pagkakamali dahil sa mga cross-reacting na antigen ay karaniwan.

n Mataas na sensitivity PCR

Ang paraan ng PCR ay nagbibigay-daan sa iyo na makakita ng kahit isang cell ng bakterya o mga virus. Nakikita ng mga diagnostic ng PCR ang pagkakaroon ng mga pathogen ng mga nakakahawang sakit sa mga kaso kung saan hindi ito magagawa ng iba pang mga pamamaraan (immunological, bacteriological, microscopic). Ang sensitivity ng PCR analysis ay 10-1000 cells bawat sample (ang sensitivity ng immunological at microscopic test ay 103-105 cells).

n Ang versatility ng PCR

Dahil ang pathogen ay maaaring mapaloob sa anumang biological secretions at tissues, ang PCR research ay maaaring gumamit ng halos anumang materyales, kabilang ang mga hindi naa-access para sa pananaliksik sa pamamagitan ng iba pang mga pamamaraan - mucus, ihi, dugo, suwero, plema, ejaculate, scrapings ng epithelial cells.

n Mataas na bilis ng pagkuha ng mga resulta ng pagsusuri sa PCR

Ang pagsusuri sa PCR ay hindi nangangailangan ng paghihiwalay at pagpapalaki ng kultura ng pathogen, na tumatagal ng maraming oras. Ang isang pinag-isang paraan para sa pagproseso ng biomaterial at pag-detect ng mga produkto ng reaksyon, at automation ng proseso ng amplification ay ginagawang posible na magsagawa ng kumpletong pagsusuri sa loob ng 4-4.5 na oras.

n Kakayahang mag-diagnose ng anumang uri ng impeksiyon

Ang mataas na sensitivity ng paraan ng PCR ay ginagawang posible upang masuri ang impeksiyon hindi lamang sa talamak na yugto ng sakit, kundi pati na rin ang mga talamak na impeksiyon at maging ang pagkakaroon ng solong bakterya o mga virus.

Sa kasalukuyan, ang bentahe ng pagsusuri ng PCR sa pamamaraang pangkultura para sa pagtuklas ng mga mikroorganismo ay ang mga sumusunod:

Ang isang mas mataas na dalas ng pagtuklas ng microbe, na lumalampas sa parehong tagapagpahiwatig kapag ginagamit ang pamamaraan ng kultura ng 6-7%. Ang mga pagkakaibang ito ay ipinaliwanag sa pamamagitan ng posibleng pagkamatay ng mikrobyo sa panahon ng pag-iimbak at transportasyon, habang ang PCR ay may kakayahang makita ang mga di-mabubuhay na anyo ng mikroorganismo.

Ang oras na kinakailangan upang makita ang isang pathogen gamit ang pamamaraan ng kultura ay humigit-kumulang 4 na araw, habang ang paggamit ng PCR ay nagpapahintulot sa pagtuklas ng mikrobyo sa loob ng 4-5 na oras.

Ang paggamit ng teknolohiya ng PCR ay nagbibigay-daan sa pagtuklas ng mga pathogen, tulad ng chlamydia, sa mga sample na kinuha nang hindi invasive, tulad ng ihi.

Ang pamamaraan ng PCR ay partikular na epektibo para sa pag-diagnose ng mahirap na linangin, hindi nalilinang at paulit-ulit na mga anyo ng mga microorganism, na madalas na nakatagpo sa mga tago at talamak na impeksyon, dahil ang pamamaraang ito ay iniiwasan ang mga paghihirap na nauugnay sa paglaki ng mga naturang microorganism sa mga kondisyon ng laboratoryo.

n Posibilidad ng pagsasagawa pagsubaybay at pagsusuri sa pagiging epektibo ng therapy, lalo na para sa mga sakit na viral.

n Posibilidad ng pagtuklas indibidwal na mga subtype at strain ng mga virus at bacteria.

n Posibilidad ng kahulugan ilang uri ng mga pathogens (Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Trichomonas vaginalis, Ureaplasmaurealyticum) mula sa isang tubo na may biological na materyal.

Ang pamamaraang ito ay maihahambing sa intensity ng paggawa sa mga klasikal na pamamaraan (enzyme immunoassay, immunofluorescence, atbp.), Ngunit nagbibigay ng mas maaasahang impormasyon sa diagnostic, na nagpapahintulot sa direktang pagtuklas ng DNA o RNA ng isang nakakahawang ahente sa klinikal na materyal. Samakatuwid, ang pamamaraan ng PCR, kasama ang pamamaraan ng kultura, ay kinikilala bilang "pamantayan ng ginto" para sa pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit.

5. MGA LIMITASYON NG PARAAN NG PCR

· Sa panahon ng reaksyon, ang DNA ng parehong buhay at patay na mga mikroorganismo ay pinalaki

· Posibilidad ng cross-reaksyon

Ang pagpili ng mga panimulang aklat ay batay sa umiiral na kaalaman tungkol sa genome ng isang naibigay at katulad na mga mikroorganismo. Sa teorya, may posibilidad na ang parehong fragment ay naroroon sa iba pang mga microorganism na ang genome ay hindi pa natukoy sa kasalukuyan at hindi pa nasubok para sa posibilidad ng cross-reaksyon. Ang pagkakaroon ng mga naturang microorganism sa sample ay maaaring humantong sa isang maling positibong resulta ng pagsubok.

· Pagkakaiba-iba ng mga microorganism

Bagaman kapag gumagawa ng isang sistema ng pagsubok, ang genome fragment na ginagamit para sa amplification ay pinili mula sa isang mataas na conserved na rehiyon, ang pagkakaiba-iba ng mga microorganism ay maaaring humantong sa ang katunayan na ang ilang mga genotypes o strains ng pathogen sa ilalim ng pag-aaral ay maaaring makakuha ng mga mutasyon sa amplified na rehiyon ng genome. , at sa gayon ay nagiging mailap para sa test -system na ito.

Ang huling dalawang punto ay mahalaga para sa mga developer ng PCR diagnostic kit. Ang mga pamantayan ay binuo na ngayon upang ayusin ang dami ng pagsubok (kabilang ang pagsubok para sa mga cross-reaksyon, pati na rin ang pagsubok sa mga kilalang strain ng pathogen na nakikita) na dapat dumaan sa isang sistema ng pagsubok bago ito mailagay sa merkado.

6. APPLICATION NG PCR METHOD

polymerase diagnostics nakakahawang sakit

Ginagamit ang PCR sa maraming lugar para sa pagsusuri at siyentipikong mga eksperimento:

1. forensics

Ginagamit ang PCR upang ihambing ang tinatawag na "genetic fingerprints." Kinakailangan ang sample ng genetic material mula sa pinangyarihan ng krimen - dugo, laway, semilya, buhok, atbp. Ito ay inihambing sa genetic material ng suspek. Ang isang napakaliit na halaga ng DNA ay sapat, ayon sa teorya ay isang kopya. Ang DNA ay pinaghiwa-hiwalay sa mga fragment at pagkatapos ay pinalaki gamit ang PCR. Ang mga fragment ay pinaghihiwalay gamit ang DNA electrophoresis. Ang resultang pattern ng pag-aayos ng mga banda ng DNA ay tinatawag na genetic fingerprint.

2. pagtatatag ng paternity

Kapag pinag-aaralan ang mga resulta ng electrophoresis ng mga fragment ng DNA na pinalaki gamit ang PCR ng ama-anak-ina, natuklasan na ang bata ay magmamana ng ilang mga tampok ng genetic imprint ng parehong mga magulang, na nagbibigay ng isang natatanging imprint. Bagama't kakaiba ang genetic fingerprints (maliban sa kaso ng identical twins), ang mga relasyon sa pamilya ay maaari pa ring maitatag sa pamamagitan ng pagkuha ng ilang fingerprint. Ang parehong paraan ay maaaring ilapat, bahagyang binago, upang magtatag ng ebolusyonaryong pagkakaugnay sa mga organismo.

3. mga medikal na diagnostic

Ginagawang posible ng PCR na makabuluhang mapabilis at mapadali ang pagsusuri ng mga namamana at viral na sakit. Ang gene ng interes ay pinalaki ng PCR gamit ang naaangkop na mga panimulang aklat at pagkatapos ay pinagsunod-sunod upang makilala ang mga mutasyon. Ang mga impeksyon sa virus ay maaaring matukoy kaagad pagkatapos ng impeksyon, linggo o buwan bago lumitaw ang mga sintomas.

4. gene cloning

Ang gene cloning ay ang proseso ng paghihiwalay ng mga gene at, bilang resulta ng genetic engineering manipulations, pagkuha ng malaking halaga ng produkto ng isang gene. Ginagamit ang PCR upang palakihin ang isang gene, na pagkatapos ay ipinasok sa isang vector - isang piraso ng DNA na naglilipat ng isang dayuhang gene sa pareho o ibang organismo na maginhawa para sa paglaki. Halimbawa, ang mga plasmid o viral DNA ay ginagamit bilang mga vector. Ang pagpasok ng mga gene sa isang dayuhang organismo ay karaniwang ginagamit upang makagawa ng produkto ng gene na iyon - RNA o, kadalasan, isang protina. Sa ganitong paraan, maraming protina ang nakukuha sa dami ng industriya para magamit sa agrikultura, gamot, atbp.

5. DNA sequencing

Sa paraan ng pagkakasunud-sunod gamit ang dideoxynucleotides na may label na fluorescent na label o radioactive isotope, ang PCR ay isang mahalagang bahagi, dahil sa panahon ng polymerization na ang mga derivatives ng nucleotides na may label na fluorescent o radioactive na label ay ipinasok sa DNA chain. Pinipigilan nito ang reaksyon, na nagpapahintulot sa mga posisyon ng mga tiyak na nucleotides na matukoy pagkatapos na ang mga synthesized na chain ay pinaghiwalay sa gel.

6. mutagenesis

Sa kasalukuyan, ang PCR ay naging pangunahing pamamaraan para sa pagsasagawa ng mutagenesis (pagsususog sa pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng DNA). Ang paggamit ng PCR ay naging posible upang pasimplehin at pabilisin ang pamamaraan ng mutagenesis, pati na rin gawin itong mas maaasahan at muling gawin.

7. diagnosis ng mga nakakahawang sakit

Ang paggamit ng paraan ng PCR para sa pag-diagnose ng mga nakakahawang sakit ng parehong bacterial at viral na kalikasan ay napakalaking kahalagahan para sa paglutas ng maraming mga problema ng microbiology at epidemiology. Ang paggamit ng pamamaraang ito ay nag-aambag din sa pagbuo ng pangunahing pananaliksik sa larangan ng pag-aaral ng talamak at hindi gaanong nauunawaan na mga nakakahawang sakit.

8. diagnosis ng mga sakit na viral

Ang pinakakomprehensibong benepisyo ng PCR sa pag-diagnose ng mga sakit na viral ay maipapakita sa pamamagitan ng pagsasaalang-alang sa nakakahawang proseso na dulot ng hepatitis C virus (HCV). Ang PCR ay may partikular na halaga ng diagnostic para sa pag-detect ng virus na ito para sa mga sumusunod na dahilan:

) kakulangan ng paraan para sa paglinang ng HCV; 2) hindi umiiral ang mga antigen diagnostic kit; 3) ang reaksyon ng pagbuo ng antibody sa HCV ay napakabagal na ang diagnosis sa panahon ng talamak na yugto ng impeksiyon, bilang panuntunan, ay hindi maaaring gawin.

Samakatuwid, ang paggamit ng teknolohiya ng PCR para sa diagnosis, kontrol sa kalidad ng paggamot at pagsusuri ng epidemiological ng morbidity na dulot ng HCV ay tinatanggap na ngayon sa pangkalahatan.

Kasabay nito, tanging ang teknolohiya ng PCR ang nagbibigay-daan sa paglutas ng mga sumusunod na problema: 1) pag-diagnose ng talamak na impeksyon na may late detection ng mga antibodies sa HCV; 2) magsagawa ng etiological diagnosis ng talamak na hepatitis C sa mga pasyenteng immunosuppressed; 3) suriin ang pagiging epektibo ng antiviral therapy; 4) tuklasin ang viremia sa mga donor ng dugo na may normal na antas ng aminotransferase; 5) matukoy ang posibleng kontaminasyon ng mga produkto ng dugo; 6) tasahin ang pagkalat ng HCV.

9. aplikasyon ng PCR sa pulmonology at phthisiology

Ang isang karaniwang sanhi ng atypical pneumonia at paulit-ulit na talamak na brongkitis ay mycoplasmas at chlamydia. Ang pag-diagnose ng mga pathogen na ito gamit ang mga tradisyonal na pamamaraan ng microscopy at bacterial culture ay hindi epektibo. Ang PCR ay nagbibigay-daan hindi lamang upang masuri ang chlamydia at mycoplasmosis, kundi pati na rin upang isakatuparan ang pagkakakilanlan ng mga species ng pathogen (C. pneumoniae, C. trachomatis, M. hominis, M. pneumoniae). Ang paggamit ng paraan ng PCR ay maaaring makabuluhang mapabuti ang maagang pagsusuri ng tuberculosis. Sa kasalukuyan, ang mga PCR kit ay binuo at lumitaw sa merkado upang matukoy ang paglaban ng mycobacteria sa antibiotics.

10. Paglalapat ng PCR sa pagsasanay sa serbisyo ng dugo

Ang pagsusuri sa dugo ng donor para sa hepatitis, syphilis, HIV sa pamamagitan ng mga serological na pamamaraan ay hindi nagbubukod sa panganib ng paggamit ng nahawaang dugo dahil sa pagkakaroon ng isang tiyak na seronegative na panahon para sa mga sakit na ito, na maaaring umabot ng ilang linggo mula sa sandaling lumitaw ang pathogen sa dugo. Ang pinaka-epektibong paraan ng pagsusuri ng dugo para sa pagkakaroon ng mga pathogen na ito ay ang PCR method.

11. aplikasyon ng PCR sa neonatology

Ang isang bilang ng mga microorganism ay maaaring makahawa sa fetus sa panahon ng pagbubuntis. Ito ay cytomegalovirus, toxoplasma, herpes virus, rubella virus, mycoplasma, chlamydia, atbp. Ang paggamit ng serological tests upang matukoy ang mga impeksyong ito sa mga bagong silang ay hindi epektibo, dahil ang pagbuo ng immune system ng bata ay nangyayari sa loob ng ilang buwan, at ang pagkakaroon ng isang Ang nakakahawang ahente ay maaaring hindi sinamahan ng paggawa ng mga tiyak na antibodies. Sa kabilang banda, ang maternal antibodies ng klase ng IgG ay maaaring naroroon sa dugo ng isang bagong panganak sa loob ng mahabang panahon, na may kakayahang tumagos sa placental barrier. Kaya, ang pagkakaroon ng tiyak na IgG sa isang bata sa mga unang buwan ng buhay ay hindi nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng isang pathogen. Ang paggamit ng pagsusuri ng PCR ay makabuluhang pinatataas ang mga posibilidad ng pag-diagnose ng mga impeksyon sa neonatal, kabilang ang sa yugto ng intrauterine.

12. aplikasyon ng PCR sa urogynecological practice

Kabilang sa mga nakakahawang ahente na nakakaapekto sa urogenital tract, maraming pansin ang kamakailang binayaran sa mga sanhi ng mga ahente ng latent at talamak na impeksyon - chlamydia at mycoplasma. Ang mga sakit na dulot ng mga pathogen na ito ay nailalarawan sa pamamagitan ng malabong mga klinikal na sintomas at isang talamak na kurso, na kadalasang humahantong sa pinsala sa mga function ng reproductive - pagkakuha, kawalan ng katabaan. Maraming mga pag-aaral na sumusuri sa paggamit ng paraan ng PCR para sa pagtuklas ng Chlamydiatrachomatis, Mycoplasmahominis, Mycoplasmagenitalium, Ureaplasmaurealiticum, na isinagawa sa malalaking klinika sa iba't ibang bansa, ay nagpakita ng mataas na kahusayan ng pamamaraang ito. Kinikilala na sa mga tuntunin ng sensitivity at kahusayan, ang PCR ay higit na mataas sa pamamaraan ng kultura, na tinatanggap bilang "pamantayan ng ginto".

KONGKLUSYON

Kaya, ang teknolohiya ng PCR ay isang makapangyarihang tool na nagbibigay ng kakayahang pag-aralan at masuri ang mga talamak na nakakahawang proseso at ang ekolohiya ng mga pathogen ng mga nakakahawang sakit. Ang pamamaraan ng diagnostic ng PCR ay umaakma sa mga umiiral nang pamamaraan ng microbiological diagnostics at may husay na pagbabago sa pamamaraan para sa paglutas ng mga inilapat na problema ng medikal na microbiology at epidemiology.

Isinasaalang-alang ang nasa itaas, bubuo kami ng mga lugar ng pananaliksik sa nakakahawang patolohiya, kung saan ang PCR ay nagsisimulang maglaro ng isang nangungunang papel.

Diagnosis ng mga talamak na nakakahawang kondisyon na dulot ng pagtitiyaga ng bakterya o mga virus. Ito ang pinaka-halatang aplikasyon ng PCR para sa mga layuning diagnostic.

Ang PCR ay ang pinaka-epektibong paraan para sa pagtukoy at pag-aaral ng mga pathogen na, na nasa isang "hindi nalilinang" na estado, ay maaaring magpatuloy doon, na nakaligtas sa hindi kanais-nais na mga panlabas na kondisyon.

Pinapayagan ng PCR ang pagtukoy ng resistensya sa antibiotic sa mabagal na paglaki at mahirap na linangin na bakterya.

Ang mga promising na lugar para sa praktikal na paggamit ng PCR diagnostics ay:

· pagsusuri ng mga sakit na oncological;

· diagnosis ng leukemia at lymphoma;

· diagnosis ng kanser sa suso;

· pagsusuri ng iba pang mga malignant na sakit;

Ang mga diagnostic ng DNA ng mga benign at malignant na neoplasma ay limitado ng maliit ngunit lumalaking dami ng impormasyon tungkol sa mga gene na nauugnay sa mga sakit na ito;

· pagsusuri ng mga genetic na sakit.

Ang diagnosis ng mga genetic na sakit ay maaari lamang bumuo kasunod ng malawak na siyentipikong pananaliksik sa genome ng tao. Gayunpaman, kinikilala na ng medikal na komunidad ang kahalagahan ng pag-aaral ng genetic na batayan ng mga sakit, pati na rin ang posibilidad ng pag-diagnose at paggamot ng isang sakit bago lumitaw ang mga sintomas nito;

· personal na pagkakakilanlan: forensic medicine, kriminolohiya; paglipat ng organ at tissue; pagpapasiya ng pagiging ama. Tinatasa ng mga eksperto ang lugar na ito ng merkado ng diagnostic ng DNA bilang isa sa pinakamalaki at pinakamabilis na paglaki;

Madalas na ginagamit bilang isang mabilis na paraan para sa indikasyon at pagkakakilanlan ng mga virus.

Ang pamamaraang ito ay unang binuo ni K. Mullis (USA) noong 1983. Dahil sa mataas na sensitivity, specificity at kadalian ng pagpapatupad nito, malawak itong ginagamit sa genetics, forensic medicine, diagnostics at iba pang larangan.

Ang kakanyahan ng pamamaraan ay amplification, i.e. pagtaas ng bilang ng mga kopya ng mahigpit na tinukoy na mga fragment ng isang molekula ng DNA sa vitro. Ang pamamaraang ito ay gumagamit ng mekanismo ng matrix at ang prinsipyo ng complementarity. Dalawang solong polynucleotide chain (nucleic acids) ay may kakayahang pag-ugnayin ng hydrogen bonds sa isang double-stranded chain kung ang mga nucleotide sequence ng isa ay eksaktong tumutugma sa nucleotide sequence ng isa upang ang kanilang mga nitrogenous base ay maaaring bumuo ng adenine-thymine at guanine-cytosine magkapares.

Ang PCR ay batay sa DNA amplification gamit ang isang thermostable DNA polymerase, na nag-synthesize ng mutually complementary DNA strands, na nagsisimula sa dalawang primer. Ang panimulang aklat ay isang fragment ng DNA na binubuo ng 20-30 nucleotides. Ang mga panimulang aklat na ito ay pantulong sa kabaligtaran na mga hibla ng DNA. Sa panahon ng DNA synthesis, ang mga primer ay ipinapasok sa kadena ng mga bagong synthesize na molekula ng DNA.

Karaniwan ang PCR ay ginagawa sa 25-40 cycle. Ang bawat cycle ay may kasamang tatlong yugto: ang una ay denaturation sa 92-95 °C. Sa kasong ito, ang dalawang DNA strands ay naghihiwalay; ang pangalawa ay pagsusubo, o pagdaragdag ng mga panimulang aklat sa 50-65 ° C; ang pangatlo ay ang pagpahaba, o polimerisasyon sa 68-72 ° C, habang ang DNA polymerase ay nagsasagawa ng komplementaryong pagkumpleto ng mga chain ng template ng DNA gamit ang apat na uri ng nucleotides. Bilang resulta ng isang cycle, nadoble ang nais na genetic material. Ang mga chain ng DNA na nabuo sa unang cycle ay nagsisilbing template para sa pangalawang cycle, atbp. Pagkatapos ng unang cycle, tanging ang fragment sa pagitan ng dalawang primer ang pinalaki. Kaya, ang bilang ng mga kopya ng amplified na rehiyon ay nadoble, na ginagawang posible na mag-synthesize ng milyun-milyong (2 n) mga fragment ng DNA sa 25-40 cycle - isang halaga na sapat para sa kanilang indikasyon sa pamamagitan ng iba't ibang mga pamamaraan (ang paraan ng hybridization probes na naglalaman ng isang tiyak label, electrophoresis, atbp.) . Mas madalas, ang agarose gel electrophoresis na may ethidium bromide staining ay ginagamit para sa layuning ito.

Sa PCR mula sa mga seksyon ng DNA ng isang pathogen, ang mga panimulang aklat ay ginagamit na may natatanging pagkakasunud-sunod ng mga nucleotide na katangian lamang ng isang partikular na pathogen.

Ang pamamaraan para sa pagsasagawa ng PCR ay bumababa sa mga sumusunod: isang DNA matrix ay nakahiwalay sa materyal na pinag-aaralan; sa isang test tube, ang nakahiwalay na DNA ay pinagsama sa isang amplification mixture, na kinabibilangan ng DNA polymerase, lahat ng 4 na uri ng nucleotides, 2 uri ng mga primer, MgCl, buffer, deionized na tubig at mineral na langis. Pagkatapos ang mga tubo ay inilalagay sa isang cycler, at awtomatikong isinasagawa ang amplification ayon sa isang naibigay na programa na naaayon sa uri ng pathogen. Ang mga resulta ay mas madalas na naitala sa pamamagitan ng electrophoresis sa isang 1-2% agarose gel sa pagkakaroon ng ethidium bromide, na pinagsama sa mga fragment ng DNA at ipinahayag sa anyo ng mga makinang na banda kapag ang gel ay na-irradiated ng UV rays sa isang transilluminator. Ang lahat ng mga pamamaraan ng PCR ay tumatagal ng 1-2 araw ng negosyo.

Upang mapataas ang pagtitiyak at pagiging sensitibo ng PCR, ginagamit ang iba't ibang opsyon: nested PCR; Ang PCR na may "mainit na pagsisimula" gamit ang isang paraffin layer o pagharang sa mga aktibong sentro ng polymerase na may monoclonal antibodies. Bilang karagdagan, ang ilang mga kumpanya ay gumagawa ng lyophilized reagent kit para sa DNA amplification, na nagpapabilis sa proseso ng PCR at nagpapababa ng posibilidad ng mga false-positive na resulta.

Ang isang bagong teknolohiya, ang Real-Time PCR, ay kasalukuyang ipinakilala. Ang pangunahing tampok nito ay ang pagsubaybay at quantitative analysis ng akumulasyon ng polymerase chain reaction na mga produkto at awtomatikong pagpaparehistro at interpretasyon ng mga resultang nakuha. Ang pamamaraang ito ay hindi nangangailangan ng isang hakbang ng electrophoresis, na binabawasan ang mga kinakailangan sa laboratoryo para sa PCR. Ang real-time na PCR ay gumagamit ng fluorescently labeled oligonucleotide probes upang makita ang DNA habang ito ay pinalakas. Ang real-time na PCR ay nagbibigay-daan para sa kumpletong pagsusuri ng isang sample sa loob ng 20-60 minuto at ito ay theoretically isang paraan upang makita ang kahit isang DNA o RNA molecule sa isang sample.

Ang sistema ng pagtuklas ng produkto sa real-time na polymerase chain reaction (PCR monitoring) ay nagbibigay-daan sa iyo na subaybayan ang akumulasyon ng amplified DNA cycle sa pamamagitan ng cycle. Kasama rin sa system ang isang oligonucleotide probe na may kakayahang mag-attach (hybridizing) sa panloob na segment ng target na DNA. Ang probe ay may label sa 5′ dulo na may fluorescent reporter dye, at sa 3′ end ay may blocker dye (quencher dye). Habang nag-iipon ang produkto ng PCR, nag-hybrid ang probe dito, ngunit walang luminescence na nangyayari dahil sa kalapitan sa pagitan ng reporter at ng blocker. Bilang resulta ng pagkopya ng pagkakasunud-sunod, ang polymerase ay umabot sa 5′ dulo ng probe. Ang 5'-3' exonuclease na aktibidad ng polymerase ay nagtatanggal ng fluorescent na tag mula sa 3' na dulo ng probe, sa gayon ay nagpapalaya sa fluorescent reporter mula sa koneksyon nito sa signal blocker, na humahantong sa pagtaas ng fluorescence. Ang antas ng fluorescence ay proporsyonal sa dami ng tiyak na produkto ng reaksyon. Mahalaga na ang mga resulta ng PCR ay naitala sa pamamagitan ng pagkakaroon ng fluorescence sa mga saradong tubo at, sa gayon, ang isa sa mga pangunahing problema ng pamamaraang ito ay nalutas - ang problema ng kontaminasyon sa mga amplicon.

Mga kalamangan ng PCR: bilis ng pagsusuri; mataas na sensitivity at pagtitiyak; pinakamababang halaga ng materyal sa pagsubok; pagiging simple ng pagpapatupad at ang posibilidad ng buong automation.

Dahil sa katotohanan na ang sensitivity ng PCR ay maaaring umabot hanggang sa pagtuklas ng isang kopya ng template ng DNA, mayroong mataas na antas ng panganib na makakuha ng mga maling positibong resulta. Samakatuwid, kapag nagsasagawa ng pagsusuri sa PCR, ang isang genetic diagnostic laboratory ay dapat na mahigpit na sumunod sa mga espesyal na kinakailangan para sa layout at operating mode.

Ang PCR ay isa sa mga pantulong na pamamaraan na umiiral sa virological diagnostics. Napakahalaga ng reaksyong ito para sa pagsusuri ng mga impeksyon sa viral kapag ang mga viral antigen o mga antibodies na partikular sa virus ay hindi matukoy at kapag ang pagkakaroon ng viral nucleic acid ay maaaring ang tanging katibayan ng impeksyon, lalo na sa mga tago at halo-halong impeksyon.

Kung makakita ka ng error, mangyaring i-highlight ang isang piraso ng teksto at i-click Ctrl+Enter.

Ang polymerase chain reaction ay kilala sa loob ng 30 taon. Ito ay malawakang ginagamit sa maraming larangan, mula sa arkeolohiya hanggang sa genetika.

Ito ay ang paraan ng PCR na tumutulong sa pagtatatag ng paternity, ngunit ito ay kadalasang ginagamit upang makilala ang iba't ibang mga nakakahawang sakit sa katawan ng tao.

Paano isinasagawa ang pagsusuri ng PCR, at ano ito? Susubukan naming sagutin ang mga tanong na ito nang detalyado.

Pagsusuri ng PCR - ano ito?

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay isang high-precision na paraan ng molecular genetic diagnostics na nagbibigay-daan sa iyo upang matukoy ang iba't ibang mga nakakahawang at namamana na sakit sa mga tao, kapwa sa talamak at talamak na yugto, at bago pa man mahayag ang sakit.

Ang paraan ng PCR ay ganap na tiyak at, kung ginawa nang tama, ay hindi makapagbibigay ng maling positibong resulta. Iyon ay, kung walang impeksyon, kung gayon ang pagsusuri ay hindi magpapakita na ito ay umiiral. Samakatuwid, ngayon napakadalas, upang kumpirmahin ang diagnosis, sila din ay kumuha ng PCR test upang matukoy ang pathogen at ang kalikasan nito.

Ang polymerase chain reaction (PCR) ay binuo ni Kary Mullis (USA) noong 1983, kung saan siya ay ginawaran ng Nobel Prize sa Chemistry noong 1993.

Ano ang bentahe ng pamamaraang ito?

Ang mga diagnostic sa pamamagitan ng pamamaraang ito ay nagpapahintulot sa iyo na mahanap ang pathogen nang direkta sa gene, na nakapaloob sa mga materyales na pinag-aaralan. Ito ang pinakatumpak na pagsusuri para sa mga impeksiyon na nakukuha sa pakikipagtalik, mga nakatagong impeksiyon, at iba't ibang sakit na nakukuha sa pakikipagtalik.

Mga pagkakaiba sa pagitan ng mga diagnostic ng PCR at iba pang mga pamamaraan ng pananaliksik sa laboratoryo ay ang mga sumusunod:

• ang pamamaraan ay naglalayong makilala ang pathogen mismo;
• Ang mga diagnostic gamit ang paraan ng PCR ay nakikilala sa pamamagitan ng kakayahang magamit nito: para sa pag-detect ng ilang mga pathogens;
• sakit, isang biological sample lamang ng pasyente ang sapat;
• ang pamamaraan ay lubos na sensitibo at hindi sinamahan ng iba pang mga cross-reaksyon.

Bilang karagdagan, ang bentahe ng mga diagnostic ng PCR ay ang anumang biological na materyal ng pasyente ay angkop para sa pagsusuri: dugo, genital secretions, ihi, tabod.

Anong mga impeksyon ang maaaring makita ng PCR smear?

Ang isang malaking bilang ng mga nakakahawang ahente ay maaaring naroroon sa katawan, kabilang ang mga "nakatago" na hindi nagpapakita ng kanilang sarili sa loob ng mahabang panahon.

Pagsusuri ng PCR smear nagbibigay-daan sa iyo na makita ang mga naturang impeksyon:

• ureplasmosis ng mga genital organ;
• candidiasis();
• buni;
• pagkakaroon ng mga selula ng kanser;
• pagtatasa ng hormonal status;

Ang test material para sa PCR ay karaniwang plema, laway, ihi, at dugo. Bago isagawa ang pagsusuri, dapat mong maingat na maghanda para dito sa pamamagitan ng unang pagkonsulta sa isang doktor.

Ang dugo para sa PCR ay karaniwang ibinibigay kapag walang laman ang tiyan. Ang mga magagandang resulta ay ipinapakita sa pamamagitan ng pagsusuri kapag ang materyal para sa pananaliksik ay kinuha mula sa cervical canal o urethra. Sa kasong ito, pinakamahusay na magsagawa ng mga diagnostic ng PCR nang hindi lalampas sa isang araw pagkatapos ng pakikipagtalik.

Mga uri ng PCR

Ginagamit ang PCR sa maraming lugar para sa pagsubok at siyentipikong mga eksperimento. Mayroong iba't ibang mga pamamaraan ng pagsusuri:

1. Baliktarin ang transcription PCR(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - ginagamit upang palakihin, ihiwalay o kilalanin ang isang kilalang sequence mula sa isang RNA library.
2. Baliktad na PCR(Inverse PCR) - ginagamit kapag maliit na rehiyon lamang sa loob ng gustong pagkakasunod-sunod ang nalalaman. Ang pamamaraang ito ay partikular na kapaki-pakinabang pagdating sa pagtukoy ng mga kalapit na pagkakasunud-sunod pagkatapos maipasok ang DNA sa genome.
3. Ginagamit ang nested PCR upang bawasan ang bilang ng mga byproduct ng reaksyon. Dalawang pares ng panimulang aklat ang ginagamit at dalawang sunud-sunod na reaksyon ang isinasagawa.
4. Asymmetric PCR(eng. Asymmetric PCR) - ay isinasagawa kapag kinakailangan upang palakihin ang isa sa mga hibla ng orihinal na DNA. Ginagamit sa ilang sequencing at hybridization analysis techniques.
5. Dami ng PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (English)) o real-time PCR - ginagamit upang direktang subaybayan ang pagsukat ng dami ng isang partikular na produkto ng PCR sa bawat ikot ng reaksyon.
6. Step-by-step na PCR (Touchdown PCR) - gamit ang diskarteng ito, nababawasan ang impluwensya ng non-specific na primer binding.
7. PCR na partikular sa grupo(eng. group-specific PCR) - PCR para sa mga magkakaugnay na sequence sa loob ng pareho o sa pagitan ng iba't ibang species, gamit ang mga konserbatibong primer para sa mga sequence na ito.

Kung ang pagkakasunud-sunod ng nucleotide ng template ay bahagyang kilala o hindi alam sa lahat, maaaring gamitin ang mga degenerate na primer, na ang pagkakasunud-sunod ay naglalaman ng mga degenerate na posisyon kung saan maaaring matatagpuan ang anumang base. Halimbawa, ang primer sequence ay maaaring: ...ATH..., kung saan ang H ay A, T o C.

Anong mga biological na materyales ang pinag-aaralan?

Ang iba't ibang biological media at mga likido ng tao ay maaaring magsilbing materyal para sa pananaliksik sa PCR, kung saan maaaring matukoy ang dayuhang bacterial DNA o viral DNA o RNA:

1. Ihi. Maaaring gamitin para sa mga impeksyon ng genitourinary tract sa mga lalaki at mga organo ng ihi sa mga kababaihan (sa mga lalaki, ang paggamit ng ihi bilang isang materyal ay pumapalit sa epithelial scraping).
2. plema. Ito ay ginagamit upang masuri ang tuberculosis at, hindi gaanong karaniwan, upang masuri ang mga respiratory form ng chlamydia at mycoplasmosis. Ang plema sa halagang 15-20 ML ay nakolekta sa isang sterile (disposable) na bote.
3. Mga biyolohikal na likido. Ang prostate juice, pleural, spinal, amniotic fluid, joint fluid, bronchoalveolar lavage, laway ay kinokolekta ayon sa mga indikasyon.
4. Epithelial scrapings mula sa mauhog lamad. Karaniwang ginagamit sa pag-diagnose ng mga sexually transmitted disease (STDs), tulad ng gonorrhea, chlamydia, mycoplasmosis, ureaplasmosis, trichomoniasis, gardnerellosis, herpes at iba pang mga impeksyon na nakakaapekto sa mucous membrane.
5. Mga biopsy. Kadalasan, ang mga biopsy ng tiyan at duodenum ay ginagamit upang makita ang impeksyon ng Helicobacter pylori.
6. Dugo, plasma, suwero. Ginagamit para sa pagsusuri ng PCR ng hepatitis B, C, D, G, herpes, CMV, HIV virus, at pananaliksik ng mga gene ng tao.

Paano maghanda para sa pagsusulit?

Ang pagiging maaasahan ng resulta ng PCR ay direktang nakasalalay sa tamang pagsusumite ng materyal para sa pagsusuri. Ang materyal ay hindi dapat kontaminado, kung hindi, ang resulta ng pag-aaral ay hindi magiging layunin. Ang pinakamahalagang rekomendasyon bago kumuha ng PCR test ay kinabibilangan ng mga sumusunod na kinakailangan:

1. Kinokolekta ang ihi sa umaga sa isang sterile na lalagyan.
2. Ang isang pagsusuri sa dugo para sa mga impeksyon ay dapat kunin nang walang laman ang tiyan sa umaga.
3. Hindi ka dapat maging aktibo sa pakikipagtalik sa araw bago ang pagsusulit.

Ang resulta ng pagsusuri ay magiging handa 1.5-2 araw pagkatapos ng pamamaraan na pinag-uusapan. May mga sitwasyon kung kailan maaaring ihanda ang resulta sa parehong araw.

Pag-decode ng pagsusuri sa OPC

Ang proseso ng pagbibigay-kahulugan sa ipinakita na pananaliksik ay nakikilala sa pamamagitan ng pagiging simple nito. Ang mga resulta ng pagsusuri ng PCR ay maaaring makuha 1.5-2 araw pagkatapos isumite ang materyal. Sa ilang mga kaso, ang resulta ay handa na sa unang araw, at narito ang maaaring sabihin ng mga ito:

• Negatibong resulta ay nagpapakita na ang diagnostic na materyal ay hindi naglalaman ng nais na nakakahawang ahente.
• Positibo sa PCR nangangahulugan na ang DNA o RNA ng pathogen ay naroroon sa katawan ng tao.

Sa ilang mga kaso, ang mga microorganism ay binibilang. Ito ay totoo lalo na para sa mga sakit na dulot ng mga oportunistikong mikroorganismo. Dahil ang mga bakteryang ito ay nagpapakita ng kanilang mga negatibong epekto lamang sa labis na dami.

Gayundin, mahalaga ang quantitative PCR analysis para sa pagpili ng mga therapeutic tactics at para sa layunin ng pagsubaybay sa paggamot ng mga viral infection tulad ng HIV at hepatitis virus.

Gaano katumpak ang pagsusuri sa PCR ng mga impeksyon?

Ang pamamaraan ng PCR ay nailalarawan sa pamamagitan ng mataas na katumpakan, pagtitiyak at pagiging sensitibo. Nangangahulugan ito na ang pagsusuring ito ay may kakayahang:

• tumpak na matukoy ang pagkakaroon o kawalan ng impeksiyon;
• ipahiwatig kung anong uri ng impeksiyon ito (katiyakan);
• tuklasin ang impeksyon kahit na may napakababang nilalaman ng microbial DNA sa biological na materyal,
• na nasubok (sensitivity).

Pagsusuri ng PCR: presyo at timing

Ang presyo ng isang partikular na pagsusuri ay depende sa kung anong impeksyon ang susuriin mo. Tinatayang mga presyo at tuntunin:

1. STI: 300-500 rubles, mga tuntunin - 1 araw;
2. Epstein-Barr virus, human papillomavirus, herpes, cytomegalovirus: 300-500 rubles, mga tuntunin - 1 araw;
3. Hepatitis A, B, C, D, G: pagsusuri ng husay 650 rubles, pagsusuri ng dami 2000 rubles. Mga tuntunin - hanggang sa 5 araw;
4. Antibodies sa hepatitis C virus, kabuuang (Anti-HCV) - 420 rubles;
5. Antibodies sa hepatitis C virus, IgM (Anti-HCV IgM) - 420 rubles;
6. Helicobacter pylori: 300-400 rubles, mga tuntunin - 1 araw;
7. HIV (antibodies at antigens) - 380 rubles;
8. HIV RNA, mataas na kalidad - 3,500 rubles;
9. HIV RNA, sa dami - 11,000 rubles.

Upang makatipid ng pera, maaari kang pumili ng isang nakapirming pakete ng pagsusuri. Ang serbisyong ito ay ibinibigay ng karamihan sa mga klinika kung saan maaari kang magpasuri gamit ang pamamaraan ng PRC (invitro, onclinic, atbp.).

Ang pagsasagawa ng PCR analysis (PCR diagnostics) ay nagsisimula sa pagkolekta ng materyal para sa pagsusuri ng isang gynecologist, urologist o dermatovenerologist. Ang kalidad at pagiging maaasahan ng mga kasunod na nakuha na mga resulta ay sinisiguro ng pinakamataas na kwalipikasyon at malawak na karanasan ng mga doktor ng sentrong medikal ng Euromedprestige, na sumusunod sa lahat ng kinakailangang tuntunin para sa pagsasagawa ng pagsusuri ng PCR: kumpletong sterility, paggamit ng mga disposable na materyales lamang.

Ang nakolektang materyal mula sa brush ay inilalagay sa isang lalagyan na may solusyon sa asin. Pagkatapos ng koleksyon, ang mga sample ay dapat maihatid sa laboratoryo ng PCR sa lalong madaling panahon.

Ang pagsusuri sa PCR ay isinasagawa sa laboratoryo sa tatlong yugto:

1. Pagkuha ng DNA
2. Pagpapalakas ng mga fragment ng DNA
3. Pagtuklas ng mga produkto ng DNA amplification

Ang pagkuha ng DNA ay ang paunang yugto ng mga diagnostic ng PCR, ang kakanyahan nito ay ang mga sumusunod: ang doktor ay kumukuha ng materyal para sa pananaliksik mula sa pasyente at isasailalim ito sa espesyal na pagproseso. Sa panahon ng pagproseso, ang DNA double helix ay nahahati sa mga indibidwal na hibla. Ang isang espesyal na likido ay idinagdag sa materyal ng pasyente, na natutunaw ang mga organikong sangkap na nakakasagabal sa "kadalisayan" ng reaksyon. Inaalis nito ang mga lipid, amino acid, peptides, carbohydrates, protina at polysaccharides. Bilang resulta, nabuo ang DNA o RNA.

Ang prinsipyo ng paraan ng PCR ay ang "pagbuo" ng mga bagong impeksyon sa DNA o RNA. Hindi ito magagawa nang hindi inaalis ang cellular na materyal.

Ang dami ng oras na ginugol sa pagkuha ng DNA ay nakasalalay sa sanhi ng impeksyon at sa uri ng materyal na ginamit para sa pananaliksik sa PCR. Halimbawa, tumatagal ng 1.5-2 oras upang ihanda ang dugo para sa susunod na yugto.

0Array ( => Mga Pagsusuri) Array ( => 2) Array ( =>.html) 2

Pagpapalakas ng DNA

Upang maisagawa ang susunod na yugto ng mga diagnostic ng DNA - pagpapalakas ng DNA - ginagamit ng mga doktor ang tinatawag na mga DNA matrice - mga molekula ng DNA ng mga impeksyon, kung saan ang "pag-clone" ng DNA ay kasunod na magaganap. Nabanggit na na ang pagkakaroon ng kumpletong DNA ng impeksyon ay hindi kinakailangan; upang maisagawa ang yugtong ito, ang isang maliit na piraso ng molekula ng DNA, na katangian lamang ng isang naibigay na mikrobyo (impeksyon), ay sapat.

Ang batayan ng pagpapalakas ng DNA at, nang naaayon, ang batayan ng buong prinsipyo ng reaksyon ng PCR ay ang natural na proseso ng pagkumpleto ng DNA para sa lahat ng nabubuhay na bagay - pagtitiklop ng DNA, na isinasagawa sa pamamagitan ng pagdodoble ng isang solong DNA chain.

Simula sa isang solong fragment ng DNA, kinokopya ito ng doktor sa laboratoryo at pinapataas ang bilang ng mga kopya sa isang chain reaction mode: pagkatapos ng unang cycle mayroon ka nang 2 fragment, pagkatapos ng pangalawang cycle - 4, pagkatapos ng pangatlo - 8, pagkatapos ng pang-apat - 16, pagkatapos ay 32 , 64, 128, 256... Sa bawat cycle ay dumodoble ang bilang ng mga kopya, at pagkatapos ng dalawampung cycle ang bilang ay napupunta na sa milyon-milyon, at pagkatapos ng tatlumpu - sa bilyun-bilyon. Ang cycle ay tumatagal ng ilang minuto at bumubuhos sa isang tiyak na pagbabago sa temperatura sa isang napakaliit na chemical reactor. Dito, sa solusyon, ang lahat ng mga kinakailangang bahagi ng synthesis ay naroroon sa sapat na dami, una sa lahat, ang mga nucleotides A, G, T at C, at din ang mga maselan na operasyong kemikal sa paghahanda ay isinasagawa upang ang isang eksaktong kopya ay agad na kinuha mula sa bawat isa. tapos na ang DNA segment, pagkatapos ay mula sa kopyang ito - muli isang kopya, ito ang branched chain reaction.

Sa pamamagitan ng paglakip ng mga primer sa DNA chain—artipisyal na synthesize na "mga piraso" ng DNA (mga pares ng nucleotide) na katulad ng DNA ng mga mikrobyo (mga impeksyon) - dalawang maikling helice na binubuo ng dalawang hibla ng mga seksyon ng DNA ay nabuo, na kinakailangan para sa synthesis ng hinaharap DNA.

Ang synthesis ng isang bagong chain ay nangyayari sa pamamagitan ng pagkumpleto ng bawat isa sa dalawang DNA strands. Ang proseso ng amplification ay nangyayari sa tulong ng isang tiyak na rehiyon - DNA polymerase, na nagbibigay ng pangalan sa pamamaraan ng laboratoryo. Ang polymerase ay gumaganap bilang isang katalista para sa reaksyon at sinusubaybayan ang sunud-sunod na pagkakabit ng mga base ng nucleotide sa lumalaking bagong DNA strand.

Kaya, ang DNA amplification ay isang maramihang pagtaas sa bilang ng mga kopya ng DNA na tiyak, ibig sabihin, likas lamang sa isang partikular na organismo. Hindi na kailangang kumpletuhin ang buong DNA chain para makita ang nakakahawang ahente. Ang lugar lamang na katangian ng isang partikular na bacterium bilang indibidwal ang kailangan.

5360 kuskusin. Gastos ng isang komprehensibong programa na may gastroenterologist

DISCOUNT 25% SA ISANG APPOINTMENT SA ISANG CARDIOLOGIST

- 25%pangunahin
Pagbisita ng doktor
therapist sa katapusan ng linggo

RUB 5,160 sa halip na 5,420 kuskusin. Pagsusuri sa mga lalaki para sa mga impeksyon sa urolohiya

ALERGOLOHIYA RUB 5,120 sa halip na 5,590 kuskusin.

Ang lahat ng mga paulit-ulit na hakbang sa amplification ay nangyayari sa iba't ibang temperatura. Upang magsagawa ng pagsusuri sa PCR, ginagamit ang mga espesyal na naka-program na kagamitan - PCR - thermostat o amplifier, na awtomatikong nagbabago ng temperatura. Isinasagawa ang amplification ayon sa isang ibinigay na programa na naaayon sa uri ng impeksyon na natukoy. Depende sa programa at uri ng impeksyon na natukoy, ang automated na proseso ng PCR ay tumatagal mula 2 hanggang 3 oras.

Ang mga kwalipikasyon ng doktor sa laboratoryo na nagsasagawa ng pagsusuri ay may mahalagang papel sa mga diagnostic ng PCR; ang tamang mga setting ng kagamitan sa PCR at ang interpretasyon ng mga resulta ay nakasalalay sa kanya. Ang mga doktor sa Euromedprestige Medical Center ay may malawak na karanasan sa pagsasagawa ng mga diagnostic ng DNA, na tinitiyak ang pagiging maaasahan ng mga resulta ng pananaliksik at ginagarantiyahan ang positibong tagumpay sa paggamot ng mga nakakahawang sakit. Upang kumuha ng mga pagsusuri sa PCR at magsagawa ng buong pagsusuri at paggamot ng mga nakakahawang sakit sa aming sentrong medikal ng Euromedprestige.

Sa panahon ng pagtuklas ng mga produkto ng amplification, ang nagresultang timpla ng mga produkto ng amplification ay pinaghihiwalay. Ang mga espesyal na solusyon ay idinagdag sa pinaghalong, na nagbibigay sa mga fragment ng DNA ng kakayahang mag-fluoresce - na makikita sa orange-red luminous stripes. Ang resultang glow ay nagpapahiwatig ng pagkakaroon ng DNA ng mga virus, microbes o bacteria sa materyal na kinuha mula sa pasyente para sa pagsusuri ng PCR.